免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)及熒光定量PCR培訓(xùn)課件

1、免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)及熒光定量PCR免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)及熒光定量PCR內(nèi)容提要抗原和抗體ELISAWestern blot免疫組化（免疫熒光）Real Time PCR2免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)及熒光定量PCR內(nèi)容提要抗原和抗體2免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)及熒光定量PCR抗原和抗體抗原的基本知識(shí)抗體的基本知識(shí)多克隆抗體單克隆抗體3免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)及熒光定量PCR抗原和抗體抗原的基本知識(shí)3免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)及熒光定量PCR抗原和抗體抗原的基本知識(shí)定義：抗原（antigen）是能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答的效應(yīng)物質(zhì)（抗體和致敏淋巴細(xì)胞），并能與之特異性結(jié)合的物質(zhì)。兩個(gè)基本特性： 免疫原性（immunogenicity）：能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生抗

2、體和效應(yīng)T淋巴細(xì)胞的免疫反應(yīng)能力。 抗原性（antigenicity）：與免疫反應(yīng)最終產(chǎn)物（如抗體和/或T細(xì)胞表面受體）特異結(jié)合的能力。完全抗原與半抗原抗原表位（Epitopes）：抗原決定簇。存在于抗原分子中，決定抗原特異性的基本結(jié)構(gòu)或化學(xué)基團(tuán)。是與TCR/BCR及抗體結(jié)合的基本單位。4免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)及熒光定量PCR抗原和抗體抗原的基本知識(shí)定義：抗原（antigen）是能夠刺抗原和抗體抗體的基本知識(shí)定義：antibody。指機(jī)體的免疫系統(tǒng)在抗原刺激下，由B淋巴細(xì)胞或記憶細(xì)胞增殖分化成的漿細(xì)胞所產(chǎn)生的、可與抗原發(fā)生特異性結(jié)合的免疫球蛋白。結(jié)構(gòu)與功能： 1）重鏈輕鏈； 2）超變區(qū)是抗原結(jié)合位，與

3、抗原表位互補(bǔ)； 3）抗體Fc片段上兩結(jié)構(gòu)域共同與細(xì)胞膜Fc受體結(jié)合，發(fā)揮不同的生物學(xué)效應(yīng)。應(yīng)用醫(yī)學(xué)應(yīng)用：1.診斷：各類(lèi)血清學(xué)檢測(cè)，抗人球蛋白測(cè)試，早孕檢測(cè)等。2.治療：?jiǎn)慰寺】贵w療法（類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎多發(fā)性硬化癥等），腫瘤治療。科研應(yīng)用：免疫共沉淀、免疫印跡、染色質(zhì)免疫共沉淀、免疫熒光技術(shù)、ELISA等。5免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)及熒光定量PCR抗原和抗體抗體的基本知識(shí)定義：antibody。指機(jī)體的免疫抗原和抗體多克隆抗體抗原多個(gè)表位誘導(dǎo)多種B細(xì)胞克隆增殖與分化，產(chǎn)生多種抗體的混合物。特點(diǎn)：多抗是單抗的混合物，群體綜合的性質(zhì)。更容易捕捉抗原。特異性相對(duì)較差：交叉反應(yīng)抗體的純化、標(biāo)記難。6免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)及

4、熒光定量PCR抗原和抗體多克隆抗體抗原多個(gè)表位誘導(dǎo)多種B細(xì)胞克隆增殖與分化抗原和抗體多克隆抗體制備動(dòng)物選擇：兔子（rabbit）：最常用于自制抗體，抗體量較多。（新西蘭,大耳白）小鼠（mouse）：可用于自制抗體，但抗體量很少。（BALB/C,昆明鼠）大鼠（rat）：可用于自制抗體，免疫過(guò)程要麻醉動(dòng)物。（Wistar大鼠）羊（sheep、goat）：常用于較大批量地生產(chǎn)抗體（商品）。馬（horse）：常用于大批量生產(chǎn)治療用抗體（商品）。豚鼠（guinea pig）：國(guó)外實(shí)驗(yàn)室常用。7免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)及熒光定量PCR抗原和抗體多克隆抗體制備動(dòng)物選擇：7免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)及熒光定量抗原和抗體多克隆抗體制

5、備延長(zhǎng)抗原的作用時(shí)間增強(qiáng)吞噬作用刺激抗原提呈促進(jìn)細(xì)胞因子分泌誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞分裂、增殖影響T細(xì)胞“極化”佐劑的作用機(jī)理：抗原制備：商品化或自行表達(dá)基礎(chǔ)免疫：首次，抗原用量大，用弗式完全佐劑（含礦物油,卡介苗等)。加強(qiáng)免疫：第2次以后，抗原量減半，多次，間隔2-4周，用弗式不完全佐劑(不含卡介苗).取血測(cè)效價(jià)： 加強(qiáng)免疫兩次或三次以后的第7天取血。放血制備血清：可一次放血(頸動(dòng)脈)也可多次取血(耳靜脈)過(guò)程（簡(jiǎn)單了解）：8免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)及熒光定量PCR抗原和抗體多克隆抗體制備延長(zhǎng)抗原的作用時(shí)間促進(jìn)細(xì)胞因子分泌佐抗原和抗體單克隆抗體單個(gè)抗原表位誘導(dǎo)單種B細(xì)胞克隆增生與分化，產(chǎn)生單克隆抗體。什么情況下需

