細胞培養(yǎng)中支原體污染的預防與處理

1、細胞培養(yǎng)中支原體的預防與處理Mycoplasma國內主要有三種譯名，醫(yī)學文獻譯為“支原體”（分枝原體，枝原體，類菌 質體），動物醫(yī)學文獻譯為“霉形體”或“支原體”，臺灣、香港則譯為微漿菌。支原體是目前已知一類能在無生命培養(yǎng)基上生長繁殖的最小的原核細胞型微生物。自然 界分布廣泛，種類多，有80余種，分為兩個屬：一為支原體屬（Mycoplasma）,有幾十個 種；另一為脲原體屬（Ureaplasma）,僅有一種。與人類感染有關的主要是肺炎支原體和解 脲脲原體。支原體無細胞壁，多呈不規(guī)則球狀、長絲狀，可分枝，營寄生共生或腐生。一般侵害對 象為動植物，可造成多種疾病。細胞培養(yǎng)（特別是傳代細胞）被支原體

2、污染是個世界性問題。國內外研究表明，95% 以上是以下四種支原體：口腔支原體（M.oraleX精氨酸支原體（M.arginini 豬鼻支原體 （M.hyorhinis）和菜氏無膽甾原體（A.laidlawii），為牛源性。國外調查證明，大約有二十 多種支原體能污染細胞，有的細胞株可以同時污染兩種以上的支原體。支原體污染的來源包括工作環(huán)境的污染、操作者本身的污染（某些支原體在人體是正常 菌群X培養(yǎng)基的污染、被污染細胞造成的交叉污染、實驗器材的污染、制備細胞的原始組 織或器官的污染，等等。體外生長的細胞對微生物及一些有害有毒物質沒有抵抗能力因此培養(yǎng)基應達到無化學 物質污染、無微生物污染（如細菌、真

3、菌、支原體、病毒等、無其他對細胞產生損傷作用 的生物活性物質污染（如抗體、補體。對于天然培養(yǎng)基，污染主要來源于取材過程及生物 材料本身，應當嚴格選材，嚴格操作。對于合成培養(yǎng)基，污染主要來源于配制過程，配制所 用的水，器皿應十分潔凈，配制后應嚴格過濾除菌。由于體外培養(yǎng)細胞自身沒有抵抗污染的能力，而且培養(yǎng)基中的抗生素抗污染能力有限， 因而培養(yǎng)細胞一旦發(fā)生污染多數將無法挽回。支原體污染后，因為它們不會使細胞死亡可以 與細胞長期共存，培養(yǎng)基一般不發(fā)生渾濁，細胞無明顯變化，外觀上給人以正常感覺，實則 細胞受到多方面潛在影響，如引起細胞變形，影響DNA合成，抑制細胞生長等。組織細胞培養(yǎng)工作中，可以從以下幾

4、方面來預防支原體的污染：控制環(huán)境污染；嚴格實 驗操作；細胞培養(yǎng)基和器材要保證無菌；在細胞培養(yǎng)基沖加入適量的抗生素。抗生素主要用于消毒培養(yǎng)液，是培養(yǎng)過程中預防微生物污染的重要手段，也是微生物污 染不嚴重時的“急救”方法。不同抗生素殺滅微生物不同，應根據需要選擇。在細胞培養(yǎng)過程中如果發(fā)現破碎的細胞甚多培養(yǎng)細胞需要頻繁改善營養(yǎng)環(huán)境才能支持 長期傳代培養(yǎng)時，應該懷疑支原體污染。支原體污染難以觀察特殊的外觀變化，培養(yǎng)液也不 渾濁。從2013年開始，Nature期刊已正式要求涉及細胞培養(yǎng)的投稿文章，要求必須進行 支原體檢測，截止目前，大量的SCI期刊都跟進這項要求。為了提高動物細胞培養(yǎng)生物制 品的質量和安

5、全性，中華人民共和國藥典規(guī)定主細胞庫、工作細胞庫、病毒種子批、對照細 胞以及臨床治療用細胞應進行支原體檢測。美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）規(guī)定，應該用合 適的方法檢測細胞的支原體污染狀況。歐洲藥典規(guī)定對細胞治療產品需要進行嚴格的支原體 檢測。以上這些要求和規(guī)定，再加上支原體的特性和污染的后果都指向一點一一支原體分子 檢測成為細胞培養(yǎng)必不可少的環(huán)節(jié)。先達基因研發(fā)了一種革命性的細胞污染支原體檢測試劑 盒，每次檢測只需半個小時，減少了很多工作量其原理是基于公司自主開發(fā)的實時熒光恒溫 核酸檢測技術（ERA ）,可以在恒定的低溫下（25。42對）對痕量的支原體種內保守性DNA 片段進行特異性的擴增，擴

6、增反應可以在20min內完成，該試劑盒檢測范圍涵蓋130種支 原體。支原體污染細胞后，特別是重要的細胞株，有必要清除支原體，常用方法有：抗生素處理、抗血清處理、抗生素加抗血清和補體聯合處理。要注意的是：支原體沒有細胞壁，故作 用于細胞壁生物合成的抗生素，如內酰胺類、萬古霉素等是不敏感的；對多粘菌素、利福平、 磺胺藥物普遍耐火藥。對支原體最有抑制活性抗生素是四環(huán)素類、大環(huán)內酯類等，氨基糖苷 類、氯霉素對支原體有較小的抑制作用。必要時更換所有培養(yǎng)用物。通常，濾過除菌的方法 對支原體是沒有作用的。由于一些微生物，如支原體，病毒等能通過濾膜，所以過濾藥品仍潛在被外源微生物污 染的危險，近年來，6Co輻射滅菌技術在醫(yī)藥、食品等領域廣泛應用，由于輻射滅菌能夠 徹底殺滅所有微生物。有試驗證實以2Mrad輻射處理的各培養(yǎng)基樣品達到了無菌要求，經 多批培養(yǎng)試驗，輻射滅菌安全可靠；輻射滅菌的培養(yǎng)基營養(yǎng)性能不低于過濾組，證明輻射滅 菌對培養(yǎng)基性能無不良影響；對血清的輻射滅菌試驗效果也表明60C Oy