大學(xué)課程植物組織培養(yǎng)14章快繁-組培課件

1、離體無性繁殖方法 離體無性繁殖方法 一 引言1 概念（頂芽、不定芽、腋芽、） （1） 頂芽（Terminal）：生長在主干或側(cè)枝頂端的芽。 （2）腋芽（Axllary bud）：著生在葉腋處的芽，也稱為側(cè)芽 (Lateral bud)。（3）不定芽（Adventitious bud）從現(xiàn)存的芽以外（頂芽、腋芽/側(cè)芽）的任何器官、組織上通過器官發(fā)生重新形成的芽稱之為不定芽。 大學(xué)課程植物組織培養(yǎng)14章快繁-組培課件二 無性離體繁殖的概念分析 1 廣義的離體無性繁殖植物細胞工程的中心內(nèi)容是植物細胞和組織的離體培養(yǎng)。從技術(shù)上說它是一種從細胞到植株的無性繁殖技術(shù)。從遺傳的角度來講具它有雙重性，一是遺傳

2、的保守性，二是遺傳的變異性。利用其保守性我們可以進行植物的無性繁殖，建立植物種質(zhì)資源庫以及生產(chǎn)有用化合物；利用其變異性我們可以進行體細胞誘變、體細胞雜交以及基因工程等。離體無性繁殖是在人工控制的無菌條件下，使植物在人工培養(yǎng)基上繁殖的技術(shù)，跟常規(guī)的繁殖方法相比它是一種微型操作過程，因此，有時就直接稱之為微繁 二 無性離體繁殖的概念分析離體無性繁殖是在人工控制的無菌條件下，使植物在人工培養(yǎng)基上繁殖的技術(shù)，跟常規(guī)的繁殖方法相比它是一種離體的、無性的繁殖、微型的操作過程。 整個植物組織培養(yǎng)技術(shù)體系中除“離體授粉”外都可以稱為離體無性繁殖方法。因此，本節(jié)所涉及的離體無性繁殖方法（快繁、微繁），不是一個新

3、的方法，而是從“目的”角度（或?qū)用妫┥现v的植物組織培養(yǎng)技術(shù)。它是基于植物 “全能性-分化-脫分化” 理論且以“離體繁殖-特別是高繁殖系數(shù)”為目的的多種植物組織技術(shù)的通俗叫法。 大學(xué)課程植物組織培養(yǎng)14章快繁-組培課件廣義的離體繁殖技術(shù) 根、芽（同時） 愈傷組織 芽 根 根 芽外植體 胚狀體（根芽同時） （胚性愈傷） 根、芽 球莖（懸浮或固體培養(yǎng)） 試管苗外植體廣義的離體繁殖技術(shù)試管苗外植體 2 狹義的離體無性繁殖在學(xué)術(shù)交流及生產(chǎn)中現(xiàn)在一般把直接利用植物根、莖、葉、莖尖等器官或組織進行培養(yǎng)，以取得更多試管苗的技術(shù)叫快繁、微繁（Micropropagation, Rapid micropagati

4、on ）。 大學(xué)課程植物組織培養(yǎng)14章快繁-組培課件三 快繁的一般程序及幾種途徑 1 快繁的一般程序外植體的選擇外植體滅菌接種培養(yǎng)練苗移栽 大學(xué)課程植物組織培養(yǎng)14章快繁-組培課件 2 選擇外植體注意問題（1）繁殖對象的品種典型性： 植物在自然條件下的繁殖特點，盡可能取自然繁殖器官的適 當部位作外植體。 離體條件下莖芽的增殖方式。如有些植物在培養(yǎng)條件下苗的生長 要以頂芽、腋芽直接生成小植株，易選擇頂芽作為外植體，但大多數(shù)植物常常先形成不定芽然后通過生根培養(yǎng)才能最后形成小植株，即要考慮何種器官培養(yǎng)更易產(chǎn)生不定芽，如非洲紫羅蘭、大巖桐、秋海棠以葉片為外植體易產(chǎn)生不定芽，而百合、水仙、大蒜、貝母等則

5、以鱗莖為外植體更易產(chǎn)生不定芽。（2）外植體的取材部位和大小、生理狀態(tài)。 大學(xué)課程植物組織培養(yǎng)14章快繁-組培課件離體植株增殖的幾條途徑：（1）腋芽增殖 通過外源激素調(diào)整（特別是細胞分裂素的使用），最大可能解除頂端優(yōu)勢，促進側(cè)芽萌發(fā)。 其特點是：培養(yǎng)方法簡單，能高度保持遺傳穩(wěn)定性，能長期繼代繁殖。目前采這一方式快速繁殖的植物有石竹、馬鈴薯、甘薯、草莓、葡萄、月季等。這一繁殖方式需要嚴格控制激素濃度，以防止產(chǎn)生愈傷組織。 大學(xué)課程植物組織培養(yǎng)14章快繁-組培課件（2）單節(jié)莖段增殖 通過培養(yǎng)使不容易萌發(fā)側(cè)芽或腋芽的莖條伸長后再截取繁殖的一種快繁方法。常用于頂端優(yōu)勢不易或不能打破的植物的快繁。該方法在

