與細(xì)胞衰老與癌變

1、第一頁(yè)，共七十五頁(yè)。55端粒消耗端粒維持細(xì)胞衰老細(xì)胞永生化染色體DNA端粒端粒第二頁(yè)，共七十五頁(yè)。 “人體的正常細(xì)胞經(jīng)過(guò)有限的分裂次數(shù)后即進(jìn)入衰老階段，停止增殖而最終走向衰亡。呈惡性生長(zhǎng)的癌細(xì)胞似乎擺脫了正常衰老過(guò)程的約束，在無(wú)拘無(wú)束地高速生長(zhǎng)中獲得“永生”。衰老和腫瘤相互對(duì)立卻又同為人類的“天敵”，兩者之間千絲萬(wàn)縷的關(guān)聯(lián)一直以來(lái)為人們所關(guān)注。 近年來(lái)端粒酶熱點(diǎn)的出現(xiàn)被認(rèn)為是聯(lián)結(jié)著腫瘤和衰老研究的一條全新紐帶，國(guó)際權(quán)威期刊單元、科學(xué)等逐年遞增地刊載相關(guān)論文和報(bào)道，對(duì)端粒和端粒酶這一研究方向予以相當(dāng)關(guān)注，認(rèn)為有可能對(duì)腫瘤、衰老等重大生命課題產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響?！钡谌?yè)，共七十五頁(yè)。目 錄端粒的結(jié)構(gòu)與功

2、能端粒酶的結(jié)構(gòu)與功能端粒、端粒酶與細(xì)胞衰老端粒、端粒酶與惡性腫瘤第四頁(yè)，共七十五頁(yè)。端粒的結(jié)構(gòu)與功能第五頁(yè)，共七十五頁(yè)。 二十世紀(jì)三十年代，Barbava McClintock和Hermann J.Muller發(fā)現(xiàn)，染色體的末端有一種能穩(wěn)定染色體結(jié)構(gòu)和功能的特殊成分。如果缺少了這種成分，染色體之間就會(huì)互相粘連、出現(xiàn)結(jié)構(gòu)的變化或其它錯(cuò)誤的行為，以致影響到染色體的生存和正確復(fù)制并進(jìn)一步威脅到細(xì)胞的存亡。于是從希臘文的末端（telos）和部分（meros）二詞為這種特殊的成分創(chuàng)造了一個(gè)全新的術(shù)語(yǔ)端粒（telomere）。 1 端粒的發(fā)現(xiàn)第六頁(yè)，共七十五頁(yè)。斷端降解、斷端融合、結(jié)構(gòu)功能破壞染色體DNA

3、X射線第七頁(yè)，共七十五頁(yè)。從希臘字的末端“telos”和部分“meros”創(chuàng)造了一個(gè)全新的單詞：端粒 telomere 端粒帽 染色體 端粒帽第八頁(yè)，共七十五頁(yè)。第九頁(yè)，共七十五頁(yè)。 端粒的精確組成則是在七十年代末才首次被提出。1978年，美國(guó)科學(xué)家Blackburn發(fā)現(xiàn)，單細(xì)胞池塘生物四膜蟲（Tetrahymena）的端粒是由一種極短的簡(jiǎn)單重復(fù)序列TTGGGG多次重復(fù)而成。 從那以后，包括動(dòng)物、植物和微生物在內(nèi)的多種生物的端粒序列已被確定，它們均是由富含G和T的簡(jiǎn)單重復(fù)序列不斷重復(fù)而成。2 端粒的精確組成第十頁(yè)，共七十五頁(yè)。1978年首次發(fā)現(xiàn)四膜蟲端粒的分子組成： 端粒 染色體DNA 端粒n

4、（CCCCAA）n（GGGGTT）35（TTGGGG）n（AACCCC）nn（CCCTAA）n（GGGATT）35（TTAGGG）n（AATCCC）n人端粒的分子組成：第十一頁(yè)，共七十五頁(yè)。 端粒帽 染色體DNA 端粒帽n（CCCCAA） （TTGGGG）nn（GGGGTT） （AACCCC）n353 端粒結(jié)合蛋白保護(hù)端粒不受核酸酶或化學(xué)修飾的作用一般是緊密的非共價(jià)鍵結(jié)合第十二頁(yè)，共七十五頁(yè)。人類纖毛蟲類第十三頁(yè)，共七十五頁(yè)。 隨著對(duì)端粒分子組成結(jié)構(gòu)的闡明，端粒對(duì)維護(hù)染色體完整性的功能已不是一個(gè)籠統(tǒng)的概念?；钴S在細(xì)胞中樞并當(dāng)擔(dān)著延續(xù)生命重任的染色體脫氧核糖核酸其實(shí)面臨的是一個(gè)“危機(jī)四伏”的境界

