乙肝病毒檢測臨床意義課件

1、高敏乙肝病毒檢測臨床意義高敏乙肝病毒檢測臨床意義高敏乙肝病毒檢測臨床意義Our mission 愿景.for a healthier today and an even better tomorrowDedicated to improving the health and safety of people and the environment致力于改善人類的健康和促進(jìn)我們生活環(huán)境的安全高敏乙肝病毒檢測臨床意義高敏乙肝病毒檢測臨床意義高敏乙肝病毒Our mission 愿景.for a healthier today and an even better tomorrowDedicated

2、to improving the health and safety of people and the environment致力于改善人類的健康和促進(jìn)我們生活環(huán)境的安全Our mission 愿景.for a heal國際治療路線HBV優(yōu)化治療路線圖策略* 由美國坦福大學(xué)醫(yī)學(xué)中心Keeffe教授（專家組）提供國際治療路線HBV優(yōu)化治療路線圖策略* 由美國坦福大學(xué)醫(yī)學(xué)中各指南推薦的治療終點 AASLD 2007 APASL 2008 EASL 2009HBeAg(+) CHB 患者HBeAg血清轉(zhuǎn)換 (唯一的終點) HBeAg血清轉(zhuǎn)換和/或HBV DNA檢測不到HBsAg 血清清除 (“理想

3、的終點”) HBeAg 血清轉(zhuǎn)換(“滿意的終點”) HBV DNA檢測不到 HBeAg(-) CHB患者HBsAg血清清除 HBV DNA檢測不到 以及ALT正?；?HBsAg 血清清除 (“理想的終點”) HBV DNA檢測不到 各指南推薦的治療終點 AASLD 2007 美肝會指南2008年美國肝病協(xié)會CHB防治指南：持久消除HBV是乙肝的治療終點，HBV DNA病毒載量盡可能小于或等于10 IU/ ml。美肝會指南2008年美國肝病協(xié)會CHB防治指南：持久消除HB歐洲肝病研究學(xué)會EASL2010年指南指出：將HBV DNA病毒載量盡可能控制在10-15 IU/ ml，能有效防止疾病的復(fù)發(fā)

4、。歐肝會指南歐洲肝病研究學(xué)會EASL2010年指南指出：將HBV DNA乙型肝炎病毒定量檢測試劑注冊申報技術(shù)指導(dǎo)原則乙型肝炎病毒（HBV）DNA定量檢測試劑注冊申報技術(shù)指導(dǎo)原則乙型肝炎病毒定量檢測試劑注冊申報技術(shù)指導(dǎo)原則乙型肝炎病毒（行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)專家意見莊輝、魯鳳民等，慢性乙型肝炎病毒DNA定量檢測的臨床意義2012年專家意見莊輝、魯鳳民等，慢性乙型肝炎病毒DNA定量檢測的臨臨床一線對超靈敏檢測試劑需求旺盛臨床階段 HBV DNA定量的目的開始治療前 確定患者乙肝感染的基線水平 選擇針對性的藥物 避免盲目用藥治療過程中 評估抗病毒治療的效果 及時監(jiān)測是否發(fā)生耐藥 預(yù)測肝硬化、肝癌的發(fā)生風(fēng)險

5、治療末期 確定治療終點 為醫(yī)生什么時候停止治療提供可靠依據(jù)治療結(jié)束 每3-6個月定期監(jiān)測HBV-DNA水平，監(jiān)控疾病復(fù)發(fā)傳統(tǒng)定量產(chǎn)品滿足不了臨床需求 臨床一線對超靈敏檢測試劑需求旺盛臨床階段 臨床用核酸提取試劑乙肝定量kit48測試/盒國食藥監(jiān)械（準(zhǔn)）字2013第號2013年11月丙肝定量kit24測試/盒國食藥監(jiān)械（準(zhǔn)）字2011第號2011年5月核酸提取kit32測試/盒滬青械備號2014年12月臨床用核酸提取試劑乙肝定量kit丙肝定量kit核酸提取kit高靈敏：HBV 檢測下限：20 IU/ml (2013年11月已拿到新證)HCV 檢測下限：15 IU/ml (預(yù)計16年3月拿到新證)