6、要制備單克隆抗體？目的蛋白有結(jié)構(gòu)類(lèi)似物抗原不純，無(wú)法分開(kāi)多抗效果不好（已排除非特異性反應(yīng)）希望將抗體用于治療，研制成藥品希望將抗體用于診斷，研制成診斷試劑9免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)及熒光定量PCR抗原和抗體單克隆抗體單個(gè)抗原表位誘導(dǎo)單種B細(xì)胞克隆增生與分化ELISA基本原理方法種類(lèi)實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)用常見(jiàn)問(wèn)題分析寫(xiě)作實(shí)例10免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)及熒光定量PCRELISA基本原理10免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)及熒光定量PCRELISA基本原理全稱(chēng)：酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay）原理：（1）固相的抗原或抗體，即“免疫吸附劑”；（2）酶標(biāo)記的抗原或抗體，稱(chēng)為“結(jié)合物” ； 辣根

7、過(guò)氧化物酶（HRP）、堿性磷酸酶（AP）（3）酶反應(yīng)的底物。11免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)及熒光定量PCRELISA基本原理全稱(chēng)：酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（Enzyme-LiELISA方法種類(lèi)直接法檢測(cè)Ag將抗原直接固定在固相載體上，加入酶標(biāo)記的一級(jí)抗體，即可測(cè)定抗原總量。優(yōu)勢(shì)：操作手續(xù)簡(jiǎn)短，因無(wú)須使用二抗可避免交互反應(yīng)。缺點(diǎn)：實(shí)驗(yàn)中的一抗都得用酶標(biāo)記，但不是每種抗體都適合做標(biāo)記，費(fèi)用相對(duì)提高。12免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)及熒光定量PCRELISA方法種類(lèi)直接法檢測(cè)Ag將抗原直接固定在固相載體ELISA方法種類(lèi)間接法檢測(cè)Ab用已知抗原包被，加入待測(cè)血清，再加酶標(biāo)二抗，加底物顯色。優(yōu)勢(shì)：二抗可以加強(qiáng)信號(hào)，而且有多種選擇能做不

8、同的測(cè)定分析。不加酶標(biāo)記的一級(jí)抗體則能保留它最多的免疫反應(yīng)性。缺點(diǎn)：交互反應(yīng)發(fā)生的機(jī)率較高。13免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)及熒光定量PCRELISA方法種類(lèi)間接法檢測(cè)Ab用已知抗原包被，加入待測(cè)ELISA方法種類(lèi)雙抗體夾心法檢測(cè)Ag將已知抗體連接在固相載體上，待測(cè)抗原與抗體結(jié)合后再與酶標(biāo)二抗結(jié)合，形成抗體-待測(cè)抗原-酶標(biāo)二抗的復(fù)合物，復(fù)合物的形成量與待測(cè)抗原成正比。適用于某些大分子的具有至少雙表位的抗原，而不能用于小分子半抗原的檢測(cè)。優(yōu)勢(shì)：高靈敏、高專(zhuān)一性，抗原無(wú)須事先純化。缺點(diǎn)：抗原一定得擁有兩個(gè)以上的抗體結(jié)合部位。14免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)及熒光定量PCRELISA方法種類(lèi)雙抗體夾心法檢測(cè)Ag將已知抗體連接在

9、固ELISA方法種類(lèi)其他方法雙抗原夾心法、競(jìng)爭(zhēng)法、捕獲法、基于細(xì)胞法酶底物顏色HRP3,3,5,5-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)+H2O2黃色(450nm)鄰苯二胺(OPD)+H2O2橙紅(429nm)5-氨基水楊酸(5-ASA)+H2O2棕色(550nm)魯咪諾+H2O2熒光AP對(duì)硝基苯磷酸酯(P-NPP)黃色(405nm)4-甲基傘基磷酸酯(4-MuP)熒光-半乳糖苷酶4-甲基傘基-半乳糖苷熒光15免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)及熒光定量PCRELISA方法種類(lèi)其他方法雙抗原夾心法、競(jìng)爭(zhēng)法、捕獲法、基于ELISA實(shí)驗(yàn)操作包被：聚苯乙烯板封閉： 0.12%BSA，5%脫脂奶粉，1%明膠，10%小牛血清孵育：加抗原

10、/抗體洗滌：PBST、TBST、PBS等顯色：避光發(fā)色結(jié)果測(cè)定：吸光值 待測(cè)孔（P）與陰性對(duì)照孔（N）的比值（P：N）大于1.5或2者為陽(yáng)性。16免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)及熒光定量PCRELISA實(shí)驗(yàn)操作包被：聚苯乙烯板16免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)及熒光定ELISA應(yīng)用ELISA應(yīng)用的范圍很廣，而且正在不斷地?cái)U(kuò)大，原則上ELISA可用于檢測(cè)一切抗原、抗體及半抗原，可以直接定量測(cè)定體液中的可溶性抗原。 檢查抗原和半抗原方面：在內(nèi)分泌方面已經(jīng)用于檢測(cè)雌性激素、絨毛膜促性腺激素、黃體素、胰島素、皮質(zhì)醇、促甲狀腺素和孕酮等；在血液學(xué)方面可用于檢查凝固因子（如第凝固因子）、紅細(xì)胞抗原及結(jié)合球蛋白（Hapto Globin）

11、等；在腫瘤方面已試用檢查甲胎蛋白（AFP）癌胚抗原（CEA）。檢查抗體方面：用ELISA間接法檢查抗體，已獲得對(duì)多種傳染病和寄生蟲(chóng)病的血清學(xué)診斷，亦開(kāi)始廣泛用于現(xiàn)場(chǎng)流行病學(xué)調(diào)查。在寄生蟲(chóng)病方面，它用于對(duì)瘧原蟲(chóng)、阿米巴、利日曼原蟲(chóng)、錐蟲(chóng)、血吸蟲(chóng)、囊蟲(chóng)、弓漿蟲(chóng)、肺吸蟲(chóng)、肝吸蟲(chóng)、血絲蟲(chóng)、旋毛蟲(chóng)病等血清學(xué)診斷；在免疫性疾病方面有試用作自身疫病抗體測(cè)定以及對(duì)過(guò)敏的診斷，例如檢測(cè)各種過(guò)敏原的抗體、DNA抗體及甲狀腺球蛋白抗體，紅斑性痕瘡抗體等等；在衛(wèi)生學(xué)方面，可用于檢測(cè)食品中葡萄球菌腸毒素及沙門(mén)氏菌毒素等等。 17免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)及熒光定量PCRELISA應(yīng)用ELISA應(yīng)用的范圍很廣，而且正在不斷地?cái)U(kuò)大，E