5、，它對(duì)外要抵御核酸酶等各種因素襲擊，對(duì)內(nèi)則有一個(gè)難以“自圓其身”的所謂“末端復(fù)制問(wèn)題”。端粒的存在正是扮演了一個(gè)衛(wèi)士的角色，它就象是一個(gè)盡忠職守的“生命衛(wèi)士”，不但避免了外界因素的入侵，而且在復(fù)制過(guò)程中，把基因組序列包裹在內(nèi)部，以犧牲自身而避免染色體結(jié)構(gòu)基因被侵蝕，從而防止了遺傳信息的丟失，維護(hù)了染色體結(jié)構(gòu)和功能的完整性。 4 端粒的功能第十四頁(yè)，共七十五頁(yè)。 對(duì)外: 抵御核酸酶等外界 對(duì)內(nèi): 染色體脫氧核糖核酸的 因素的襲擊 末端復(fù)制問(wèn)題保護(hù)染色體結(jié)構(gòu)和功能的完整性染色體第十五頁(yè)，共七十五頁(yè)。染色體脫氧核糖核酸的末端復(fù)制問(wèn)題： 3 553RNA引物 33RNA引物水解 即DNA復(fù)制過(guò)程不能自

6、始至終完整地復(fù)制整個(gè)線性染色體，而是每次都在其5末端留下一個(gè)空缺未能填補(bǔ)（即RNA引物降解），如果細(xì)胞沒有辦法添補(bǔ)這些空隙，染色體DNA將隨著每一次的細(xì)胞分裂而不斷縮短，直至這種缺隙侵蝕到染色體的結(jié)構(gòu)基因而使細(xì)胞消亡。第十六頁(yè)，共七十五頁(yè)。領(lǐng)頭鏈隨從鏈55第十七頁(yè)，共七十五頁(yè)。1)纖毛原蟲動(dòng)物四膜蟲：其巨核形成過(guò)程中，經(jīng)歷了端粒從無(wú)到有的發(fā)育過(guò)程。2) 酵母外源脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞后，在其末端形成新端粒的效率很高。5 端粒的研究體系第十八頁(yè)，共七十五頁(yè)。1）早期的原始復(fù)制模型2）端粒酶模型3）重組模型6 端粒的復(fù)制模型第十九頁(yè)，共七十五頁(yè)。端粒酶的結(jié)構(gòu)與功能第二十頁(yè)，共七十五頁(yè)。酵母細(xì)胞

7、酵母細(xì)胞酵母TS四膜蟲TSShampay的加尾實(shí)驗(yàn)1 端粒酶的發(fā)現(xiàn)第二十一頁(yè)，共七十五頁(yè)。 Blackburn的實(shí)驗(yàn)加熱或蛋白酶孵育四GT酵GTpBR322四CA孵育四膜蟲抽提物53第二十二頁(yè)，共七十五頁(yè)。1）端粒的加尾方向是按GT鏈從5端 3端。2）每次加一個(gè)重復(fù)單位。3）似為“無(wú)模板復(fù)制”。4）被加尾的末端序列具有特異性。5）催化加尾的應(yīng)是細(xì)胞抽提物中一種具有酶活性的物質(zhì)。實(shí)驗(yàn)推論第二十三頁(yè)，共七十五頁(yè)。2 端粒酶的結(jié)構(gòu)1987年，Blackburn 柱層析 RNP結(jié)構(gòu)四膜蟲端粒酶RNP含有RNA組分和蛋白質(zhì)組分，兩者均為酶活性所必需。對(duì)RNA酶極為敏感。 RNA組分Protein第二十四

8、頁(yè)，共七十五頁(yè)。Telomerase apocalypse-soon/images/telomere.gif第二十五頁(yè)，共七十五頁(yè)。第二十六頁(yè)，共七十五頁(yè)。 CAACCCCAACAACCCCAA端粒酶RNA1）CAACCCCAA結(jié)構(gòu)，有堿基修飾。2）反義RNA封閉，能抑制酶活性。反義RNA第二十七頁(yè)，共七十五頁(yè)。3）Greider的點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)：點(diǎn)突變端粒酶RNA序列CA第二十八頁(yè)，共七十五頁(yè)。端粒端粒酶CT T GCGCAT第二十九頁(yè)，共七十五頁(yè)。CAA第三十頁(yè)，共七十五頁(yè)。端粒酶蛋白質(zhì)1995年，首次從四膜蟲克隆到端粒酶蛋白質(zhì)組分： p80p95第三十一頁(yè)，共七十五頁(yè)。遺傳密碼堿基互補(bǔ)第三十