6、國家CFDA技術(shù)審評中心HBV DNA/HCV RNA 定量試劑技術(shù)審評指導(dǎo)原則中指出： HBV DNA最低檢測限應(yīng) 30IU/ml HCV RNA最低檢測限應(yīng) 50IU/mlPKI臨床高敏定量檢測產(chǎn)品高靈敏：國家CFDA技術(shù)審評中心HBV DNA/HCV R方法學(xué) method磁珠法 paramagnetic particle method樣本類型 sample血清、血漿 serum or plasma上樣量 sample volume200400ul檢測型別 genotypesHBV A-H基因型線性范圍 LOQ20 IU/mL-2*109 IU/mL靈敏度 LOD 20 IU/mL注冊證

7、號國食藥監(jiān)械（準(zhǔn)）字2013第號HBV產(chǎn)品性能方法學(xué) method磁珠法 paramagnet高敏乙肝試劑對比試驗開展單位北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部上海仁濟醫(yī)院湖北省人民醫(yī)院上海第三人民醫(yī)院溫州醫(yī)科大附屬第一醫(yī)院東營勝利油田中心醫(yī)院昆明醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院滄州傳染病醫(yī)院中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院北京三零二醫(yī)院高敏乙肝試劑對比試驗開展單位北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部高敏乙肝試劑對比試驗開展單位浙江PCR培訓(xùn)班現(xiàn)場評價重慶PCR培訓(xùn)班現(xiàn)場評價廣州PCR培訓(xùn)班現(xiàn)場評價煙臺PCR培訓(xùn)班現(xiàn)場評價高敏乙肝試劑對比試驗開展單位浙江PCR培訓(xùn)班現(xiàn)場評價乙肝病毒檢測臨床意義課件一、北大醫(yī)學(xué)部溯源性評價1重復(fù)性評價234臨床血清盤評價線性范圍評價

8、一、北大醫(yī)學(xué)部溯源性評價1重復(fù)性評價234臨床血清盤評價線性Day 1:Genotype A Panel: WHO HBV Standard（NIBSC code: 10/264）稀釋均采用HBV 陰性人EDTA抗凝血漿：HBsAg negative and anti-HBcAb negativeGenotype A PanelRepeat 1Repeat 2Repeat 3PKI 稀釋至20、50、200、2,000、20,000 IU/ml五個濃度值Day 2 & 3: repeat the above testing pattern1. WHO 標(biāo)準(zhǔn)血清盤可溯源性檢測方案Day 1:Ge

9、notype A Panel: WHO HB理論值(IU/ml)理論值(lg IU/ml)實測值(lg IU/ml)相對偏差(lg IU/ml)標(biāo)準(zhǔn)差 (lg IU/ml)200004.3014.210-0.0910.09520003.3013.248-0.0530.1442002.3012.3120.0110.145501.6991.7240.0250.111201.3011.4410.1400.225該HBV定量試劑具有良好的溯源性PKI HBV定量試劑對WHO標(biāo)準(zhǔn)品溯源性檢測結(jié)果理論值理論值實測值相對偏差標(biāo)準(zhǔn)差 200004.3014.2靈敏度 WHO標(biāo)準(zhǔn)品（A亞型）2E42E32E25

10、020105LOD can reach to 10 IU/ml；about 70% of 5 IU/ml could be detected.靈敏度 WHO標(biāo)準(zhǔn)品（A亞型）2E42E32E250201Day 1:Genotype B:衛(wèi)生部臨床檢驗中心（GBW09150）Genotype C:中國藥品生物制品檢定研究院Genotype D: SeraCare公司（ WWHD301-10 ）Rep 1Rep 2Rep 3Rep 4Rep 5Rep 6Genotype B/C/DPanelPKI 稀釋至20、50、200、2,000、20,000 和200,000 IU/ml六個濃度Day 2 &

11、 3: repeat the above testing pattern2. HBV B/C/D亞型的重復(fù)性比較方案Day 1:Genotype B:衛(wèi)生部臨床檢驗中心（GBWHBV基因型理論值(IU/ml)理論值(lgIU/ml)檢測次數(shù)實測值(lg IU/ml)相對偏差(lg IU/ml)標(biāo)準(zhǔn)差（lg IU/ml）LognormalCV %HBV B型2000005.301185.3290.0280.0581.096200004.301184.3760.0750.1082.46420003.301183.3840.0830.1303.8312002.301182.4200.1190.121

12、5.000501.699181.7760.0050.1649.235201.301181.4480.1470.23916.502HBV C型2000005.301185.3240.0230.0160.307200004.301184.3200.0190.0190.44020003.301183.3070.0060.0381.1652002.301182.340.0390.0421.815501.699181.7170.0180.0985.754201.301181.4340.1330.1278.863HBV D型 2000005.301185.145-0.1560.0751.462200004

