醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)課件

1、醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)規(guī)范化操作微量高速離心機(jī)（樣品分離）移液器（微量取液）實(shí)驗(yàn)規(guī)范化操作微量高速離心機(jī)（樣品分離）高速離心機(jī)及使用注意事項(xiàng)高速離心機(jī)及使用注意事項(xiàng)臺式高速冷凍離心機(jī)樣品的分離臺式高速冷凍離心機(jī)落地式高速冷凍離心機(jī)落地式高速冷凍離心機(jī)微量高速離心機(jī)操作裝液（1.5ml 離心管或0.2ml PCR管）標(biāo)記(記號筆)平衡（等體積相同管）放置（對稱）離心（時間按鈕，轉(zhuǎn)速按鈕） 注意點(diǎn)：緩慢轉(zhuǎn)動，記錄時間 停止（轉(zhuǎn)速按鈕回零，時間按鈕回零，完全停止后輕輕取出離心管）微量高速離心機(jī)操作裝液（1.5m

2、l 離心管或0.2ml PC使用注意事項(xiàng)1. 樣品需對稱放置；2. 先調(diào)節(jié)離心時間，離心開始緩慢提高轉(zhuǎn)速至設(shè)定值；3. 離心結(jié)束需等轉(zhuǎn)子完全停止后才能打開離心蓋，取出樣品。使用注意事項(xiàng)1. 樣品需對稱放置；移液器規(guī)范操作工作原理： 活塞通過彈簧的伸縮運(yùn)動實(shí)現(xiàn)吸液和放液。含內(nèi)置活塞，依靠推動空氣進(jìn)行吸液和放液。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時將移液器調(diào)至最大量程！移液器規(guī)范操作工作原理：含內(nèi)置活塞，依靠推動空氣進(jìn)行吸液和放量程的選擇移液器量程的選擇移液器移液循環(huán)吸頭安裝容量設(shè)定預(yù)洗吸頭吸液放液卸去吸頭移液循環(huán)吸頭安裝1、吸頭安裝旋轉(zhuǎn)安裝法: 把白套筒頂端插入吸頭在輕輕用力下壓的同時，把手中的移液器按逆時針方向旋轉(zhuǎn)18

3、0度。切記用力不能過猛，更不能采取剁吸頭的方法來進(jìn)行安裝，因?yàn)槟菢幼鰰δ种械囊埔浩髟斐刹槐匾膿p傷。1、吸頭安裝旋轉(zhuǎn)安裝法:2、容量設(shè)定一是粗調(diào)，即通過排放按鈕將容量值迅速調(diào)整至接近自己的預(yù)想值；二是細(xì)調(diào)，當(dāng)容量值接近自己的預(yù)想值以后，應(yīng)將移液器橫置，水平放至自己的眼前，通過調(diào)節(jié)輪慢慢地將容量值調(diào)至預(yù)想值，從而避免視覺誤差所造成的影響。2、容量設(shè)定一是粗調(diào)，即通過排放按鈕將容量值迅速調(diào)整至接近自 在容量設(shè)定時，還有一個需要特別注意的地方。當(dāng)我們從大值調(diào)整到小值時，剛好就行；但從小值調(diào)整到大值時，就需要調(diào)超三分之一圈后再返回，這是因?yàn)橛?jì)數(shù)器里面有一定的空隙，需要彌補(bǔ)。 在容量設(shè)定時，還有一個

4、需要特別注意的地方。當(dāng)我們3、預(yù)洗吸頭 在我們安裝了新的吸頭或增大了容量值以后，應(yīng)該把需要轉(zhuǎn)移的液體吸取、排放兩到三次，這樣做是為了讓吸頭內(nèi)壁形成一道同質(zhì)液膜，確保移液工作的精度和準(zhǔn)度，使整個移液過程具有極高的重現(xiàn)性。其次，在吸取有機(jī)溶劑或高揮發(fā)液體時，揮發(fā)性氣體會在吸頭室內(nèi)形成負(fù)壓，從而產(chǎn)生漏液的情況，這時就需要我們預(yù)洗四到六次，讓吸頭內(nèi)的氣體達(dá)到飽和，負(fù)壓就會自動消失。3、預(yù)洗吸頭 在我們安裝了新的吸頭或增大了容量值以后，4、吸液 先將移液器排放按鈕按至第一停點(diǎn)，再將吸頭垂直浸入液面，浸入的深度為：P2、P10小于或等于1毫米，P20、P100、P200小于或等于2毫米，P1000小于或等