6、離體快繁時不常用。大學(xué)課程植物組織培養(yǎng)14章快繁-組培課件（3）不定芽增殖從現(xiàn)存的芽以外（頂芽、腋芽/側(cè)芽）的任何器官、組織上通過器官發(fā)生重新形成的芽稱之為不定芽，在自然條件下，許多植物的器官要以產(chǎn)生不定芽，如蘋果的根,鳳信子的鱗莖，秋海棠和非洲紫羅蘭的葉片等。風信子四季秋海棠非洲紫羅蘭風信子四季秋海棠非洲紫羅蘭特點：繁殖系數(shù)高。非洲紫羅蘭用常規(guī)葉插法，每片葉只能產(chǎn)生幾個或十幾個芽，但在組培條件下可一次形成幾十至幾百個芽，一年可以培養(yǎng)成千上萬個小植株，遺傳穩(wěn)定性較好，但繼代次數(shù)有限。培養(yǎng)物繼代一定次數(shù)以后，不定芽形成能力即減弱，需要重新起始無菌培養(yǎng)物，此外，不定芽需要進行生根培養(yǎng)才能形成真正的

7、植株。誘導(dǎo)不定芽一般需要同時加入外源生長素和細胞分裂素，二者的配比一般是細胞分裂素要略高于生長素，其二者的總體使用濃度應(yīng)盡可能的低，以免生產(chǎn)過多的愈傷組織，以保證繁殖品種的遺傳穩(wěn)定性。 大學(xué)課程植物組織培養(yǎng)14章快繁-組培課件（4）胚狀體增殖特點：增長率高，胚的雙極性可免去生根環(huán)節(jié)，但胚狀體休眠的誘導(dǎo)和去除還不能很好把握，其成苗率仍不高。目前除去一些特殊用途外（人工種子），這一途徑還沒有用于快繁技術(shù)。 大學(xué)課程植物組織培養(yǎng)14章快繁-組培課件（5）愈傷組織增殖所有的植物通過組織培養(yǎng)的方法可以誘導(dǎo)愈傷組織，再進一步分化即可獲得小植株。這一途徑經(jīng)歷了組織培養(yǎng)技術(shù)的所有過程（愈傷組織誘導(dǎo)愈傷組織增殖

8、芽分化生根完整植株），它屬于真正意義上的組織培養(yǎng)。一切通過其它增殖方式不能成功的植物，均可以通過此途徑獲得組培苗。其特點是成功率高，繁系數(shù)大（但是隨著愈傷繼代時間的增長，再生繁殖能力逐漸減弱）但遺傳穩(wěn)定性較差。 該途徑一般為遺傳轉(zhuǎn)化、無性系篩選、原生質(zhì)體融合等植物離體遺傳重組技術(shù)的下游步驟。一般不采用這一方法作為快繁途徑（不穩(wěn)定、費時、費力）。大學(xué)課程植物組織培養(yǎng)14章快繁-組培課件3 影響快繁效果的幾個因素：（1）植物種類、品種（2）基本培養(yǎng)基（3）激素（4）培養(yǎng)條件（溫度、光照）（4）生根、練苗處理大學(xué)課程植物組織培養(yǎng)14章快繁-組培課件四 木本植物離體快繁（1）一般情況下比草本植物困難

9、草本植物-小型木本（灌木、藤類）-大型木本（喬木）（2）周期較長、繁殖系數(shù)低（3）培養(yǎng)物易爆發(fā)性褐化（4）生根較困難大學(xué)課程植物組織培養(yǎng)14章快繁-組培課件五 離體快繁中的一些問題（1）試管苗的玻璃化現(xiàn)象 玻璃化苗是植物組織培養(yǎng)中出現(xiàn)的、半透明狀的畸形的試管植株，它不能或不易移栽于土壤中。其形態(tài)解剖學(xué)的特點是整棵植株矮小、腫脹，節(jié)間很短或沒有節(jié)間，疏導(dǎo)組織雖可看到，但導(dǎo)管或管胞木質(zhì)化不完全，葉片厚而狹長，有時基部較寬，葉片皺縮或縱向卷曲，脆弱易破碎。大學(xué)課程植物組織培養(yǎng)14章快繁-組培課件生姜在不同激素里的生長情況玻璃化苗的成因及預(yù)防生姜在不同激素里的生長情況玻璃化苗的成因及預(yù)防（2）培養(yǎng)物的