12、LISA常見(jiàn)問(wèn)題分析陰性對(duì)照出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果試劑或樣品可能被污染，或者由于孔之間的濺灑出現(xiàn)交叉污染。酶標(biāo)板洗板不徹底。抗體量過(guò)多導(dǎo)致非特異結(jié)合。夾心法、捕獲法中檢測(cè)抗體與包被抗體/抗原交互反應(yīng)。酶標(biāo)板整體背景高抗體非特異性結(jié)合。底物結(jié)合濃度過(guò)高或反應(yīng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。底物溶液不新鮮或被污染。底物孵育過(guò)程沒(méi)有避光。吸光度數(shù)值偏高或偏低樣品中待檢抗原含量太低會(huì)導(dǎo)致測(cè)試結(jié)果偏低。加入抗體量不合適也會(huì)造成結(jié)果偏低或偏高孵育時(shí)間不夠長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果偏低孵育溫度不適合。18免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)及熒光定量PCRELISA常見(jiàn)問(wèn)題分析陰性對(duì)照出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果18免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)ELISA寫(xiě)作實(shí)例詳細(xì)描述IF = 3.53419免疫學(xué)

13、實(shí)驗(yàn)技術(shù)及熒光定量PCRELISA寫(xiě)作實(shí)例詳細(xì)描述IF = 3.53419免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)ELISA寫(xiě)作實(shí)例抗體濃度抗原種類(lèi)AbsIF = 3.53420免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)及熒光定量PCRELISA寫(xiě)作實(shí)例抗體濃度抗原種類(lèi)AbsIF = 3.534ELISA寫(xiě)作實(shí)例引用文獻(xiàn)21免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)及熒光定量PCRELISA寫(xiě)作實(shí)例引用文獻(xiàn)21免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)及熒光定量PCRELISA寫(xiě)作實(shí)例濃度時(shí)間22免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)及熒光定量PCRELISA寫(xiě)作實(shí)例濃度時(shí)間22免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)及熒光定量PCRELISA寫(xiě)作實(shí)例操作手冊(cè)23免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)及熒光定量PCRELISA寫(xiě)作實(shí)例操作手冊(cè)23免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)及熒光定量PCRE

14、LISA寫(xiě)作實(shí)例濃度組別24免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)及熒光定量PCRELISA寫(xiě)作實(shí)例濃度組別24免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)及熒光定量PCRWestern blot定義及原理應(yīng)用實(shí)驗(yàn)操作常見(jiàn)問(wèn)題分析半定量分析寫(xiě)作實(shí)例25免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)及熒光定量PCRWestern blot定義及原理25免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)及熒光定定義及原理定義：又稱(chēng)免疫印跡，是指將蛋白樣品轉(zhuǎn)移到固相載體上，而后 利用相應(yīng)的抗體來(lái)檢測(cè)目的蛋白的一種方法。原理：Western blot26免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)及熒光定量PCR定義及原理定義：又稱(chēng)免疫印跡，是指將蛋白樣品轉(zhuǎn)移到固相載體上應(yīng)用Western blotWestern Blot 被廣泛地應(yīng)用于蛋白質(zhì)研究，

15、基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)的研究。目的蛋白的表達(dá)特性分析目的蛋白與其它蛋白的互作目的蛋白的組織定位目的蛋白的半定量分析27免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)及熒光定量PCR應(yīng)用Western blotWestern Blot 被廣泛實(shí)驗(yàn)操作Western blot轉(zhuǎn)膜免疫反應(yīng)顯色或發(fā)光蛋白定量SDS蛋白提取封閉28免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)及熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)操作Western blot轉(zhuǎn)膜免疫反應(yīng)顯色或發(fā)光蛋白定實(shí)驗(yàn)操作Western blot步驟一、蛋白提取 WB過(guò)程中最重要的一點(diǎn)就是確定目的蛋白在組織、細(xì)胞中的定位，選擇合適的提取方法把目的蛋白提取出來(lái)才能進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。 防止蛋白質(zhì)的降解 冰上操作 加入蛋白酶抑制劑 Bac-

16、細(xì)菌蛋白抽提試劑 Mam-哺乳動(dòng)物蛋白抽提試劑 Yea-酵母蛋白抽提試劑 Tis-組織蛋白抽提試劑 Nc-細(xì)胞核/漿蛋白抽提試劑29免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)及熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)操作Western blot步驟一、蛋白提取 WB過(guò)程中實(shí)驗(yàn)操作Western blot步驟二、蛋白定量30免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)及熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)操作Western blot步驟二、蛋白定量30免疫學(xué)實(shí)實(shí)驗(yàn)操作Western blot步驟三、SDSESDS 是一種離子性的表面活性劑,它有強(qiáng)離子性的硫酸根離子也帶有疏水性的長(zhǎng)碳鏈。當(dāng) SDS 與蛋白質(zhì)混合時(shí)，它會(huì)以其碳鏈與蛋白質(zhì)的疏水性氨基酸結(jié)合將蛋白質(zhì)包起來(lái),而以磺酸根離子外露與水分子