5、于3毫米，P5ML、P10ML小于或等于4毫米,平穩(wěn)松開按鈕，切記不能過快。4、吸液 先將移液器排放按鈕按至第一停點(diǎn)，再將吸頭垂直垂直吸液；吸頭尖端需浸入液面3mm以下；緩慢吸液；垂直吸液；5、放液 放液時，吸頭緊貼容器壁，先將排放按鈕按至第一停點(diǎn)，略作停頓以后，再按至第二停點(diǎn)，這樣做可以確保吸頭內(nèi)無殘留液體。如果這樣操作還有殘留液體存在的話，您就應(yīng)該考慮更換吸頭了。5、放液 放液時，吸頭緊貼容器壁，先將排放按鈕按至第一完全打出，吸頭尖靠內(nèi)壁，排出最后的液滴；按鈕待液體完全打出后再放松血清和粘性液體的吸液和放液速度都要保持緩慢完全打出，吸頭尖靠內(nèi)壁，排出最后的液滴；血清和粘性液體的吸液正向吸液

6、2個檔位 1檔 2檔正向吸液2個檔位 1檔 2檔6、卸去吸頭 卸掉的吸頭一定不能和新吸頭混放，以免產(chǎn)生交叉污染。6、卸去吸頭 卸掉的吸頭一定不能和新吸頭混放，以免產(chǎn)生用大量程的移液器移取小體積的液體裝配吸頭時氣密性不好，吸頭不匹配吸液速度和放液速度太快 自我檢測漏氣：吸取液體，垂直靜置5秒，觀察是否有液滴流出；規(guī)范操作，損壞賠償！移液不準(zhǔn)確的常見原因：用大量程的移液器移取小體積的液體自我檢測漏氣：吸取液體，垂直實(shí)驗(yàn)報告要求實(shí)驗(yàn)報告要求實(shí)驗(yàn)報告按下列要求書寫1. 實(shí)驗(yàn)題目當(dāng)次實(shí)驗(yàn)2. 實(shí)驗(yàn)原理簡明扼要，有針對性3. 操作步驟最好是流程或表格形式4. 注意事項(xiàng)5. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖表、數(shù)據(jù)或現(xiàn)象6. 結(jié)

7、果分析根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，結(jié)合理論分析、體會7. 思考題實(shí)驗(yàn)報告按下列要求書寫1. 實(shí)驗(yàn)題目當(dāng)次實(shí)驗(yàn)堿裂解法提取重組質(zhì)粒DNA 醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)堿裂解法提取重組質(zhì)粒DNA 醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)獨(dú)立于染色體外，非宿主生長所必需，能進(jìn)行復(fù)制和遺傳的輔助性遺傳單位。質(zhì)粒 (plasmid)獨(dú)立于染色體外，非宿主生長所必需，能進(jìn)行復(fù)制和遺傳的輔助性遺堿裂解法原理利用質(zhì)粒DNA和染色體DNA的變性與復(fù)性的差異達(dá)到分離目的。 強(qiáng)堿條件下破壞堿基配對，使宿主菌的染色體DNA變性解鏈，但閉環(huán)質(zhì)粒DNA鏈由于處于拓?fù)淅p繞狀態(tài)而不能彼此分開。當(dāng)條件恢復(fù)正常時，質(zhì)粒DNA鏈迅速得到準(zhǔn)確配對，重新形成完全天然的超螺旋分子。

