細菌的生理生化實驗

1、1目的1.1 了解細菌鑒定中常用的生理生化試驗反應原理1.2掌握測定細菌生理生化反應的技術和方法2原理各種微生物在代謝類型上表現(xiàn)了很大的差異。由于細菌特有的單細胞 原核生物的特性，這種差異就表現(xiàn)的更加明顯。不同細菌分解、利用 糖類、脂肪類和蛋白類物質(zhì)的能力不同，所以其發(fā)酵的類型和產(chǎn)物也 不相同，也就是說，不同微生物具有不同的酶系統(tǒng)。即使在分子生物 學技術和手段不斷發(fā)展的今天，細菌的生理生化反應在菌株的分類鑒 定中仍有很大作用。3材料3.1菌種大腸埃希氏菌(Escherichia coli)、產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes)、普通變形桿菌(Proteus vulgari

2、s)、枯草 芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的斜面菌種3.2培養(yǎng)基葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基、蛋白胨水培養(yǎng)基、糖發(fā)酵培養(yǎng)基(葡萄糖、 乳糖或蔗糖)3.3試劑40%NaOH溶液、肌酸、甲基紅試劑、吲噪試劑、乙醚、1.6%漠甲基 酚紫指示劑。3.4器具超凈工作臺、恒溫培養(yǎng)箱、高壓滅菌鍋、試管、移液管、杜氏小套管。4流程糖發(fā)酵試驗一V-P試驗一甲基紅試驗一吲噪試驗5步驟糖類發(fā)酵試驗1目的了解不同細菌分解利用糖的能力及實驗原理，并掌握其操作方法.2原理可根據(jù)細菌分解利用糖能力的差異表現(xiàn)出是否產(chǎn)酸產(chǎn)氣作為鑒定菌 種的依據(jù)。是否產(chǎn)酸，可在糖發(fā)酵培養(yǎng)基中加入指示劑漠甲酚紫(即 B.C.P指示劑，其p

3、H在5.2以下呈黃色，pH在6.8以上呈紫色)， 經(jīng)培養(yǎng)后根據(jù)指示劑的顏色變化來判斷。是否產(chǎn)氣，可在發(fā)酵培養(yǎng)基 中放入倒置杜氏小管觀察。3材料3.2菌種大腸埃希氏菌(Escherichia coli)、產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes )、普通變形桿菌(Proteus vulgaris )的斜面 菌種3. 3培養(yǎng)基葡萄糖、蔗糖和乳糖發(fā)酵培養(yǎng)液試管4流程發(fā)酵液試管一標記一接種一培養(yǎng)一觀察一記錄5步驟5.1試管標記圖9-1糖發(fā)酵產(chǎn)氣取分別裝有葡萄糖、蔗糖和乳糖發(fā)酵培養(yǎng)液試管各A不產(chǎn)氣；B產(chǎn)氣4支，每種糖發(fā)酵試管中均分別標記大腸桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌、普通變 形菌和空白對照。5.2

4、接種培養(yǎng)以無菌操作分別接種少量菌苔至以上各相應試管中，每種糖發(fā)酵培養(yǎng) 液的空白對照均不接菌。將裝有培養(yǎng)液的杜氏小管倒置放入試管中（圖9-1），置37C恒溫箱中培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)24h、48h、和72h觀察結果。5.3觀察記錄與對照管比較，若接種培養(yǎng)液保持原有顏色，其反應結果為陰性，表 明該菌不能利用該種糖，記錄用“一 ”表示；如培養(yǎng)液呈黃色，反應結 果為陽性，表明該菌能分解該種糖產(chǎn)酸，記錄用H”表示。培養(yǎng)液中 的杜氏小管內(nèi)有氣泡為陽性反應，表明該菌分解糖能產(chǎn)酸并產(chǎn)氣，記 錄用“+”表示；如杜氏小管內(nèi)沒有氣泡為陰性反應，記錄用“一”表示。（二）乙酰甲基甲醇試驗（V. P試驗）1目的了解鑒別不同腸桿

5、菌科各菌屬的乙酰甲基甲醇試驗原理，并掌握其操 作方法.2原理某些細菌在葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)液中能分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，丙酮 酸縮合，脫羧成乙酰甲基甲醇，后者在強堿環(huán)境下，被空氣中氧，氧 化為二乙酰，二乙酰與蛋白胨中的胍基生成紅色化合物，稱VP( + ) 反應。3材料3.1菌種大腸埃希氏菌(Escherichia coli)、產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes)、普通變形桿菌(Proteus vulgaris)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的斜面菌種3.2培養(yǎng)基葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)液的試管4流程培養(yǎng)液試管一標記一接種一培養(yǎng)一觀察一記錄5步驟5.1標記試管取5

6、支裝有葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)液的試管，分別標記大腸桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌、普通變形菌、枯草芽孢桿菌和空白對照。5.2接種培養(yǎng)以無菌操作分別接種少量菌苔至以上相應試管中，空白對照管不接菌，置37C恒溫箱中，培養(yǎng)2448h。5.3觀察記錄取出以上試管，振蕩2min。另取5支空試管相應標記菌名，分別加 入35ml以上對應管中的培養(yǎng)液，再加入40%NaOH溶液1020 滴，并用牙簽挑入約0.51mg微量肌酸，振蕩試管，以使空氣中的 氧溶入，置37C恒溫箱中保溫1530min后，若培養(yǎng)液呈紅色，記 錄為V.P.試驗陽性反應（用“+”表示）；若不呈紅色，記錄為V.P.試驗陰性反應（用“一”表示）。注意：原試管中留下的