17、作用。大多數(shù)蛋白質(zhì)和 SDS 的平均結(jié)合量是 1:1.4 (以重量為單位)，而蛋白質(zhì)結(jié)合固定比例的SDS 后 ，由于 SDS 帶強(qiáng)負(fù)電荷，使蛋白質(zhì)原先所帶電荷顯得微不足道,且每單位重量的蛋白質(zhì)所帶電荷一致 ，所以不同蛋白質(zhì)的遷移率大小就主要由蛋白分子大小這一主要因素決定。31免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)及熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)操作Western blot步驟三、SDSES實(shí)驗(yàn)操作Western blot步驟三、SDS凝膠濃度與蛋白分離范圍凝膠濃度（）線性分離范圍（KD)1512-431016-687.536-945.057-212Staking gelSeparating gel32免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)及熒光定量PC

18、R實(shí)驗(yàn)操作Western blot步驟三、SDS凝膠實(shí)驗(yàn)操作Western blot步驟四、轉(zhuǎn)膜 膜的選擇： NC、PVDF、尼龍膜 轉(zhuǎn)膜方法： 半干轉(zhuǎn)、濕轉(zhuǎn) 轉(zhuǎn)膜確認(rèn)： 立春紅染色、蛋白預(yù)染Marker33免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)及熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)操作Western blot步驟四、轉(zhuǎn)膜 膜的選擇：33實(shí)驗(yàn)操作Western blot步驟四、轉(zhuǎn)膜34免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)及熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)操作Western blot步驟四、轉(zhuǎn)膜34免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技實(shí)驗(yàn)操作Western blot步驟四、轉(zhuǎn)膜半干轉(zhuǎn) 用濾紙吸Buffer來(lái)做轉(zhuǎn)移體系的轉(zhuǎn)移方法； 適合轉(zhuǎn)移小分子量的蛋白； 半干轉(zhuǎn)的電流大小是按照面積來(lái)算的，時(shí)間是

19、根據(jù) 蛋白分子大小定的； 56mA/膜 1h 濕轉(zhuǎn) 將膜、膠、濾紙整個(gè)浸泡在Buffer的Tank里轉(zhuǎn)移的 方法； 適合轉(zhuǎn)移大分子量（100KD以上）蛋白； 濕轉(zhuǎn)電流是恒定的，時(shí)間也是根據(jù)分子量而定； 300mA 1h35免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)及熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)操作Western blot步驟四、轉(zhuǎn)膜半干轉(zhuǎn) 35免實(shí)驗(yàn)操作Western blot步驟四、轉(zhuǎn)膜麗春紅可逆染色，檢測(cè)轉(zhuǎn)膜效率。與下游WB檢測(cè)完全兼容，無(wú)任何干擾。蛋白預(yù)染Marker實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)分子量參照與目的蛋白同時(shí)轉(zhuǎn)移至印跡膜上，檢測(cè)轉(zhuǎn)膜效率。對(duì)轉(zhuǎn)膜后的凝膠進(jìn)行考染轉(zhuǎn)膜確認(rèn)36免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)及熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)操作Western blot步

20、驟四、轉(zhuǎn)膜麗春紅轉(zhuǎn)膜確認(rèn)3實(shí)驗(yàn)操作Western blot步驟五、封閉為防止一抗或/和二抗與膜的非特異性結(jié)合產(chǎn)生的高背景，因此需要進(jìn)行膜的封閉，去除非特異結(jié)合位點(diǎn)。常用的封閉液：Blocking Buffer ：3% BSA 5% MilkRoom Temperature 1 h 37免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)及熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)操作Western blot步驟五、封閉為防止一抗或/和實(shí)驗(yàn)操作Western blot步驟六、抗體孵育一抗選擇：?jiǎn)慰寺】贵w 或者 多克隆抗體直接標(biāo)記的抗體 或者 未標(biāo)記的抗體抗體所檢測(cè)的種屬：人、小鼠、大鼠等注意：抗體的稀釋倍數(shù)是由底物和待檢測(cè)蛋白質(zhì)的豐度決定的，為了獲得最佳實(shí)

21、驗(yàn)結(jié)果，強(qiáng)烈推薦進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，以確定具體的實(shí)驗(yàn)參數(shù).38免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)及熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)操作Western blot步驟六、抗體孵育一抗選擇：注實(shí)驗(yàn)操作Western blot步驟六、抗體孵育 二抗的選擇：抗小鼠抗兔抗大鼠抗人抗山羊抗雞抗豚鼠抗馬標(biāo)記物HRP、AP、Biotin、熒光標(biāo)記、無(wú)標(biāo)記熒光標(biāo)記抗體紅色Cy3、TRITC、RRX、Texas Red X、Dylight549、Dylight 594、Dylight 649綠色FITC、Cy2、Dylight488藍(lán)色AMCA近紅外線Cy5根據(jù)一抗物種：根據(jù)標(biāo)記物：39免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)及熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)操作Western blot步驟六、

22、抗體孵育 二抗的選擇實(shí)驗(yàn)操作Western blot步驟七、檢測(cè)方法化學(xué)發(fā)光法： 常用HRP酶標(biāo)系統(tǒng)的顯色底物為ECL魯米諾（Luminol） 特點(diǎn)：無(wú)毒害、靈敏度高、速度快；特異性好、節(jié)省抗體、線性寬； 可重新剝離檢測(cè)。化學(xué)顯色法： 常用酶標(biāo)系統(tǒng)HRP的顯色底物為T(mén)MB和DAB 酶標(biāo)系統(tǒng)AP的顯色底物為BCIP和NBT 特點(diǎn)：方便、便宜； 具有一定毒性、靈敏度較低、反應(yīng)速度慢； 檢測(cè)后的膜不可重新剝離檢測(cè)。40免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)及熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)操作Western blot步驟七、檢測(cè)方法化學(xué)發(fā)光法：實(shí)驗(yàn)操作Western blot步驟七、檢測(cè)方法41免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)及熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)操作We