8、 質(zhì)粒DNA染色體DNA堿裂解法原理利用質(zhì)粒DNA和染色體DNA的變性與復(fù)性的差異達(dá)堿裂解法：在堿性條件（NaOH, pH12.0-12.6）下，用EDTA和SDS裂解細(xì)胞，并使細(xì)胞的蛋白質(zhì)與DNA發(fā)生變性，釋放出質(zhì)粒DNA。細(xì)胞壁及膜的碎片與變性的蛋白質(zhì)和染色體DNA形成纏連的、不溶性的網(wǎng)狀、大的復(fù)合物，在高鹽條件下可有效沉淀；當(dāng)pH調(diào)至中性時，質(zhì)粒DNA就可重新恢復(fù)天然的超螺旋，保留在上清液中，經(jīng)離心可與染色體DNA等分離。苯酚可變性蛋白質(zhì)；氯仿加速有機(jī)相和水相分離；異戊醇減少蛋白質(zhì)變性過程中產(chǎn)生的氣泡。使用預(yù)冷無水乙醇沉淀上清液中的質(zhì)粒DNA，再用70%的乙醇洗滌。 堿裂解法：在堿性條件

9、（NaOH, pH12.0-12.6）下質(zhì)粒DNA的提取步驟收集宿主細(xì)菌菌體裂解質(zhì)粒分離去除雜質(zhì)濃縮沉淀質(zhì)粒DNA的提取步驟收集宿主細(xì)菌實(shí)驗(yàn)步驟：取已培養(yǎng)好菌液1.4ml, 8000 rpm離心1min,棄盡上清 （倒扣，流盡液體）；菌體沉淀重懸于100 l預(yù)冷的溶液I中，振蕩使菌體分散 （使菌體完全重懸）；加200 l 溶液II，蓋緊管蓋，溫和顛倒混勻數(shù)次，室溫靜止5 min （避免DNA斷裂)；加150 l 溶液III ，溫和顛倒混勻數(shù)次，冰浴 5 min；10000 rpm離心5min, 取上清（？l）至新的離心管中。加等體積苯酚/氯仿/異戊醇，顛倒混勻，12000 rpm離心5 min

10、；取上清（？l）至新的離心管中，加2.5倍體積預(yù)冷的無水乙醇，混勻，冰浴10min，12000 rpm離心5 min；棄上清，沉淀加1ml預(yù)冷的70乙醇洗滌，10000 rpm/5min；棄盡上清，沉淀于溫箱干燥后，加50l TE 溶液溶解，50水浴10min后，用于PCR和酶切。 （不能殘留乙醇）。實(shí)驗(yàn)步驟：取已培養(yǎng)好菌液1.4ml, 8000 rpm離心1溶液I，50 mM葡萄糖 / 25 mM Tris-Cl / 10 mM EDTA， pH 8.0溶液II，0.2 M NaOH / 1% SDS溶液III，3 M 醋酸鈉 / 2 M 醋酸溶液I，50 mM葡萄糖 / 25 mM Tri

11、s-Cl /思考題堿裂解法提取質(zhì)粒DNA的原理和方法？溶液I，II，III的作用？苯酚，氯仿，異戊醇的作用？無水乙醇，70乙醇的作用？TE溶液（pH8.0）,RNase A的作用？思考題堿裂解法提取質(zhì)粒DNA的原理和方法？聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR實(shí)驗(yàn)原理 PCR技術(shù)是利用DNA的變性、復(fù)性原理在體外進(jìn)行特定的DNA序列高效擴(kuò)增的技術(shù)，在試管中，在模板DNA、引物和4種脫氧核苷酸存在的條件下，依賴于DNA聚合酶進(jìn)行的酶促合成反應(yīng)，由變性-退火-延伸反復(fù)循環(huán)完成擴(kuò)增。實(shí)驗(yàn)原理 PCR技術(shù)是利用DNA的變性、復(fù)性原理在操作步驟1. 反應(yīng)體系的配置2. 反應(yīng)條件的設(shè)置3.產(chǎn)物的鑒定和分

12、析操作步驟1. 反應(yīng)體系的配置重組質(zhì)粒DNA質(zhì)粒載體 2692bpAmp目的基因 (205bp)重組質(zhì)粒DNA質(zhì)粒載體 2692bpAmp目的基因 (PCR反應(yīng)體系 (20 l)ddH2O 14.0 l 10緩沖液（Buffer） 2.0 l dNTP 2.0 l primer 1(P1) 0.4 l primer 2(P2) 0.4 l Taq 酶 0.2 l 重組質(zhì)粒DNA 1.0 l空白對照：以H2O替代重組質(zhì)粒DNA作為模板請使用合適量程加樣器！20 lPCR反應(yīng)體系 (20 l)ddH2O PCR反應(yīng)步驟和條件：預(yù)變性 94 2 min變性 94 20 s 退火 55 20 s 延伸