10、褐化（特別是木本植物） 褐化（褐變）是指外植體在培養(yǎng)過程中體內(nèi)的多酚氧化酶被激活,使細胞里的酚類物質(zhì)氧化成棕褐色的醌類物質(zhì),以致培養(yǎng)基逐漸變成褐色,培養(yǎng)物也隨之進一步變褐而死亡。這是植物組織培養(yǎng)的3大難題之一。 細胞損傷-多酚類化合物+多酚氧化酶=醌類化合物級聯(lián)放大-爆發(fā)性影響褐化的因素及防治方法（3）物種的局限性：裸子植物較困難，周期長，繁殖系數(shù)低（4）無性系變異的存在：造成種質(zhì)衰退，可以解決褐化、污染、玻璃化（2）培養(yǎng)物的褐化（特別是木本植物）褐化、污染、玻璃化六 離體快繁的應(yīng)用前景1意義（1）快速繁殖新品種，使優(yōu)良品種迅速應(yīng)用離體繁殖因為周期短（1-3個月），不受季節(jié)限制，繁殖系數(shù)高（幾

11、十幾百倍），因此其繁殖速度是行何其它方法所不能比的。（2）脫毒保持種性快繁已是一個系統(tǒng)技術(shù)，在許多無性繁殖作物的種苗生產(chǎn)上均形成了自己的體系。（3）能夠有效地保持優(yōu)良品種的特性任何一個優(yōu)良品種均需要有一個忠實地保存其遺傳性狀的繁殖方法。離體無性繁殖由于繁殖體系是建立在體細胞系的基礎(chǔ)上，繁殖過程在人工控制的環(huán)境條件下所以既不會造成性狀分離，也不會產(chǎn)生退化，同時還避免了病蟲害的侵染，從而可以很好的保持品種的優(yōu)良特性，是無異交作物和無性繁殖品種繁育的理想途徑。 大學(xué)課程植物組織培養(yǎng)14章快繁-組培課件2 離體快繁的應(yīng)用范圍 用于加速某些難繁殖或繁殖度很低的植物，或某些需要加速繁殖的特殊基因型，如名貴

12、花卉、優(yōu)良資源、果樹芽變分離、工程植株等等。 用于自然繁殖易感染病毒的植物，如馬鈴薯、甘薯、甘蔗、香蕉、石竹、百合等等。 用于有性繁殖變異范圍大而自然條件下又不易無性繁殖的植物，如非洲菊、紫羅蘭等。大學(xué)課程植物組織培養(yǎng)14章快繁-組培課件作業(yè)：1 試述莖芽增殖的幾種途徑及其機理。 大學(xué)課程植物組織培養(yǎng)14章快繁-組培課件取材對非試管苗生根的影響（柳旭 等）一、繁材的年齡母本的年齡：在選材時應(yīng)采集年幼的母本,特別對許多難生根樹種,應(yīng)采集12年生植株上的枝條,快繁效果較好。 插材的年齡：插材以當年生健壯枝梢的再生能力最強,這是因為嫩枝繁材內(nèi)源生長素含量高,細胞分生能力強,有利于不定根的形成。所選插

13、材的部位，是靠近樹冠部位的好，還是靠近根系部位的好？ 采用母本根頸部位的1年生萌蘗,其發(fā)育階段最年幼,萌枝生長部位靠近根系,使它們積累了較多的營養(yǎng)物質(zhì),快繁后易于生根。 相反,樹冠部位的插材,由于發(fā)育階段性差異,快繁后生根相對減弱。取材對非試管苗生根的影響（柳旭 等）一、繁材的年齡 二、繁材的質(zhì)量用作繁材的枝條是幼嫩好還是成熟好？為什么？繁材內(nèi)積存的養(yǎng)分是快繁后形成新器官所需要的營養(yǎng)物質(zhì),凡是發(fā)育充實、營養(yǎng)物質(zhì)豐富的繁材,容易發(fā)生不定根?？旆痹囼灡砻?半木質(zhì)化的嫩枝,已積累較豐富的營養(yǎng)物質(zhì),快繁容易生根。一般不能用太幼嫩的枝條,因幼嫩枝條組織不夠健全,對周圍環(huán)境適應(yīng)能力差,特別是內(nèi)含營養(yǎng)物質(zhì)少