9、二頁(yè)，共七十五頁(yè)。人類端粒酶蛋白質(zhì)？同源序列核酸探針重組DNA分子第三十三頁(yè)，共七十五頁(yè)。TTGGGGTTGGGGTTGGGG55TTGGGGTTGGGGTTGGGGCCAACCCC 35oH35CCAACCCC35TTGGGGTTGGGGTTGGGGCCAACCCC2.聚合 1.結(jié)合$3.移位 爬行模式3 端粒酶的功能TTGGGGTTGGGGCCAACCCC第三十四頁(yè)，共七十五頁(yè)。末端補(bǔ)齊機(jī)制：5GGGGTT（GGGGTT）n端粒酶5G-G配對(duì)回折35DNA聚合酶第三十五頁(yè)，共七十五頁(yè)。4 端粒酶活性的測(cè)定第三十六頁(yè)，共七十五頁(yè)。1994年，Kim首創(chuàng)端粒重復(fù)擴(kuò)增法（TRAP）。第三十七頁(yè)，

10、共七十五頁(yè)。陷阱的電泳檢測(cè)梯形條帶加樣孔第三十八頁(yè)，共七十五頁(yè)。TS引物CX引物細(xì)胞提取物端粒重復(fù)序列PCR擴(kuò)增產(chǎn)物第三十九頁(yè)，共七十五頁(yè)。 T4g32,RnasinTRAP bufferdNTPs細(xì)胞提取物TS 引物Taq ECX 引物2325 30 minPCR儀第四十頁(yè)，共七十五頁(yè)。第四十一頁(yè)，共七十五頁(yè)。生物素親和素地高辛酶標(biāo)抗地高辛抗體酶標(biāo)儀檢測(cè)半定量第四十二頁(yè)，共七十五頁(yè)。第四十三頁(yè)，共七十五頁(yè)。第四十四頁(yè)，共七十五頁(yè)。第四十五頁(yè)，共七十五頁(yè)。第四十六頁(yè)，共七十五頁(yè)。端粒、端粒酶與細(xì)胞衰老第四十七頁(yè)，共七十五頁(yè)。 In human blood cells, the length o

11、f telomeres ranges from 8,000 base pairs at birth to 3,000 base pairs as people age and as low as 1,500 in elderly people. (An entire chromosome has about 150 million base pairs.) Each time a cell divides, an average person loses 30 to 200 base pairs from the ends of that cells telomeres.第四十八頁(yè)，共七十五頁(yè)

12、。第四十九頁(yè)，共七十五頁(yè)。In most somatic tissues, telomerase is expressed at very low levels or not at all - as cells divide, telomeres shorten. Short telomeres may be a signal for cells to senesce (stop dividing).Telomerase and Senescence第五十頁(yè)，共七十五頁(yè)。染色體端粒端粒端粒與細(xì)胞存亡密切相關(guān)第五十一頁(yè)，共七十五頁(yè)。細(xì)胞分裂細(xì)胞分裂端粒長(zhǎng)短與細(xì)胞生命歷程密切相關(guān)染色體端粒端粒細(xì)胞

13、將停止分裂而趨于老化第五十二頁(yè)，共七十五頁(yè)。細(xì)胞分裂細(xì)胞分裂染色體端粒端粒細(xì)胞將停止分裂而趨于老化第五十三頁(yè)，共七十五頁(yè)。1）培養(yǎng)細(xì)胞： 端粒長(zhǎng)度隨分裂次數(shù)增多而縮短。 端粒長(zhǎng)度和細(xì)胞分化程度呈反比。2）人體： 端粒平均長(zhǎng)度隨年齡增大而變短。 體細(xì)胞端粒長(zhǎng)度大大短于生殖細(xì)胞。相關(guān)實(shí)驗(yàn)證據(jù)第五十四頁(yè)，共七十五頁(yè)。端粒酶與細(xì)胞存亡端粒酶端粒 端粒酶催化端粒不斷延長(zhǎng)，從而抵消因染色體復(fù)制、細(xì)胞分裂導(dǎo)致的脫氧核糖核酸縮短，使得染色體脫氧核糖核酸完好無(wú)損，細(xì)胞能夠順利地分裂繁殖。第五十五頁(yè)，共七十五頁(yè)。相關(guān)實(shí)驗(yàn)證據(jù)：1）四膜蟲： 端粒酶改變時(shí)端?？s短、細(xì)胞死亡。2）酵母： 端粒酶基因突變導(dǎo)致端粒變短、細(xì)