13、 72 20 s 延伸 72 5 min 30 cyclesPCR反應(yīng)步驟和條件：預(yù)變性 94 2 min30 c思考題PCR實(shí)驗(yàn)中造成假陽性的原因可能有哪些?思考題PCR實(shí)驗(yàn)中造成假陽性的原因可能有哪些?PCR反應(yīng)產(chǎn)物檢測 瓊脂糖凝膠電泳PCR反應(yīng)產(chǎn)物檢測 瓊脂糖凝膠電泳目的要求 掌握瓊脂糖凝膠電泳分離核酸原理及方法； 掌握熒光染料使DNA染色原理； 掌握電泳結(jié)果觀察分析方法; 目的要求 掌握瓊脂糖凝膠電泳分離核酸原理及方法；瓊脂糖瓊脂糖是從瓊脂中提取出來的，由D-半乳糖和3,6-脫水-L-半乳糖組成的鏈狀多糖分子，可以形成具有剛性的網(wǎng)孔狀凝膠。瓊脂糖的濃度決定凝膠孔徑的大小。瓊脂糖瓊脂糖是

14、從瓊脂中提取出來的，由D-半乳糖和3,6-脫水-+-+實(shí)驗(yàn)原理 瓊脂糖凝膠電泳是分離、純化、鑒定核酸最常用的方法，在pH8.0的緩沖液中，核酸帶負(fù)電荷，在電場中向正極移動，由于分子篩效應(yīng)，可將分子大小和構(gòu)象不同的核酸分子分離，不同濃度的凝膠可分離不同分子大小的DNA片段。 實(shí)驗(yàn)原理 瓊脂糖凝膠電泳是分離、純化、鑒定核酸最常123456123456醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)課件瓊 脂 糖 凝 膠 電 泳 系 統(tǒng)瓊 脂 糖 凝 膠 電 泳 系 統(tǒng)紫外投射分析儀：紫外投射分析儀：凝 膠 成 像 系 統(tǒng)凝 膠 成 像 系 統(tǒng)瓊脂糖凝膠電泳操作步驟樣品：PCR產(chǎn)物 10 l加上樣緩沖液2 l，加熒光染料如Syb

15、r Green I (SG) 2 l，混勻取10 l加入加樣孔中 (記錄樣品次序)110V穩(wěn)壓，電泳約至凝膠2/3處紫外燈下觀察結(jié)果(與DNA Marker比較)記錄并畫出示意圖注意：加樣時持移液器的手以肘部固定在桌上，用另一只手扶住這只手的手腕，以減少移液器的抖動。加樣器吸頭應(yīng)恰好置于凝膠點(diǎn)樣孔中，不可刺穿凝膠，也要防止將樣品溢出孔外造成鄰孔之間相互污染。瓊脂糖凝膠電泳操作步驟樣品：PCR產(chǎn)物 10 l注意：加上樣緩沖液 (Loading Buffer)上樣緩沖液組成：電泳指示劑與蔗糖(或甘油)組成上樣緩沖液電泳指示劑：溴酚蘭 （紫蘭色）二甲苯青 （蘭色）上樣緩沖液作用：1）使樣品呈色，便于

16、加樣操作2）增加樣品密度和比重，以確保DNA樣品均勻沉入加樣孔內(nèi)3）在電泳中形成肉眼可見的指示帶，可判斷DNA電泳的速度和位置上樣緩沖液 (Loading Buffer)上樣緩沖液組成：熒光染料 (如SYBR Green I)SYBR Green I 熒光染料SYBR Green I嵌入DNA的堿基平面后，本身無熒光的DNA在紫外光激發(fā)下發(fā)出熒光，且熒光強(qiáng)度與DNA含量呈正比。熒光染料 (如SYBR Green I)SYBR GreenDNA 分子標(biāo)準(zhǔn)物 (DNA Marker)DL20001 kb DNA Ladder 100 bp DNA LadderDNA 分子標(biāo)準(zhǔn)物 (DNA Mark