14、、水分多、抗病能力差,快繁后很容易腐爛死亡。二、繁材的質(zhì)量繁材內(nèi)積存的養(yǎng)分是快繁后形成新器官所需要的營養(yǎng)三、采集時期秋季采集好，還是夏季采集好？為什么？月季中的一些品種,在夏季嫩枝快繁,生根困難,而在秋后快繁,則較易生根。木槿在6月開花前進行嫩枝快繁,枝條質(zhì)量最好,快繁生根率非常高,根系也特別發(fā)達,生根率可達95%以上,但在7月后開花期繁殖則生根率低。因此,必須通過初試摸清快繁植物的最佳快繁時間,以提高繁材生根率。三、采集時期月季中的一些品種,在夏季嫩枝快繁,生根困難,而在四、繁材的大小、所帶葉片，及營養(yǎng)條件一般來說,繁材的生根能力在一定程度上隨繁材長度的增加而增強,但超過一定長度,生根率反而

15、會下降；宜在715 cm。對于當年生繁殖材料,一般繁材越粗壯,枝條內(nèi)貯藏營養(yǎng)越豐富,形成層生活力強,生根率也更高。實踐表明,當繁材葉面積超過一定限度,會出現(xiàn)不利于生根的現(xiàn)象。低氮對生根有利,而缺氮則可能抑制生根。所以,應(yīng)選用低氮高碳水化合物的枝條作繁材。四、繁材的大小、所帶葉片，及營養(yǎng)條件不同的外植體、不同的年齡以及不同的季節(jié)所采取的外植體,應(yīng)選擇相應(yīng)的消毒劑種類、消毒時間和消毒方法,以達到最大限度殺死微生物、最小程度損傷材料的最佳效果。目前,常用的消毒劑有酒精、雙氧水、氯化汞、次氯酸鈣、次氯酸鈉等。一般先用流水沖洗或用洗潔精洗去材料上的塵土和部分細菌,洗時注意不要損傷和弄掉其上幼小嫩芽,然后

16、放入接種室進行消毒并用無菌水沖洗莖尖、莖、葉片的消毒步驟:消毒前先用清水漂洗干凈或用軟毛刷將外植體上的塵埃刷除,茸毛較多的用皂液洗滌,然后用流動的清水洗去皂液,洗后用吸水紙吸干表面水分;進入無菌的接種室,用70%酒精浸泡外植體3060min;取出后馬上用0.1%0.2%氯化汞消毒1015min,或用10%次氯酸鈣飽和上清液浸泡1020 min,還可以用2%10%次氯酸鈉溶液浸泡615 min;消毒后用無菌水沖洗35次,用無菌紗布或無菌濾紙吸干水分后再接種。不同的外植體、不同的年齡以及不同的季節(jié)所采取的外植體,應(yīng)選擇試管苗不能立即適應(yīng)移栽環(huán)境,必須有一個馴化過程。一般不定根長度達1 cm左右,且

17、生長旺盛時,即可馴化(煉苗)。首先將生根試管苗移到溫室中,除去封口材料,使嫩苗與外界接觸,增強其對外界不良因素的抵抗力,此間逐漸增強光照,使苗粗壯,以利于移栽成活。一般煉苗35 d即可將長到一定大小(5 6片真葉或苗高45 cm)、生45條根的組織培養(yǎng)苗。試管苗不能立即適應(yīng)移栽環(huán)境,必須有一個馴化過程。洗掉苗上的培養(yǎng)基,移栽到保水、透氣性好的基質(zhì)或苗床土中。移栽后的組織培養(yǎng)苗前期宜生長在適溫、適濕的環(huán)境中,逐漸使其適應(yīng)外界環(huán)境。為使幼苗正常生長,每35天可葉面噴施營養(yǎng)液一次,710 d給基質(zhì)澆營養(yǎng)液一次。洗掉苗上的培養(yǎng)基,移栽到保水、透氣性好的基質(zhì)或苗床土中。若細胞分裂素濃度過高或細胞分裂素與

18、生長素相對含量高,培養(yǎng)基中離子種類、比例不適,瓊脂濃度低,溫度過低或過高,光照時間過長或通氣不良,易發(fā)生玻璃化現(xiàn)象減少和避免玻璃化苗出現(xiàn)的方法是:選擇適合的培養(yǎng)基,如適當降低培養(yǎng)基中細胞分裂素用量,提高Ca2+、Zn2+等離子濃度,降低N與Cl元素的比例,降低銨態(tài)氮濃度,適當提高培養(yǎng)基中蔗糖和瓊脂的濃度;改善培養(yǎng)環(huán)境,溫度光照適宜,用具濾層通氣孔的塑料封口膜封口改善通氣狀況,可減少玻璃化苗的產(chǎn)生。若細胞分裂素濃度過高或細胞分裂素與生長素相對含量高,培養(yǎng)基中影響褐化發(fā)生的主要因素:材料類型差異,一般木本植物單寧、色素含量高的易發(fā)生褐變;材料年齡、取材部位及時間差異,一般幼齡材料、幼嫩器官和組織、春季取外植體褐變發(fā)生較輕;外植體大小及受傷害程度,外植體太小、受傷害程度深、易引起褐變;培養(yǎng)基中6-BA或K