14、胞衰老。第五十六頁(yè)，共七十五頁(yè)。端粒酶基因突變導(dǎo)致端粒變短、細(xì)胞衰老培養(yǎng)細(xì)胞中端粒長(zhǎng)度隨分裂次數(shù)增多而縮短端粒長(zhǎng)度與細(xì)胞的年齡呈負(fù)相關(guān)端粒長(zhǎng)度和細(xì)胞分化程度呈反比Estl突變體酵母活性下降，出現(xiàn)明顯衰老四膜蟲端粒酶改變時(shí)端?？s短、細(xì)胞死亡體細(xì)胞端粒長(zhǎng)度大大短于生殖細(xì)胞端粒平均長(zhǎng)度隨生物體年齡增大而變短。第五十七頁(yè)，共七十五頁(yè)。 正常人體細(xì)胞缺乏端粒酶活性。與其他有端粒酶活性的生物體細(xì)胞相比,人體細(xì)胞具有很長(zhǎng)的端粒。人的胚胎細(xì)胞具有明顯可探測(cè)的端粒酶活性。人的端粒與端粒酶第五十八頁(yè)，共七十五頁(yè)。端粒 染色體脫氧核糖核酸端粒端粒酶端粒酶胚胎期第五十九頁(yè)，共七十五頁(yè)。 “人體細(xì)胞中端粒酶合成和延長(zhǎng)端

15、粒的作用是在胚系細(xì)胞中完成的，當(dāng)胚胎發(fā)育完成以后，端粒酶活性就被抑制。即在胚胎發(fā)育時(shí)期獲得的端粒，應(yīng)已足夠維系人體的整個(gè)生命過(guò)程中因細(xì)胞分裂所致的端?？s短。 所以， 當(dāng)人體出生以后，染色體端粒就象是一個(gè)伴隨著細(xì)胞分裂繁殖的“生命之鐘”，它歷數(shù)著細(xì)胞可分裂的次數(shù)同時(shí)也見證了細(xì)胞由旺盛地生長(zhǎng)繁殖到走向衰老死亡的整個(gè)生命歷程?！钡诹?yè)，共七十五頁(yè)。 正常細(xì)胞：細(xì)胞分裂細(xì)胞分裂 衰老死亡 細(xì)胞年輕化 端粒酶 重新引入抗衰老第六十一頁(yè)，共七十五頁(yè)。端粒、端粒酶與惡性腫瘤第六十二頁(yè)，共七十五頁(yè)。 1996年，著名的端粒（酶）研究專家Blackburn和Greider在總結(jié)端粒（酶）研究歷程中曾說(shuō)過(guò)一句頗

16、為耐人尋味的話：在自然界中，你永遠(yuǎn)也無(wú)法想象，海底中的一塊巖石也許是一片生命的綠葉，公園里的一朵鮮花可能就是一株劇毒的惡蟲。第六十三頁(yè)，共七十五頁(yè)。第六十四頁(yè)，共七十五頁(yè)。細(xì)胞分裂細(xì)胞分裂細(xì)胞衰老端粒酶永生化抗腫瘤靶點(diǎn)第六十五頁(yè)，共七十五頁(yè)。Telomerase and CancerThe presence of telomerase in cancer cells allows them to maintain telomere length while they proliferate第六十六頁(yè)，共七十五頁(yè)。 1 端粒酶活性特異表達(dá)于惡性細(xì)胞（-） （-） 正常細(xì)胞 良性腫瘤 惡性腫瘤1994年，Kim 創(chuàng)立“TRAP” 法檢測(cè)端粒酶活性。第六十七頁(yè)，共七十五頁(yè)。2 端粒酶特異性表達(dá)于惡性細(xì)胞的成因解釋性研究： 衰老死亡誘導(dǎo)蛋白端粒極度縮短，細(xì)胞死亡細(xì)胞永生化第六十八頁(yè)，共七十五頁(yè)。P53基因、Rb基因介導(dǎo)細(xì)胞衰老P53基因、Rb基因突變細(xì)胞繼續(xù)分裂至“危象期”大量細(xì)胞死亡 少量細(xì)胞“永生化”（端粒酶活化）（端?？s短）第六十九頁(yè)，共七十五