23、stern blot步驟七、檢測(cè)方法41免疫學(xué)實(shí)常見(jiàn)問(wèn)題分析Western blot沒(méi)有陽(yáng)性條帶或很弱可能原因一抗、二抗等不匹配一抗或/和二抗?jié)舛鹊娃D(zhuǎn)膜不充分,或洗膜過(guò)度過(guò)度封閉二抗受疊氮鈉抑制曝光時(shí)間過(guò)短封閉劑與一抗或二抗有交叉反應(yīng)驗(yàn)證或解決辦法認(rèn)真選取一抗與組織種屬,可設(shè)置內(nèi)參以驗(yàn)證二級(jí)檢測(cè)系統(tǒng)的有效性。使用溫和的去污劑，如TWEEN20，或更換封閉劑（常用的脫脂奶、BSA、血清或明膠延長(zhǎng)曝光時(shí)間所用溶液和容器中避免含有疊氮鈉(HRP的抑制劑)更換合適的封閉劑、降低封閉劑濃度或減少封閉時(shí)間使用麗春紅S檢測(cè)轉(zhuǎn)膜效果,PVDF膜需浸透，需正確的轉(zhuǎn)膜操作,勿過(guò)度洗膜增加抗體濃度，延長(zhǎng)孵育時(shí)間42

24、免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)及熒光定量PCR常見(jiàn)問(wèn)題分析Western blot沒(méi)有陽(yáng)性條帶或很弱可能原常見(jiàn)問(wèn)題分析Western blot背景高一抗或二抗與封閉劑 有交叉反應(yīng)可能原因封閉不充分一抗?jié)舛冗^(guò)高抗體孵育溫度過(guò)高二抗非特異性結(jié)合洗膜不充分膜干燥驗(yàn)證或解決辦法延長(zhǎng)封閉時(shí)間， 更換合適的封閉劑（脫脂奶粉，BSA，血清等）增加一抗稀釋倍數(shù), 低溫孵育（如4)設(shè)置二抗對(duì)照(不加一抗),降低二抗?jié)舛?在孵育和洗滌液中加入Tween-20 以減少交叉反應(yīng).增加洗滌次數(shù)保證充分的反應(yīng)液，避免出現(xiàn)干膜現(xiàn)象43免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)及熒光定量PCR常見(jiàn)問(wèn)題分析Western blot背景高一抗或二抗與封閉劑常見(jiàn)問(wèn)題分析We

25、stern blot條帶位置不對(duì)可能原因表達(dá)的蛋白具有多種修飾形式（乙?；?、磷酸化、甲基化、烷基化、等） 蛋白樣本降解一抗?jié)舛冗^(guò)高二抗?jié)舛冗^(guò)高，產(chǎn)生的非特異性結(jié)合抗體未純化蛋白存在二聚體或多聚體驗(yàn)證或解決辦法查文獻(xiàn)，使用去修飾的試劑使蛋白恢復(fù)其正確的大小使用新鮮制備的標(biāo)本，并使用蛋白酶抑制劑 降低抗體濃度，可以減少非特異性條帶 降低抗體濃度，增加二抗對(duì)照，選擇特異性更強(qiáng)，只針對(duì)重鏈的二抗 使用單克隆或親和純化的抗體，減少非特異條帶 SDS電泳上樣前，煮沸10min，以增強(qiáng)蛋白質(zhì)解聚變性44免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)及熒光定量PCR常見(jiàn)問(wèn)題分析Western blot條帶位置不對(duì)可能原因表達(dá)Western

26、blot半定量分析灰度分析軟件：Quantity One、BandScan、BandLeader、Sigma Gel、Image J等常用的蛋白質(zhì)內(nèi)參有GAPDH和細(xì)胞骨架蛋白beta-actin或beta-tubulin。 內(nèi)參：一般是指由管家基因編碼表達(dá)的蛋白。 在各組織和細(xì)胞中的表達(dá)相對(duì)恒定，借助檢測(cè)每個(gè)樣品內(nèi)參的量就可以用于校正蛋白質(zhì)定量、上樣過(guò)程中存在的實(shí)驗(yàn)誤差，保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。 目的蛋白的灰度值除以內(nèi)參的灰度值以校正誤差，所得結(jié)果代表某樣品的目的蛋白相對(duì)含量。45免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)及熒光定量PCRWestern blot半定量分析灰度分析軟件：常用的蛋白質(zhì)ELISA與Wester

27、n blot比較Western blot 可以看到特異性的條帶，但是定量比較麻煩；ELISA可以直接讀出濃度，但是如果抗體有非特異性結(jié)合，那得到的數(shù)值就不可信；WB只能半定量，但是可以檢測(cè)細(xì)胞膜蛋白，這點(diǎn)ELISA做不到；WB所檢測(cè)的一般是抗原，而ELISA抗原抗體都可以檢測(cè)；WB所檢測(cè)的抗原可以知道其分子量的大小，或是否是多聚體、降解產(chǎn)物等，WB可以確定所用抗體是與哪種蛋白起作用的，而ELISA無(wú)能為力；WB一次處理量就是一塊膠板，最多10-20個(gè)樣品。ELISA一塊96孔板一次可以處理96個(gè)樣本，可以設(shè)置多個(gè)復(fù)孔、對(duì)照、梯度樣等來(lái)提高檢測(cè)的可信度。46免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)及熒光定量PCRELIS

28、A與Western blot比較Western bl寫(xiě)作實(shí)例Western blot詳細(xì)描述47免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)及熒光定量PCR寫(xiě)作實(shí)例Western blot詳細(xì)描述47免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)及寫(xiě)作實(shí)例Western blot顯影結(jié)果+定量分析 DEDD: Death Effector Domain-containing DNA binding protein相對(duì)表達(dá)量48免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)及熒光定量PCR寫(xiě)作實(shí)例Western blot顯影結(jié)果+定量分析 DEDD寫(xiě)作實(shí)例Western blotIF = 9.284更加詳細(xì)49免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)及熒光定量PCR寫(xiě)作實(shí)例Western blotIF = 9.2

