PCR在轉(zhuǎn)基因中的應用

1、PCR技術在轉(zhuǎn)基因食品中的應用（石河子大學食品學院 農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏專業(yè)，李珍新疆石河子832000）摘要：轉(zhuǎn)基因食品近年來，已經(jīng)成為公眾爭論的焦點。本文概述了轉(zhuǎn)基因食品國內(nèi)外發(fā)展現(xiàn) 狀及在轉(zhuǎn)基因食品安全性基礎上，提出了其檢測方法P3R技術，并重點介紹了 PCR技術在 轉(zhuǎn)基因食品檢測上的應用及發(fā)展趨勢。 關鍵詞：PCR；轉(zhuǎn)基因食品；食品檢測PCR Technology In Genetically Modified FoodAbstract:Genetically modified foods in recent years has become the focus of public deb

2、ate.This article summarizes the current situation and the development of the genetically modified foods in domestic and foreign on the basis of safety,Introduce the detection method-PCR technology, And focus on the application of PCR technology and development trends in the detection of genetically

3、modified foods.Key words:PCR; Genetically Modified Food;Food Testing隨著我國食品科學技術的發(fā)展及現(xiàn)實的需要，食品檢測和分析也在不斷進步，特別是面對 迅猛發(fā)展的轉(zhuǎn)基因食品，安全問題逐漸被人們所重視，轉(zhuǎn)基因食品是否安全，轉(zhuǎn)基因食品標 識制度能否被嚴格執(zhí)行，關鍵在于是否有準確，可靠的檢測技術作保障。PCR技術是1985 年誕生的一項DNA體外擴增技術，該技術自問世以來就備受食品科學領域的青睞，在食品轉(zhuǎn) 基因成分檢測方面具有很大的潛在價值。PCR技術又稱基因擴增技術，是聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction

4、）的縮寫， 該技術在轉(zhuǎn)基因食品檢測的應用過程中表現(xiàn)出靈敏度高、速度快、特異性強、簡便、高效等 特點，是轉(zhuǎn)基因食品檢測的重要手段之一 1。1 PCR技術基本原理類似于DNA的天然復制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR由 變性一退火一延伸三個基本反應步驟構成。模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93C左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴 增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應作準備。模板DNA與引物的退火（復性）：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55 C左右，引 物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合。引物的延伸：DNA模板一引物結合

5、物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應原料， 靶序列為模板，按堿基配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留 復制鏈重復循環(huán)變性一退火一延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復制鏈”而且這種新 鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個循環(huán)需24分鐘，23小時就能將待擴目的基因 擴增放大幾百萬倍。到達平臺期所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝。2轉(zhuǎn)基因食品國內(nèi)外的發(fā)展現(xiàn)狀轉(zhuǎn)基因食品始于20世紀70年代初，美國開展轉(zhuǎn)基因食品方面的研究最早,但是美國國內(nèi) 的轉(zhuǎn)基因食品的消費是禁止的。就種植面積而言，轉(zhuǎn)基因作物排序為大豆、玉米、棉花、油 菜、馬鈴薯。我國的轉(zhuǎn)基因食品的研究和開發(fā)居世界

6、中等水平，在大田試驗和商品化方面 僅次于美國和加拿大。1999年3月，中國水稻研究所研制的屬世界首創(chuàng)的“轉(zhuǎn)基因雜交稻” 研究成果通過專家鑒定,9月華中農(nóng)業(yè)大學的一項轉(zhuǎn)基因水稻通過鑒定，并且達到國際先進 水平。轉(zhuǎn)基因動物研究方面，我國在魚/兔、雞、羊等方面取得了突破性的進展。目前，轉(zhuǎn) 基因動物商品化未見報道4。轉(zhuǎn)基因動物的安全評價方案國內(nèi)外已經(jīng)有了研究報道。相對美國對轉(zhuǎn)基因的態(tài)度，歐盟對轉(zhuǎn)基因食品的態(tài)度相對保守。歐盟允許種植的轉(zhuǎn)基因 作物只有大豆、玉米和油菜等，種植面積僅占世界轉(zhuǎn)基因作物面積的0.3%最近，歐盟又根 據(jù)高質(zhì)量的科學評價，對轉(zhuǎn)基因食品進行了更加嚴格的管制措施，以便更好的保障人類健康