13、.301184.251-0.0500.0721.69920003.301183.187-0.1140.1605.0082002.301182.229-0.0730.2179.756501.699181.684-0.0150.25815.341201.301181.3010.0000.28722.068PKI HBV定量試劑對HBV B/C/D亞型標(biāo)準(zhǔn)血漿檢測精密度評價該HBV定量試劑具有良好的重復(fù)性HBV基因型理論值(IU/ml)理論值檢測次數(shù)實測值相對標(biāo)重復(fù)性 臨檢中心標(biāo)準(zhǔn)品（B亞型）2E52E42E32E2503 repeat tests each concentration20Syste

14、m shows good repeatability重復(fù)性 臨檢中心標(biāo)準(zhǔn)品（B亞型）2E52E42E32E25Rep 1Rep 2Rep 3高濃度假病毒顆粒PKI 稀釋至20、50、100、1000、100001.0E+10 IU/ml等 11個濃度值試劑盒線性范圍： 20-109 IU/ml3. 線性范圍評價方案Rep 1Rep 2Rep 3高濃度假病毒顆粒PKI 稀釋至改良Doumas法該試劑的線性范圍可達(dá)到（201E+09）IU/ml線性范圍分析改良Doumas法改良Doumas法該試劑的線性范圍可達(dá)到（201E+09）E9E8E7E6E5E4E3E25020negativeSystem

15、 shows good linear relationship in the concentration rangeof 201E9IU/ml.線性范圍圖E9E8E7E6E5E4E3E25020negativeSy4. 臨床血清盤評價雙盲法對比測試84例臨床樣本符合率100%其中2例樣本低于兩種檢測試劑的檢測下限20 IU/ml，兩種試劑均可檢出。Deming regression（圖）分析結(jié)果顯示：兩中試劑的相關(guān)性較好（r=0.968，p0.0001）；二者關(guān)系為PKI=0.340+0.975*Roche；總符合率：100%PKIposnegRochepos440neg040Correlat

16、ion with Roche 4. 臨床血清盤評價雙盲法對比測試84例臨床樣本總符合率：1該HBV定量檢測試劑在溯源性、精密度及線性范圍方面均有良好表現(xiàn)，臨床樣本檢測與進(jìn)口試劑具有良好的相關(guān)性。試劑考評結(jié)論該HBV定量檢測試劑在溯源性、精密度及線性范圍方面均有良好表二、上海仁濟醫(yī)院溯源性評價/準(zhǔn)確度評價1批內(nèi)/批間重復(fù)性評價234臨床血清盤評價線性范圍評價5檢測限評價二、上海仁濟醫(yī)院溯源性評價/準(zhǔn)確度評價1批內(nèi)/批間重復(fù)性評價Genotype A Panel: WHO HBV Standard（NIBSC code: 10/264）稀釋均采用HBV 陰性人EDTA抗凝血漿：HBsAg nega

17、tive and anti-HBcAb negativeGenotype A PanelRepeat 1Repeat 2Repeat 3PKI 稀釋至20、50、100、1,000、10,000 IU/ml五個濃度值1. WHO 標(biāo)準(zhǔn)品準(zhǔn)確度檢測方案Genotype A Panel: WHO HBV Stan該HBV定量試劑具有良好的溯源性和準(zhǔn)確度PKI HBV定量試劑準(zhǔn)確度檢測結(jié)果該HBV定量試劑具有良好的溯源性和準(zhǔn)確度PKI HBV定量試Day 2 & 3 & 4: repeat the above testing pattern2. 重復(fù)性比較方案批內(nèi)重復(fù):Rep 16次10號樣本（2E

18、7）濃度稀釋至3E5，共8mlPKI 10號樣本（2E7）濃度稀釋至3E3，共8ml批間重復(fù):Rep 4次9個5次方濃度樣本混合成8ml，分裝4管PKI 9個3次方濃度樣本混合成8ml，分裝4管Day1:Day 1: 直接測試16次Day 2 & 3 & 4: repeat the abov批內(nèi)重復(fù)性檢測結(jié)果該HBV定量試劑具有良好的重復(fù)性(Coefficient of Variance)批內(nèi)重復(fù)性檢測結(jié)果該HBV定量試劑具有良好的重復(fù)性(Coef批間重復(fù)性檢測結(jié)果該HBV定量試劑具有良好的重復(fù)性批間重復(fù)性檢測結(jié)果該HBV定量試劑具有良好的重復(fù)性Rep 1Rep 2Rep 3高濃度假病毒顆粒P