29、84更加詳細(xì)寫(xiě)作實(shí)例Western blotIF = 9.284Metformin：二甲雙胍（抗糖尿病藥、降血糖藥）人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7 mTOR signaling pathway 顯影結(jié)果差異明顯50免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)及熒光定量PCR寫(xiě)作實(shí)例Western blotIF = 9.284Metf寫(xiě)作實(shí)例Western blot不作方法描述IF = 31.477細(xì)胞因子刺激磷酸化水平51免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)及熒光定量PCR寫(xiě)作實(shí)例Western blot不作方法描述IF = 31.免疫組化定義及原理應(yīng)用分類(lèi)及實(shí)驗(yàn)方法結(jié)果分析常見(jiàn)問(wèn)題分析寫(xiě)作實(shí)例52免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)及熒光定量PCR免疫組化定義及原理52

30、免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)及熒光定量PCR定義及原理免疫組化 定義：用標(biāo)記的特異性抗體對(duì)組織切片或細(xì)胞標(biāo)本中某些化學(xué)成分的分布和含量進(jìn)行組織和細(xì)胞原位定性、定位或定量研究，這種技術(shù)稱(chēng)為免疫組織化學(xué)（immunohistochemistry）技術(shù)或免疫細(xì)胞化學(xué)（immunocytochemistry）技術(shù)。 原理：根據(jù)抗原抗體反應(yīng)和化學(xué)顯色原理，組織切片或細(xì)胞標(biāo)本中的抗原先和一抗結(jié)合，再利用一抗與標(biāo)記生物素、熒光素等的二抗進(jìn)行反應(yīng)，最后通過(guò)呈色反應(yīng)或熒光來(lái)顯示細(xì)胞或組織中化學(xué)成分，在光學(xué)顯微鏡或熒光顯微鏡下可清晰看見(jiàn)細(xì)胞內(nèi)發(fā)生的抗原抗體反應(yīng)產(chǎn)物，從而能夠在細(xì)胞爬片或組織切片上原位確定某些化學(xué)成分的分布和含量

31、。 53免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)及熒光定量PCR定義及原理免疫組化 定義：用標(biāo)記的特異性抗體對(duì)組織切片或細(xì)胞應(yīng)用免疫組化用途: 對(duì)目的蛋白進(jìn)行定性、定位和定量分析。優(yōu)點(diǎn)：能夠明確目的蛋白的細(xì)胞定位、亞細(xì)胞定位及多種蛋 白之間的相互位置關(guān)系局限性：敏感性差，蛋白定量效果差。54免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)及熒光定量PCR應(yīng)用免疫組化用途:54免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)及熒光定量PCR分類(lèi)免疫組化 按標(biāo)記物質(zhì)的種類(lèi) 如熒光染料、放射性同位素、酶（主要有辣根過(guò)氧化物酶和堿性磷酸酶）、鐵蛋白、膠體金等，可分為免疫熒光法、放射免疫法、免疫酶標(biāo)法和免疫金銀法等。按染色步驟 可分為直接法（又稱(chēng)一步法）和間接法（二步、三步或多步法）。按結(jié)合方式

32、 分為抗原-抗體結(jié)合，如過(guò)氧化物酶-抗過(guò)氧化物酶（PAP）法；親和連接，如卵白素-生物素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物（ABC）法、鏈霉菌抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶連結(jié)（SP）法等；聚合物鏈接，如即用型二步法。 55免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)及熒光定量PCR分類(lèi)免疫組化 按標(biāo)記物質(zhì)的種類(lèi)55免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)及熒光定量P免疫熒光法免疫組化 免疫熒光法:最早建立的免疫組織化學(xué)技術(shù)。 基本原理：它利用抗原抗體特異性結(jié)合的原理，先將已知抗體標(biāo)上熒光素，以此作為探針檢查細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原，在熒光顯微鏡下觀察。當(dāng)抗原抗體復(fù)合物中的熒光素受激發(fā)光的照射后即會(huì)發(fā)出一定波長(zhǎng)的熒光，從而可確定組織中某種抗原的定位，進(jìn)而還可進(jìn)行定量分析。

33、 優(yōu)點(diǎn)：由于免疫熒光技術(shù)特異性強(qiáng)、靈敏度高、快速簡(jiǎn)便，所以在臨床病理診斷、檢驗(yàn)中應(yīng)用較廣。56免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)及熒光定量PCR免疫熒光法免疫組化 免疫熒光法:最早建立的免疫組織化學(xué)技術(shù)。免疫熒光法免疫組化 固定：醛類(lèi)（常用甲醛、戊二醛和多聚甲醛）、醇類(lèi)（常用乙醇）、 其它 （丙 酮）， 4固定過(guò)夜或室溫固定0.5h 通透化： 0.1 %TritonX-100，置于冰上15min。 封閉：1BSA 37封閉1h。 一抗孵育： 4孵育過(guò)夜或室溫孵育2h。 二抗孵育： 放上玻片，室溫孵育1h。 染核： 加入DAPI，室溫避光染色。 封片： 甘油封片。 鏡檢：4避光保存57免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)及熒光定量PCR

34、免疫熒光法免疫組化 固定：醛類(lèi)（常用甲醛、戊二醛和多聚甲醛）免疫熒光法免疫組化FluorochromeExcitation (nm)Emission (nm)ColorDAPI365420BlueFluorescein495525GreenHoechts 33258360470BlueR-phycocyanin555, 618634RedB-phycoerythrin545, 565575Orange, redR-phycoerythrin480, 545, 565578Orange, redRhodamine552570RedTexas red596620Red常用熒光素58免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)及