7、 以及環(huán)境的安全。我國目前對轉(zhuǎn)基因的態(tài)度是科研支持，轉(zhuǎn)基因食品的消費也沒有限制， 只是要求生產(chǎn)者如果采用了轉(zhuǎn)基因原料在食品包裝上必須標明。至于選擇與否，由消費者自 己決定。3轉(zhuǎn)基因食品的安全問題面對越來越多的轉(zhuǎn)基因食品，人們的認識并非一致，以美國為首的主吃派和歐洲為首的 反對派在全球范圍內(nèi)形成了兩大陣營。不久前調(diào)查表明，美國、加拿大兩國的消費者大多已 接受了轉(zhuǎn)基因食品，僅有27%的消費者認為食用轉(zhuǎn)基因食品可能會對健康造成危害。而在歐 洲，大多數(shù)人是反對轉(zhuǎn)基因食品的，英國尤為明顯。緣由是1998年英國的一位教授的研究 表明，幼鼠食用轉(zhuǎn)基因的土豆后，會使內(nèi)臟和免疫系統(tǒng)受損，這是對轉(zhuǎn)基因食品提出的最

8、早 質(zhì)疑，并在英國及全世界引發(fā)了關于轉(zhuǎn)基因食品安全性的大討論。雖然英國皇家學會于1999 年5月發(fā)表聲明：此項研究“充滿漏洞”，得出轉(zhuǎn)基因土豆有害生物健康的結論完全不足為 憑。但是，轉(zhuǎn)基因食品的安全性問題已引起了消費者的懷疑。79%的英國人反對試種基因改 良作物，抵制轉(zhuǎn)基因食品進入市場。轉(zhuǎn)基因食品到底吃還是不吃，一些專家已表明了轉(zhuǎn)基因生物和常規(guī)育成的品種是一樣的， 兩者都是在原有的基礎上對某些性狀進行修飾，或增加新性狀，或消除原有不利性狀。常規(guī) 育成的品種僅限于種內(nèi)或近緣種間，而轉(zhuǎn)基因植物中的外源基因可來自植物、動物、微生物。 雖然，目前的科學水平還不能完全精確地預測一個外源基因在新的遺傳背景

9、中會產(chǎn)生什么樣 的相互作用，但從理論上講，轉(zhuǎn)基因食品是安全的。4 PCR技術對轉(zhuǎn)基因食品的檢測目前，對轉(zhuǎn)基因食品的檢測主要是檢測是否有外源基因或DNA7,檢測是否有外源蛋白質(zhì)， PCR技術主要針對轉(zhuǎn)基因食品中是否有外源基因或DNA，外源基因中目的基因是轉(zhuǎn)基因食品 開發(fā)中研究的重點，隨著轉(zhuǎn)基因食品種類的不同，所使用的目的基因也不同，因此通過檢測 外源基因中目的基因來鑒別轉(zhuǎn)基因食品，難度較大。而即使在含有不同目的基因的轉(zhuǎn)基因食 品中往往使用相同或相似啟動子、終止子或標記基因，這些啟動子、終止子和標記基因DNA 序列具有特異性，且大多來自微生物，非植物本身固有，因此通過檢測樣品是否含有特定啟 動子、

10、終止子或標記基因序列作為鑒別轉(zhuǎn)基因食品依據(jù)是一種可行方法肌4.1 PCR技術在轉(zhuǎn)基因食品檢測中應用劉光明等根據(jù)轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物中常用花椰菜葉病毒啟動子(CaMV 35s)和根癌農(nóng)桿菌終止 子(N0S)序列，設計并合成兩對不同引物和相對應兩種熒光雙鏈探針(FDCP)，分別建立常規(guī) PCR、應用FDCP新型實時熒光PCR檢測轉(zhuǎn)基因成分35S啟動子和NOS終止子方法。試驗結果 表明，兩種PCR方法均能有效檢測出35S和NOS片段，其中常規(guī)PCR方法具有靈敏度高、特 異性好之特點；應用FDCP新型實時熒光PCR方法則更為簡便、快速、準確。曹際娟等10， 應用PCR技術對轉(zhuǎn)基因(GM)玉米及其粗加工食品如：

11、爆玉米花、熱玉米棒、速溶玉米片中通 常轉(zhuǎn)入基因構建元件35S啟動子、NOS終止子和外源抗蟲GrvLA(b)目的基因進行檢測，對 GM玉米檢測低限可達到0.1%。劉垣等in在研究轉(zhuǎn)基因大豆DNA檢測芯片時，在對PCR反應和擴增產(chǎn)物與芯片雜交條件 進行優(yōu)化同時，比較芯片檢測特異性和重復性，并對檢測靈敏度進行測試。結果表明，該方 法具有較好特異性和重復性，檢測靈敏度可達0.5%，由于采用多重PCR技術，一次可同時 檢測多個基因，提高檢測準確性和效率。欒鳳俠等12針對該實驗材料轉(zhuǎn)入外源基因選擇標準中通用外源基因CaMV35S, NOS，bar 和植物內(nèi)源基因tRNALeu作為特異性引物，對影響定性PC

