N-乙酰半胱氨酸蘿卜硫素通過微管斷裂抑制自噬導(dǎo)致非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞凋亡

1、N-乙酰半胱氨酸蘿卜硫素通過微管斷裂抑制自噬導(dǎo)致非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞凋亡目的 : 研究表明 , 蘿卜硫素 (sulforaphane,SFN)不僅抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和侵潤 , 而且誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。 近年來 , 我們實(shí)驗(yàn)室對 SFN的抗癌機(jī)制進(jìn)行了深入的研究 , 發(fā)現(xiàn) SFN通過紊亂微管發(fā)揮抗癌作用。但是到目前為止 SFN仍未應(yīng)用于臨床治療 , 這是因?yàn)槠湓隗w內(nèi)半衰期較短,只有 2 小時左右。 N-乙酰半胱氨酸蘿卜硫素(sulforaphane-N-Acetyl-Cysteine,SFN-NAC)是 SFN的衍生物 , 也是體內(nèi)代謝物 ,在體內(nèi)比 SFN具有更長的半衰期。由于 SFN-NAC能在肺

2、中富集 , 因此是一個潛在的靶向治療非小細(xì)胞肺癌(non-smallcelllung cancer,NSCLC)的藥物。本研究旨在探索SFN-NAC的潛在抗癌機(jī)制。方法 : 使用光鏡觀察 SFN-NAC對非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞形態(tài)的影響; 應(yīng)用 MTS細(xì)胞增殖分析實(shí)驗(yàn)檢測SFN-NAC對非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖的影響; 通過透射電子顯微鏡觀察細(xì)胞亞顯微結(jié)構(gòu) ; 使用 Western blot(蛋白免疫印跡法 ) 檢測胞內(nèi) p ERK、ERK、 Hsp70、 -tubulin、LC3以及 Stathmin-1蛋白的表達(dá) ; 應(yīng)用 si RNA 基因沉默技術(shù)敲低 Hsp70的表達(dá) , 檢測 Hsp70對下游

3、蛋白的調(diào)節(jié) ; 通過免疫共沉淀檢測Hsp70和 -tubulin的相互作用 ; 應(yīng)用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察微管形態(tài)、LC3點(diǎn)狀聚集以及 Hsp70 和 -tubulin的共定位 ; 通過免疫組化檢測肺癌組織芯片Hsp70和 -tubulin的的表達(dá) ; 使用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡。 結(jié)果 : 光鏡結(jié)果顯示 :SFN-NAC誘導(dǎo) NSCLC細(xì)胞形態(tài)改變 ; 細(xì)胞突起收縮、體積縮小、透明以及變圓。MTS結(jié)果顯示 :SFN-NAC抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549 和 SK-1 增殖。透射電子顯微鏡觀察顯示 : 在 SFN-NAC處理后的細(xì)胞中可見自噬體、自噬溶酶體、彌散性的空泡、核碎裂、核固縮以及凋亡

4、小體。Western blot顯示 :SFN-NAC上調(diào) p ERK1/2 和 Hsp70、下調(diào) -tubulin和Stathmin-1;此外 , 使用巴佛洛霉素 A1 抑制自噬體與溶酶體的融合后,SFN-NAC對LC3 II的表達(dá)并無影響。 組織芯片分析顯示 : -tubulin和 Hsp70 在非小細(xì)胞肺癌組織中高表達(dá) , 并與腫瘤的惡性程度分級呈正相關(guān)。激光掃描共聚焦顯微鏡觀察顯示:SFN-NAC增強(qiáng) -tubulin與 Hsp70共定位 ,并且誘導(dǎo)微管聚集和斷裂, 增加 LC3 點(diǎn)狀聚集。免疫共沉淀顯示 :SFN-NAC增強(qiáng) -tubulin與 Hsp70相互作用。此外 , 當(dāng)使用 s

5、i RNA 敲低 Hsp70的表達(dá)后 , 降低 SFN-NAC上調(diào)的 LC3 II,促進(jìn)凋亡。此外 , 使用自噬特異性抑制劑3-MA預(yù)處理細(xì)胞后 ,SFN-NAC誘導(dǎo)的凋亡細(xì)胞也顯著增加。結(jié)論 :SFN-NAC通過 Hsp70介導(dǎo)的微管聚集和斷裂調(diào)節(jié)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞自噬和凋亡。此研究有利于在亞細(xì)胞水平發(fā)現(xiàn)新的SFN-NAC的抗癌靶點(diǎn) , 揭露新的抗癌機(jī)制 , 開發(fā)高效低毒的抗癌藥物。目的 : 植物來源的蘿卜硫素 (SFN)能在多個階段抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展。但是SFN半衰期較短 , 這限制了其在臨床上的應(yīng)用。SFN衍生物 N-乙酰半胱氨酸蘿卜硫素(SFN-NAC)在體內(nèi)中具有較長的半衰期。我們前期

6、實(shí)驗(yàn)證實(shí)SFN-NAC能紊亂微管 , 抑制人前列腺癌細(xì)胞生長并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本研究旨在探索 SFN-NAC對非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞侵潤和遷移能力的影響。方法 :應(yīng)用 MTS細(xì)胞增殖分析實(shí)驗(yàn)檢測SFN-NAC對 SK-1 細(xì)胞增殖的影響 ; 通過激光掃描共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞微管分布以及LC3點(diǎn)狀聚集 ; 使用透射電子顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)自噬體和自噬溶酶體; 通過細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的遷移能力; 應(yīng)用transwell細(xì)胞體外侵潤實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的侵潤能力; 使用 si RNA基因沉默技術(shù)敲低 Tau 的表達(dá) ; 通過 Western blot檢測 LC3、Tau 以及 -tubulin的表達(dá)。結(jié)果 :MTS結(jié)

7、果顯示 :SFN-NAC在 20 M時有效的抑制了非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞SK-1 增殖。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和transwell侵潤實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示 : 在 15M時 SFN-NAC顯著抑制 SK-1 細(xì)胞的遷移和侵潤。透射電子顯微鏡結(jié)果顯示:15 M的 SFN-NAC也可引起細(xì)胞產(chǎn)生自噬體和自噬溶酶體。激光掃描共聚焦顯微鏡顯示:15 M的 SFN-NAC紊亂非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞微管分布 , 并增加 LC3的點(diǎn)狀聚集。Western blot結(jié)果顯示 :SFN-NAC上調(diào) LC3 II/LC3I, 以及微管相關(guān)蛋白Tau的表達(dá) , 并且下調(diào) -tubulin的表達(dá)。此外 , 當(dāng)使用 si RNA 敲低 Tau 的表達(dá)后 ,SFN-NAC上調(diào)的 LC3 II/LC3 I 明顯下降 , 并增強(qiáng)了 SFN-NAC對 SK-1 細(xì)胞遷移和侵潤的抑制。結(jié)論