35、熒光定量PCR免疫熒光法免疫組化FluorochromeExcitatio免疫熒光法免疫組化3T3 LinePtK1 LineNBL-6 LineRK13 LineLongitudinal Fissure大腦縱裂Blood VesselsCerebellum小腦59免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)及熒光定量PCR免疫熒光法免疫組化3T3 LinePtK1 LineNBL-即用型二步法免疫組化 常用的標(biāo)記酶及其顯色底物 辣根過(guò)氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)：DAB或AEC顯色系統(tǒng) （結(jié)果染為棕黃色） 堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, AP)： NBT/BC

36、IP（結(jié)果染為藍(lán)黑色） 60免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)及熒光定量PCR即用型二步法免疫組化 常用的標(biāo)記酶及其顯色底物 60免ABC法免疫組化一抗、生物素化的二抗、ABC復(fù)合物（親和素+酶標(biāo)生物素） 產(chǎn)生多級(jí)放大，從而提高生物反應(yīng)的敏感性和特異性。 生物素和親和素有很強(qiáng)的親和力，比抗原-抗體的親和力要高一萬(wàn)倍以上。卵白素-生物素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物61免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)及熒光定量PCRABC法免疫組化一抗、生物素化的二抗、ABC復(fù)合物（親和素+SP三步法免疫組化脫蠟與水化2.細(xì)胞通透、封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶 抗原修復(fù)、暴露抗原決定簇 封閉非特異性蛋白 一抗孵育 生物素標(biāo)記的二抗二抗孵育 SP(鏈霉親和素-過(guò)氧化物酶

37、) 反應(yīng) 顯色 復(fù)染、脫水、透明、封片 細(xì)胞通透、封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶 ABC法基礎(chǔ)上的進(jìn)一步改良，使卵白素與鏈霉（而非生物素）結(jié)合。靈敏特異性低，成本低。62免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)及熒光定量PCRSP三步法免疫組化脫蠟與水化2.細(xì)胞通透、封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物結(jié)果分析免疫組化陽(yáng)性著色細(xì)胞計(jì)數(shù)法：在40*光鏡下，隨機(jī)選擇不重疊的10個(gè)視野，人工或機(jī)器計(jì)數(shù)陽(yáng)性著色細(xì)胞，每組36張不同動(dòng)物組織切片，然后進(jìn)行組間比較即可。Melatonin：褪黑素 Hy: hypoxia缺氧Nestlin: 巢蛋白，特異性的表達(dá)在神經(jīng)上皮干細(xì)胞神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化Journal of Pineal Research IF = 7

38、.81263免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)及熒光定量PCR結(jié)果分析免疫組化陽(yáng)性著色細(xì)胞計(jì)數(shù)法：在40*光鏡下，隨機(jī)選擇結(jié)果分析免疫組化灰密度分析法：通過(guò)在不同組別和不同動(dòng)物組織切片上選擇相同區(qū)域、相同條件下用Image pro plus進(jìn)行灰密度分析，然后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析即可。64免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)及熒光定量PCR結(jié)果分析免疫組化灰密度分析法：通過(guò)在不同組別和不同動(dòng)物組織切結(jié)果分析免疫組化 評(píng)分法：通過(guò)在光學(xué)顯微鏡下對(duì)組織切片分別按染色程度（03分為陰性著色、淡黃色、淺褐色、深褐色）、陽(yáng)性范圍進(jìn)行評(píng)分（14分為025%、2650%、5175%、76100%），最終可以分?jǐn)?shù)相加，再進(jìn)行比較。相同曝光時(shí)間、相同顯色時(shí)間大

39、體分為陰性、弱陽(yáng)性、陽(yáng)性BDCAEFGHNormal65免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)及熒光定量PCR結(jié)果分析免疫組化 評(píng)分法：通過(guò)在光學(xué)顯微鏡下對(duì)組織切片分別按常見(jiàn)問(wèn)題分析免疫組化原因解決辦法抗體的濃度過(guò)高或抗體孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)降低抗體滴度（一般指濃縮性抗體）抗體孵育時(shí)間：室溫1小時(shí)或4過(guò)夜 孵育溫度過(guò)高，孵育溫度超過(guò)37一般室溫20-28 DAB顯色時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或DAB濃度過(guò)高顯色時(shí)間不能超過(guò)5-10分鐘，以顯微鏡下觀察為準(zhǔn) 染色過(guò)強(qiáng)66免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)及熒光定量PCR常見(jiàn)問(wèn)題分析免疫組化原因解決辦法抗體的濃度過(guò)高或抗體孵育時(shí)常見(jiàn)問(wèn)題分析免疫組化 染色弱原因解決辦法抗體濃度過(guò)低，孵育時(shí)間過(guò)短提高抗體濃度，孵育時(shí)間不

40、能少于60分鐘試劑超過(guò)有效使用期及時(shí)更換試劑操作中，滴加試劑時(shí)緩沖液未瀝干，致使試劑稀釋每步滴加試劑前瀝干切片中多余的緩沖液（但防止切片干燥）室溫太低，低于15若室溫低于15度，要改放在37孵育箱孵育30-60分鐘（或4冰箱過(guò)夜）蛋白封閉過(guò)度封閉時(shí)間不要超過(guò)10分鐘67免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)及熒光定量PCR常見(jiàn)問(wèn)題分析免疫組化 染色弱原因解決辦法抗體濃度過(guò)低，孵育時(shí)常見(jiàn)問(wèn)題分析免疫組化 染色陰性原因解決辦法 操作步驟錯(cuò)誤重新試驗(yàn)，設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照 組織中無(wú)抗原設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照片，以驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果 一抗與二抗種屬連接錯(cuò)誤仔細(xì)確定一抗與二抗種屬無(wú)誤 68免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)及熒光定量PCR常見(jiàn)問(wèn)題分析免疫組化 染色陰性原