17、er)DL20001 瓊脂糖凝膠電泳優(yōu)點(diǎn)： 操作簡便 電泳速度快 透明而不吸收紫外線，電泳后易染色和回收 瓊脂糖結(jié)構(gòu)均勻，以其作為介質(zhì)進(jìn)行電泳得到的DNA條帶清晰、分辨率高、重復(fù)性好瓊脂糖凝膠電泳應(yīng)用： 核酸分離鑒定 (質(zhì)粒DNA分析) 核酸產(chǎn)物分析 (PCR產(chǎn)物分析；DNA酶切圖譜分析) 核酸純化回收 (基因克隆)瓊脂糖凝膠電泳優(yōu)點(diǎn)：影響DNA電泳遷移率的主要因素： DNA的分子大?。壕€性雙鏈DNA分子通過凝膠的速率與其分子量的常用對數(shù)成反比。 DNA的分子構(gòu)象：相同分子量的閉環(huán) (型)，開環(huán) (型)和線狀(型)的質(zhì)粒DNA，在瓊脂糖凝膠中電泳速率不同。遷移率型型型。 瓊脂糖凝膠的濃度：一定

18、大小的DNA片段在不同濃度的瓊脂糖凝膠中的遷移率不同。在一定濃度的瓊脂糖凝膠中，不同大小的DNA片段的遷移率也不同。 電場強(qiáng)度和離子強(qiáng)度影響DNA電泳遷移率的主要因素： DNA的分子大?。壕€性雙鏈線性雙鏈DNA分子遷移率與其相對分子量成反比 M 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 100 bp 200 bp 300 bp 500 bp 1000 bp 電泳方向正極負(fù)極線性雙鏈DNA分子遷移率與其相對分子量成反比 M 相同分子量不同構(gòu)型的DNA分子遷移率不同三種構(gòu)型的質(zhì)粒電泳模式圖譜超螺旋 線性 開環(huán)加樣孔開環(huán)線性超螺旋相同分子量不同構(gòu)型的DNA分子遷移率不同三種構(gòu)型的質(zhì)粒電泳模瓊脂糖凝膠濃

19、度(%)線性DNA分子的有效分離范圍(kb)0.61.0-200.70.8-100.90.5-71.20.4-61.50.2-42.00.1-3瓊脂糖凝膠濃度和DNA分子的有效分離范圍瓊脂糖凝膠濃度(%)線性DNA分子的有效分離范圍(kb)0.DNA Marker(DL2000)M - PCRDNA Marker(DL2000)M - PCRPCR產(chǎn)物電泳圖300bp引物二聚體目的片段1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 1. DNA marker2-13. PCR擴(kuò)增產(chǎn)物14. 空白對照PCR產(chǎn)物電泳圖300bp引物二聚體目的片段1 2 圖1圖2請?jiān)u價和分析圖1、

20、圖2 PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果！圖1圖2請?jiān)u價和分析圖1、圖2 PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果！思考題：1. 瓊脂糖凝膠電泳鑒定DNA的基本原理？2. 影響DNA電泳遷移率的因素有哪些？ 3. 上樣緩沖液的成分和作用？思考題：1. 瓊脂糖凝膠電泳鑒定DNA的基本原理？重組質(zhì)粒的限制酶酶切重組質(zhì)粒的限制酶酶切限制性核酸內(nèi)切酶（restriction endonuclease, RE）簡稱限制酶，是一類能識別和切割雙鏈DNA分子內(nèi)特定堿基順序的核酸內(nèi)切酶，為原核生物所特有。型限制酶被稱為基因工程的分子剪刀。限制性核酸內(nèi)切酶（restriction endonuc實(shí)驗(yàn)原理 II型限制酶專一行性的識別4-6個具有回文結(jié)構(gòu)的堿基序列，并在識別序列特定位置上切割DNA雙鏈。 酶切的效率受溫度、pH、鹽濃度等影響。酶切產(chǎn)物常用瓊脂糖凝膠電泳來鑒