7、培養(yǎng)液用作甲基紅試驗。（三）甲基紅試驗（M.R .試驗）1目的了解鑒別腸桿菌科各菌屬的甲基紅試驗原理，并掌握其操作方法.2原理腸桿菌科各菌屬都能發(fā)酵葡萄糖，在分解葡萄糖過程中產(chǎn)生丙酮酸， 進一步分解中，由于糖代謝的途徑不同，可產(chǎn)生乳酸，琥珀酸、醋酸 和甲酸等大量酸性產(chǎn)物，可使培養(yǎng)基PH值下降至pH4.5以下，使甲 基紅指示劑變紅。3材料3.1菌種同V. P試驗3.2培養(yǎng)基同V. P試驗4流程培養(yǎng)液一指示劑一觀察一記錄結果5步驟于V.P.試驗留下的培養(yǎng)液中，各加入23滴甲基紅指示劑，注意沿 管壁加入，仔細觀察培養(yǎng)液上層，若培養(yǎng)液上層變成紅色，即為陽性 反應；若仍呈黃色，則為陰性反應，分別用“+”

8、或“一”表示。（四）吲噪試驗1目的掌握吲噪試驗（Ehrlich法）的原理和方法2原理有些細菌含有色氨酸酶，能分解蛋白胨中的色氨酸生成吲噪（靛基質(zhì)）。吲噪本身沒有顏色，不能直接看見，但當加入對二甲基氨基苯 甲醛試劑時，該試劑與吲噪作用，形成紅色的玫瑰吲噪。3材料3.1菌種測試菌株.3.2培養(yǎng)基蛋白胨水培養(yǎng)基3.3試劑二甲基氨基苯甲醛溶液、乙醚。4流程標記試管一接種一培養(yǎng)一觀察一記錄5步驟5.1試管標記取裝有蛋白胨水培養(yǎng)液的試管5支，分別標記大腸桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌、普通變形菌、枯草芽孢桿菌和空白對照。5.2接種培養(yǎng)以無菌操作分別接種少量菌苔到以上相應試管中，第5管作空白對照 不接種，置37C恒溫箱中

9、培養(yǎng)2448h。5.3觀察記錄在培養(yǎng)液中加入乙醚12ml，經(jīng)充分振蕩使吲噪萃取至乙醚中，靜 置片刻后乙醚層浮于培養(yǎng)液的上面，此時沿管壁緩慢加入510滴吲 噪試劑（加入吲噪試劑后切勿搖動試管，以防破壞乙醚層影響結果觀 察），如有吲噪存在，乙醚層呈現(xiàn)玫瑰紅色，此為吲噪試驗陽性反應， 否則為陰性反應，陽性用“+”、陰性用“一”表示。6結果記錄生理生化反應測定結果.細菌的生理生化實驗實驗目的鞏固微生物無菌接種技術；了解細菌鑒定中常用的生理生化實驗的原理和方法微生物的生理生化反應微生物細胞在酶的催化下進行各種各樣的生理生化反應把微生物細胞在一定的條件下培養(yǎng)，通過觀察生理現(xiàn)象和檢查代謝產(chǎn) 物，可以了解微生

10、物的代謝過程和代謝的特點由于不同的微生物可能具有不同的酶，代謝途徑和代謝產(chǎn)物可能也有 不同，生理生化反應是微生物分類鑒定的重要指標之一.淀粉水解實驗淀粉培養(yǎng)基淀粉培養(yǎng)基+接種+變色圈，水解圈培養(yǎng)24h加盧哥氏碘液I-KI結果：有水解圈淀粉水解實驗陽性，用+表示；無水解圈淀粉水解實驗陰性，用-表示；糖發(fā)酵實驗原理：丙酮酸裂解生成乙酰CoA與甲酸，甲酸在酸性條件下在甲酸氫解酶作用下可進一步裂解生成H2和CO2產(chǎn)酸產(chǎn)氣缺少甲酸氫解產(chǎn)酸不產(chǎn)氣步驟:配制糖發(fā)酵培養(yǎng)基接種培養(yǎng)（約24h）觀察結果結果：紫色無氣泡,既不產(chǎn)酸也不產(chǎn)氣用-表示；黃色無氣泡，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，用+表示；黃色且有氣泡，產(chǎn)酸產(chǎn)氣，用0表示.

11、甲基紅實驗（M.R實驗）原理微生物進行混合酸發(fā)酵，產(chǎn)生各種有機酸一pH下降加入指示劑甲基紅紅色步驟:配制蛋白胨水培養(yǎng)基接種培養(yǎng)（約24h）加入指示劑甲基紅12滴觀察結果結果：紅色M.R實驗陽性，用+表示；不變色一M.R實驗陰性，用-表示；V.P實驗V.P實驗步驟:配制蛋白胨水培養(yǎng)基接種培養(yǎng)（約24h）510d40%KOH, 510d 5%a-奈酚和少量肌 醇，取出塞子，用力震蕩，保溫（37度1530min）觀察結果結果：紅色V.P實驗陽性，用+表示；不變色一V.P實驗陰性，用-表示.實驗內(nèi)容以組為單位進行淀粉水解實驗,糖發(fā)酵實驗,V.P實驗和M.R實驗.實驗菌種：淀粉水解實驗，糖發(fā)酵實驗:大腸桿菌，蘇云金芽孢桿菌V.P實驗和M.R實驗:大腸桿菌，產(chǎn)氣桿菌汪意事項：實驗報告：列表記錄實驗結果思考題:第4小題四大類細胞型微生物菌落的鑒定初步鑒定確證:顯微鏡觀察微生物菌落特征的記錄和描述菌落形態(tài):形狀