12、R檢測(反應體系：氯化鎂濃度， 引物和模板濃度；反應條件：退火溫度和時間，循環(huán)數(shù)等)主要備件進行實驗優(yōu)化和選擇， 同時對PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳分析。結果表明，可檢測到CaMV35S, NOS, bar外源基 因預期大小的目的條帶，表明定性PCR檢測所優(yōu)化條件適合轉(zhuǎn)基因小麥。實驗還測定定性 PCR最低檢測靈敏度為1%；同時對轉(zhuǎn)入外源目的基因進行表達蛋白檢測，蛋白電泳結果表 明，檢測出1Dx5亞基和1Dvl0亞基。國內(nèi)已有文獻報道，在借鑒幾種傳統(tǒng)定量PCR方法基礎上，建立一種新的實時熒光定量 PCR法對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品進行檢測。所謂實時熒光定量PCR技術，是指在PCR反應體系中加入熒 光基因，利用

13、熒光信號積累實時檢測整個PCR進程，最后，通過標準曲線對未知模板進行定 量方法。該法有效解決傳統(tǒng)定量方法所存在假陽性及準確度不高難題。陳穎等采用實時熒光 定量PCR技術，通過使用特異引物和探針，對玉米中內(nèi)源基因Invertase和轉(zhuǎn)基因玉米 Mon810、Event176中的外源基因進行定量檢測，建立商業(yè)化轉(zhuǎn)基因玉米Mon8 1 0(YieldGard) 和Event 1 76(Maximizer)定量PCR檢測方法。該方法檢測靈敏度小于0. 01%，是國際上 設定轉(zhuǎn)基因最低限量100倍13。4.2 PCR技術檢測轉(zhuǎn)基因食品發(fā)展趨勢隨著各種轉(zhuǎn)基因植物迅速發(fā)展，由此衍生而來轉(zhuǎn)基因食品數(shù)量也迅速增

14、加，并引起社會 各界對轉(zhuǎn)基因食品爭論，轉(zhuǎn)基因食品安全不僅是科學領域問題，也是經(jīng)濟、政治等領域關心 問題，同時也關乎到每一個人切身利益。為了促進轉(zhuǎn)基因食品健康發(fā)展，各國政府對轉(zhuǎn)基因 食品研制、生產(chǎn)及銷售環(huán)節(jié)都制定相關管理條例，轉(zhuǎn)基因食品標識也被歐、美及我國政府列 為強制性措施。轉(zhuǎn)基因食品標識制度能否順利實行關鍵在于能否建立準確可靠轉(zhuǎn)基因食品鑒 別技術。利用PCR方法檢測轉(zhuǎn)基因食品中外源基因是目前國內(nèi)外常用轉(zhuǎn)基因食品鑒別技術， 因而PCR技術在轉(zhuǎn)基因食品檢測中越來越顯重要。但PCR準確性仍受很多因素影響如，提取 DNA性質(zhì)，PCR反應抑制物等，但隨著該項技術的逐漸成熟和完善，其檢測結果也將越來越

15、準確可靠，對現(xiàn)有或新出現(xiàn)的轉(zhuǎn)基因食品都能進行快速、準確地檢測。所以在實際應用中， PCR檢測轉(zhuǎn)基因食品方法不斷被改進。轉(zhuǎn)基因食品作為一種新食品，其食用安全性目前尚無定論，從食品安全的角度，需要對 其進行檢測，而目前的PCR技術在轉(zhuǎn)基因食品中的應用，也僅是可以檢測出是否含有外源 DNA即轉(zhuǎn)基因成分，對于人們所關心的安全的問題并不能檢出，所以目前也常與其它的方法 結合，女口，PCR-SSCP，現(xiàn)代遺傳學研究中用于檢測基因點突變和短序列缺失與插入的一種工 具14。5小結通過以上PCR技術在轉(zhuǎn)基因食品中的應用，我認為PCR技術可以加快實現(xiàn)它的工程化， 效益化，不僅是在食品領域，還有農(nóng)業(yè)，醫(yī)學等領域。其

16、實在這些領域都已有PCR技術相關 的報道。如，PCR技術在腫瘤上的應用15，及傳統(tǒng)的生物發(fā)酵技術上可以結合PCR技術，利 用DNA的體外復制，實現(xiàn)表達，還有就是現(xiàn)代環(huán)境工程污水處理的微生物載體研究。大多數(shù)基因都是以基因家族的形式出現(xiàn)，而以基因家族出現(xiàn)的基因往往具有一定的相似 性，通過比較，就可找到保守序列和可變序列，從而可通過PCR技術檢測到新的基因。PCR 技術作為一項“革命性的技術”，不僅推動了遺傳與分子生物學的發(fā)展。而且，在其他領域 科學家的努力與創(chuàng)新下也得到了很好的應用?？傊S著科學技術的不斷進步，PCR技術必 將得到新的發(fā)展，以之為基礎的新技術將不斷出現(xiàn)。參考文獻Xu Wen-Ta

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