19、KI 稀釋至20、50、100、1000、100001.0E+10 IU/ml等 11個濃度值試劑盒線性范圍： 20-109 IU/ml3. 線性范圍評價方案Rep 1Rep 2Rep 3高濃度假病毒顆粒PKI 稀釋至改良Doumas法該試劑的線性范圍可達(dá)到（201E+09）IU/ml線性范圍分析Correlate改良Doumas法該試劑的線性范圍可達(dá)到（201E+09）4. 臨床樣本評價方案8次方濃度樣本8個PKI 3次方濃度樣本8個7次方濃度樣本8個2次方濃度樣本8個6次方濃度樣本8個5次方濃度樣本8個4次方濃度樣本8個1次方濃度樣本8個Roche 對比4. 臨床樣本評價方案8次方濃度樣本

20、8個PKI 3次方濃度樣臨床對比結(jié)果臨床對比結(jié)果臨床對比結(jié)果臨床對比結(jié)果5. 檢測限評價方案Genotype A Panel: WHO HBV Standard（NIBSC code: 10/264）稀釋均采用HBV 陰性人EDTA抗凝血漿：HBsAg negative and anti-HBcAb negativeGenotype A PanelRepeat 1Repeat 2Repeat 5PKI 稀釋至50、20、10 IU/ml3個濃度值Repeat 3Repeat 45. 檢測限評價方案Genotype A Panel: WH檢測限結(jié)果檢測限結(jié)果三、湖北省人民全血測評結(jié)果 on Ch

21、emagic 360相對于過柱法提取，磁珠方法提取全血有更高的得率三、湖北省人民全血測評結(jié)果 on Chemagic 360相湖北省人民全血測評結(jié)果 on Chemagic 360將全血原倍樣本重復(fù)提取3次測試，并稀釋5倍、10倍測試，結(jié)果表明磁珠方法提取全血具有更好的重復(fù)性、梯度關(guān)系湖北省人民全血測評結(jié)果 on Chemagic 360將全血湖北省人民全血測評結(jié)果 on Chemagic 360湖北省人民全血測評結(jié)果 on Chemagic 360四、北京302醫(yī)院精密度四、北京302醫(yī)院精密度乙肝病毒檢測臨床意義課件四、北京302醫(yī)院臨床樣本對比四、北京302醫(yī)院臨床樣本對比四、北京302

22、醫(yī)院棋盤交叉污染測評四、北京302醫(yī)院棋盤交叉污染測評Unbeatable Solution Magnet offRotation onMagnet onMagnetic Beads based on (PVA) 1 m chemagic Separation TechnologyBloodSaliva / SwabsPlasma(Pathogens)Standard Kits for:Unbeatable Solution Magnet ofPre-NAT技術(shù)特點-3轉(zhuǎn)移磁珠而不采用轉(zhuǎn)移液體的方式進(jìn)行核酸提取，可以有效的減少氣溶膠的產(chǎn)生幾率，具有良好的防污染效果，而且可以極大的減少樣本處理時

23、間。用旋轉(zhuǎn)磁棒的方式進(jìn)行液體攪拌，從而確保磁珠完全重懸并釋放雜質(zhì)。能夠避免磁棒振動模式混勻、或者吹吸混勻的氣溶膠產(chǎn)生的風(fēng)險。通過電磁鐵控制磁場，磁珠被轉(zhuǎn)移到下一個提取組分中，無需轉(zhuǎn)移液體。Pre-NAT技術(shù)特點-3轉(zhuǎn)移磁珠而不采用轉(zhuǎn)移液體的方式進(jìn)行防污染措施1. 紫外燈消毒，有效防止交叉污染。2. 磁棒旋轉(zhuǎn)式混勻，液面上升幅度小，可防止液體噴濺。3. 轉(zhuǎn)移磁珠的方法，減少了液體/氣溶膠暴露的機會，從而減少污染。4. 廢棄槍頭處理方式：直接打到專用垃圾袋，防止含病原體的槍頭污染臺面。5. 每次實驗后進(jìn)行儀器清潔：75%酒精擦拭臺面。6. 使用濾芯槍頭。7. MSM1排風(fēng)口引到pre-NAT外部，