41、因解決辦法 操作步驟錯(cuò)誤重新常見(jiàn)問(wèn)題分析免疫組化 非特異性背景染色原因解決辦法操作過(guò)程中沖洗不充分每步?jīng)_洗35 組織中含過(guò)氧化物酶未阻斷可再配置新鮮3%H2O2封閉，孵育時(shí)間延長(zhǎng) 組織中含內(nèi)源性生物素正常非免疫動(dòng)物血清再封閉 血清蛋白封閉不充分延長(zhǎng)血清蛋白封閉時(shí)間 69免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)及熒光定量PCR常見(jiàn)問(wèn)題分析免疫組化 非特異性背景染色原因解決辦法操作過(guò)程中寫(xiě)作實(shí)例免疫組化IF = 1.95970免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)及熒光定量PCR寫(xiě)作實(shí)例免疫組化IF = 1.95970免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)及熒光寫(xiě)作實(shí)例免疫組化IF = 5.00671免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)及熒光定量PCR寫(xiě)作實(shí)例免疫組化IF = 5.00671

42、免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)及熒光寫(xiě)作實(shí)例免疫組化IF = 3.53472免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)及熒光定量PCR寫(xiě)作實(shí)例免疫組化IF = 3.53472免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)及熒寫(xiě)作實(shí)例免疫組化IF = 3.53473免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)及熒光定量PCR寫(xiě)作實(shí)例免疫組化IF = 3.53473免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)及熒免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)及熒光定量PCR培訓(xùn)課件Real Time PCR幾個(gè)概念PCR，RT-PCR，Real Time PCR，qPCRPCR：Polymerase Chain Reaction。RT-PCR：Reverse Transcription PCR，首先經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶的作用從RNA合成 cDNA，再以cDNA為模板，擴(kuò)增

43、合成目的片段?？蓪?duì)基因表達(dá)進(jìn)行相對(duì)定量；也有稱(chēng)Real time PCR為RT-PCR。Real Time PCR：實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)。qPCR：Real time Quantitative PCR Detecting System（Real Time PCR），實(shí)時(shí)熒光定量PCR。75免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)及熒光定量PCRReal Time PCR幾個(gè)概念PCR，RT-PCR，ReReal Time PCR定義 熒光定量PCR是通過(guò)熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性的探針，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記跟蹤，實(shí)時(shí)在線監(jiān)控反應(yīng)過(guò)程，結(jié)合相應(yīng)的軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，計(jì)算待測(cè)樣品的初始模板量。76免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)及熒光定量PCR

44、Real Time PCR定義 熒光定量PCR是通過(guò)Real Time PCR應(yīng)用Real Time PCR用途定性分析定量分析病毒及病原菌定量分析導(dǎo)入基因拷貝數(shù)解析GMO定量檢測(cè)差異顯示結(jié)果驗(yàn)證基因芯片結(jié)果驗(yàn)證siRNA效果確認(rèn)mRNA表達(dá)量分析病毒及病原菌檢測(cè)物種鑒定基因分型絕對(duì)定量相對(duì)定量77免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)及熒光定量PCRReal Time PCR應(yīng)用Real Time PCR用途Real Time PCR原理使用Real Time PCR擴(kuò)增裝置實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物并進(jìn)行分析的方法。激發(fā)光發(fā)射光Ct值78免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)及熒光定量PCRReal Time PCR原理使用Real Tim

45、e PCRReal Time PCR熒光定量PCR與普通PCR比較 實(shí)時(shí)在線監(jiān)控 對(duì)樣品擴(kuò)增的整個(gè)過(guò)程進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控，能夠?qū)崟r(shí)地觀察到產(chǎn)物的增加，直觀地看到反應(yīng)的對(duì)數(shù)期 降低反應(yīng)的非特異性 使用引物和熒光探針同時(shí)與模板特異性結(jié)合，提高了PCR反應(yīng)的特異性 增加定量的精確性 全程監(jiān)控，精確定量 結(jié)果分析更快捷方便，無(wú)需電泳 79免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)及熒光定量PCRReal Time PCR熒光定量PCR與普通PCR比較 Real Time PCR 擴(kuò)增曲線（primary curve） 隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，擴(kuò)增產(chǎn)物不斷累積，熒光信號(hào)強(qiáng)度不斷增加。每經(jīng)過(guò)一個(gè)循環(huán)，收集一次熒光信號(hào)，通過(guò)熒光強(qiáng)度的變化監(jiān)測(cè)

46、擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，從而得到擴(kuò)增曲線圖。 PCR的擴(kuò)增曲線實(shí)際上并不是一條標(biāo)準(zhǔn)的指數(shù)曲線，而是呈S型曲線。 縱坐標(biāo)：Rn（熒光值） 橫坐標(biāo)：cycle number （循環(huán)數(shù)）線性期80免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)及熒光定量PCRReal Time PCR 擴(kuò)增曲線（primary curReal Time PCR熒光閾值（threshold）基線(baseline)：一般把熒光PCR的前15個(gè)循環(huán)信號(hào)作為熒光本底信號(hào)，即樣本的熒光背景值和陰性對(duì)照的熒光值。熒光閥值(threshold)：擴(kuò)增曲線上人為設(shè)定的一個(gè)值- 缺省設(shè)置：PCR反應(yīng)前3-15個(gè)循環(huán)熒光本底信號(hào)標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍, （機(jī)器自動(dòng)設(shè)置）。- 手動(dòng)設(shè)置：大于樣本的熒光背景值手工調(diào)整熒光閾值示意圖 81免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)及熒光定量PCRReal