齊魯醫(yī)學(xué)堿性磷酸酶km值測定

1、酶促反應(yīng)動力學(xué)研究方法介紹EXPERIMENT 3 堿性磷酸酶km值測定2021/9/301實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)環(huán)境因素對酶促反應(yīng)速度的影響；學(xué)習(xí)米氏方程及Km值得測定；測量堿性磷酸酶km值；實(shí)驗(yàn)原理 E的反應(yīng)速度受到環(huán)境因素的影響，這些因素包括底物濃度、E濃度、PH、溫度、激活劑、抑止劑等2021/9/302（一）米曼氏方程式中間產(chǎn)物 酶促反應(yīng)模式中間產(chǎn)物學(xué)說E + S k1k2k3ESE + P相關(guān)E學(xué)原理2021/9/3031913年Michaelis和Menten提出反應(yīng)速度與底物濃度關(guān)系的數(shù)學(xué)方程式，即米曼氏方程式( Michaelis equation)。S：底物濃度V： 不同S時(shí)的反應(yīng)速

2、度Vmax：最大反應(yīng)速度(maximum velocity) m：米氏常數(shù)(Michaelis constant) VmaxS Km + S 2021/9/304米曼氏方程式推導(dǎo)基于兩個假設(shè)：(1) E與S形成ES復(fù)合物的反應(yīng)是快速平衡反應(yīng)，而ES分解為E及P的反應(yīng)為慢反應(yīng)，反應(yīng)速度取決于慢反應(yīng)即 Vk3ES。(2) S的總濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于E的總濃度，因此在反應(yīng)的初始階段，S的濃度可認(rèn)為不變即SSt。 2021/9/305推導(dǎo)過程穩(wěn)態(tài)：是指ES的生成速度與分解速度相等，即 ES恒定。 K1 (EtES) SK2 ES + K3 ESK2+K3 Km （米氏常數(shù)） K1令：則(2)變?yōu)? (EtES

3、) S Km ES(2)(EtES)SK2+K3ES K1整理得：2021/9/306當(dāng)?shù)孜餄舛群芨?，將酶的活性中心全部飽和時(shí)，即EtES，反應(yīng)達(dá)最大速度VmaxK3ESK3Et (5)ES EtSKm + S(3) 整理得:將(5)代入(4)得米氏方程式：VmaxS Km + S V 將(3)代入(1) 得K3EtS Km + S (4) V2021/9/307當(dāng)反應(yīng)速度為最大反應(yīng)速度一半時(shí) Km值的推導(dǎo)KmS Km值等于酶促反應(yīng)速度為最大反應(yīng)速度一半時(shí)的底物濃度，單位是mol/L。2Km + S Vmax VmaxSVmaxVSKmVmax/2 2021/9/308（二）Km與Vmax的意

4、義 Km值 Km等于酶促反應(yīng)速度為最大反應(yīng)速度一半時(shí)的底物濃度。 意義：a) Km是酶的特征性常數(shù)之一；b) Km可近似表示酶對底物的親和力；c) 同一酶對于不同底物有不同的Km值。 2021/9/309 Vmax定義：Vm是酶完全被底物飽和時(shí)的反應(yīng)速度，與酶濃度成正比。意義：Vmax=K3 E如果酶的總濃度已知，可從Vmax計(jì)算 酶的轉(zhuǎn)換數(shù)(turnover number)，即動力學(xué)常數(shù)K3。2021/9/3010定義 當(dāng)酶被底物充分飽和時(shí)，單位時(shí)間內(nèi)每個酶分子催化底物轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)物的分子數(shù)。意義 可用來比較每單位酶的催化能力。 酶的轉(zhuǎn)換數(shù)2021/9/3011（三）m值與max值的測定雙倒數(shù)作

5、圖法(double reciprocal plot) -1/Km 1/Vmax 1/S 1/V VmaxS Km+SV = 林-貝氏(Lineweaver-Burk)方程+ 1/V=KmVmax 1/Vmax 1/S 兩邊同取倒數(shù) 2021/9/3012Hanes作圖法S S/V -Km Km/Vm 在林貝氏方程基礎(chǔ)上，兩邊同乘SS/V=Km/Vmax + S/Vmax 2021/9/3013酶濃度對反應(yīng)速度的影響當(dāng)SE，酶可被底物飽和的情況下，反應(yīng)速度與酶濃度成正比。關(guān)系式為：V = K3 E0 V E 當(dāng)SE時(shí)，Vmax = k3 E 酶濃度對反應(yīng)速度的影響 2021/9/3014雙重影響

6、溫度升高，酶促反應(yīng)速度升高；由于酶的本質(zhì)是蛋白質(zhì)，溫度升高，可引起酶的變性，從而反應(yīng)速度降低 。溫度對反應(yīng)速度的影響最適溫度 (optimum temperature)：酶促反應(yīng)速度最快時(shí)的環(huán)境溫度。* 低溫的應(yīng)用酶活性0.51.02.01.50 10 20 30 40 50 60 溫度 C 溫度對淀粉酶活性的影響 2021/9/3015pH對反應(yīng)速度的影響最適pH (optimum pH)：酶催化活性最大時(shí)的環(huán)境pH。0酶活性 pH pH對某些酶活性的影響 胃蛋白酶 淀粉酶 膽堿酯酶 2468102021/9/3016堿性磷酸酶km值的測定 以不同濃度的磷酸苯二鈉作為堿性磷酸酶的底物，在最適

7、條件下(pH=10.0，37)，準(zhǔn)確反應(yīng)15min。在堿性條件下產(chǎn)物酚可以與酚試劑作用生成藍(lán)色化合物，該藍(lán)色化合物在650nm波長比色，色澤深淺與光密度成正比。反應(yīng)式如下： 然后，以吸光度直接表示不同底物濃度時(shí)的酶反應(yīng)速度，即以吸光度的倒數(shù)作縱坐標(biāo)以底物濃度的倒數(shù)作橫坐標(biāo)，按Lineweaver-Burk作圖法求出Km值。2021/9/30171酚試劑22.5mmolL磷酸苯二鈉基質(zhì)液 3堿性緩沖液(pH-10.0)4堿性磷酸酶液【試劑】 稱取磷酸苯二鈉635mg，用蒸餾水溶解后定容至1000ml，加氯仿數(shù)滴以防腐，置于冰箱中可保存1年之久。 稱取無水Na2CO3 6.36g和NaHcO3 3

8、.36g，先以適量蒸餾水溶解，再定容至1000ml。稱取堿性磷酸酶lmg，加水34ml，置于冰箱可保存5周左右。2021/9/3018操作試劑（ml）1234562.5mM磷酸苯二鈉0.20.40.60.81.01.0蒸餾水0.80.60.40.2堿性緩沖液1.01.01.01.01.01.0混勻后，37水浴5min堿性磷酸酶0.10.10.10.10.1混勻后，37水浴15min(準(zhǔn)確計(jì)時(shí)）酚試劑1.01.01.01.01.01.0堿性磷酸酶0.110%碳酸鈉3.03.03.03.03.03.0混勻后，37水浴15min,以第6管調(diào)0與650nm比色，讀取各管A值。2021/9/3019實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)及結(jié)果管號A6501/A650s1/ s12