24、防止氣流回流造成污染。8. 設(shè)有移液回吸動作，防止陽性樣本滴出造成污染。防污染措施1. 紫外燈消毒，有效防止交叉污染。2. 磁棒旋試驗煮沸法合計陽性陰性PerkinElmer陽性04747陰性033合計05050表1 相對符合率分析五、與國內(nèi)煮沸法HBV 低于500 IU/ml 樣本結(jié)果測評分析簡要分析：國產(chǎn)試劑HBV PCR試劑500IU/ml的樣本50例，均報告陰性結(jié)果;使用Perkinelmer HBV PCR試劑只檢出3例陰性，其余47例均有檢測結(jié)果；20IU/ml濃度以上假陰性率達(dá)到64%以上，且個別結(jié)果達(dá)到E4 E5高濃度樣本漏檢； 可見普通煮沸法HBV 定量試劑臨床漏檢率特別高，

25、給臨床診治帶來錯誤的診斷治療依據(jù)。試驗煮沸法合計陽性陰性PerkinElmer陽性04747陰試驗一步法合計陽性陰性PerkinElmer陽性13092222陰性06464合計130156286表2 相對符合率分析與一步法 HBV PCR試劑 樣本結(jié)果測評對比分析-1一步法 HBV PCR試劑對比情況分析： PE與一步法平行對比HBV樣本，總計286例；一步法定量下限500IU/ml，即有156個樣本報陰性或無結(jié)果，PE定量下限20IU/ml，總計64個樣本不報結(jié)果。實際有92個弱陽性標(biāo)本被漏報，占總檢測數(shù)量的32.17%，風(fēng)險相當(dāng)大；試驗一步法合計陽性陰性PerkinElmer陽性13092

26、2國產(chǎn)：曲線平臺期不明顯，擴增效率低 重復(fù)性一般。PE：曲線呈典型S曲線，擴增效率高 重復(fù)性非常好國產(chǎn)：曲線平臺期不明顯，擴增效率低PE：曲線呈典型S曲線，擴一步法 HBV PCR試劑對比情況分析：兩例樣本結(jié)果兩種試劑差異較大，復(fù)測；一步法HBV試劑檢測準(zhǔn)確性差，因雜質(zhì)未去除，試劑抗干擾能力差，重復(fù)性差，不穩(wěn)定。PE HBV 高敏試劑抗干擾能力強，穩(wěn)定，重復(fù)性好。與一步法 HBV PCR試劑 樣本結(jié)果測評對比分析-2樣本1一步法內(nèi)標(biāo)未起跳PE1.78E+06 IU/ml復(fù)測復(fù)測原倍內(nèi)標(biāo)仍未起跳1.7E+06 IU/ml稀釋10倍3.9E+05IU/ml樣本2一步法9.92E+02IU/mlPE

27、9.26E+01 IU/ml復(fù)測復(fù)測1.36E+02IU/mlPE9.68E+01 IU/ml與一步法 HBV PCR試劑 樣本結(jié)果測評對比分析-2樣本1Real time PCR普通PCRPKI-超靈敏PCRPCR上樣量2ul40ul體系20ul60ul 提取DNA 方法學(xué) 煮沸法磁珠法優(yōu)缺點（純度）雜質(zhì)多 擴增效率低 純度高 擴增效率高超靈敏的PCR（即高效率）需要的各種條件較高:(1+x)n=AF ，109 PCR產(chǎn)物分子高靈敏的關(guān)鍵要素Real time PCRPKI-超靈敏PCRPCR上樣量2 PerkinElmer 全自動核酸檢測反應(yīng)體系構(gòu)建系統(tǒng)-Pre-NAT儀器型號：Pre-N

28、AT條碼掃描：原始管上機，條碼掃描讀取儀器大?。?300mm x 810mm x 950mm樣本通量：196個樣本處理體積： 最大1.2ml液體加樣范圍：5ul800ul處理時間：2小時完成96個樣本的PCR體系構(gòu)建加樣器：4通道磁場控制：電磁鐵提取方法：磁珠法-轉(zhuǎn)移磁珠 PerkinElmer 全自動核酸檢測反應(yīng)體系構(gòu)建系 Pre-NAT 工作流程Pre-NAT 工作站核酸提取、擴增前PCR反應(yīng)體系構(gòu)建等過程無需人工操作將您從繁瑣的操作中解放出來Walk away Pre-NAT 工作流程Pre-NAT 工作站核酸提取、Pre-NAT 四大模塊Pre-NAT 四大模塊Pre-NAT 操作界面175ul Tip頭900ul Tip頭試劑槽PCR八聯(lián)管1.5ml管架樣本架洗針槽深孔板磁棒套管