念珠菌對(duì)唑類抗真菌藥耐藥機(jī)理及基相關(guān)因素的研究進(jìn)展

1、念珠菌對(duì)唑類抗真菌藥耐藥機(jī)理及基相關(guān)因素的研究進(jìn)展摘要:唑類抗真菌藥耐藥的念珠菌株呈現(xiàn)增多趨勢(shì)，許多學(xué)者從不同方面進(jìn)展了研究。綜述念珠菌對(duì)唑類藥物的耐藥現(xiàn)象和耐藥產(chǎn)生的相關(guān)因素，以及對(duì)耐藥機(jī)理從基因程度進(jìn)展研究的新進(jìn)展。隨著抗真菌藥的臨床應(yīng)用，耐藥菌株逐漸產(chǎn)生。近年來有關(guān)對(duì)真菌藥物耐受的念珠菌報(bào)道增多，已引起醫(yī)學(xué)界和藥學(xué)界廣泛關(guān)注，許多學(xué)者對(duì)此進(jìn)展了深化討論和研究。一、念珠菌對(duì)唑類藥物的耐藥現(xiàn)象一耐藥菌株的增多與傳播：HIV感染、器官移植、惡性腫瘤患者，由于免疫功能低下或抑制，易伴發(fā)條件致病性感染特別是真菌感染，60%80%艾滋病患者有一種或幾種真菌感染。唑類藥物廣泛用于臨床治療和預(yù)防，由于長

2、期反復(fù)和大劑量應(yīng)用，耐藥菌株和發(fā)生率日趨升高。據(jù)報(bào)道法國Pasteur醫(yī)院和其它幾個(gè)研究中心1994年別離自艾滋病患者的念珠菌株10%對(duì)氟康唑耐藥1。而新近的統(tǒng)計(jì)資料顯示，在艾滋病患者口咽感染念珠菌中，33以上是耐藥菌株，對(duì)氟康唑的最小抑菌濃度I12.5g/l敏感菌株I值一般4g/l2。Drer等報(bào)道在10對(duì)已保持性關(guān)系專一并穩(wěn)定1年以上的HIV陽性伴念珠菌感染的患者中，有13例口咽別離的感染菌株對(duì)氟康唑耐藥。從未用過唑類藥物的5例患者，其性伴感染的念珠菌株卻均對(duì)氟康唑有耐藥性。進(jìn)一步通過DNA限制性片段長度多態(tài)分析RFLP發(fā)現(xiàn)，這些感染菌株具有很近的種系關(guān)系，上述10對(duì)性伴中有6對(duì)的別離菌具

3、有一個(gè)以上的一樣克隆片段，因此可認(rèn)為耐藥菌株可以通過性伴傳播3。二耐藥菌株對(duì)唑類藥物具有穿插耐藥性：HexiaGang對(duì)別離自HIV感染者的212株白念珠菌以下簡稱白念研究發(fā)現(xiàn)，多數(shù)菌株對(duì)氟康唑敏感，I值2g/l,這些菌株對(duì)伊曲康唑的I50及I90值也相應(yīng)較低,范圍在0.05g0.1g/l之間。另有61株對(duì)氟康唑敏感性較差，其I值為4g62g/l,I50及I90值分別是8g/l、64g/l；同時(shí)測(cè)得伊曲康唑?qū)@些菌株的I50和I90值分別是0.2g/l和0.4g/l。由此可見，這些菌株不但對(duì)氟康唑不敏感，對(duì)伊曲康唑的I50和I90值也相應(yīng)增高了約4倍。盡管臨床上尚未證實(shí)唑類藥物間的穿插耐藥性，

4、但這項(xiàng)實(shí)驗(yàn)室研究結(jié)果顯示了氟康唑與伊曲康唑間的穿插耐藥現(xiàn)象4。另有研究結(jié)果也支持這一論點(diǎn)，并進(jìn)一步指出靶酶編碼基因和膜上轉(zhuǎn)運(yùn)泵編碼基因的突變、缺失和過分表達(dá)是穿插耐藥產(chǎn)生的物質(zhì)根底5。三耐藥現(xiàn)象導(dǎo)致了感染菌種的變遷：Prie等對(duì)美國一家醫(yī)院1987至1992年5年間別離的念珠菌進(jìn)展氟康唑體外敏感試驗(yàn)，并對(duì)血標(biāo)本中菌種的分布進(jìn)展了氟康唑使用前后比照研究，發(fā)現(xiàn)I值具有明顯的種間差異，白念對(duì)氟康唑最敏感，而光滑念珠菌敏感性最差。這一結(jié)果與年間菌血癥致病菌種的變遷相一致。在氟康唑使用前和使用初期，白念感染率為87%，但到1992年氟康唑已廣泛應(yīng)用只占感染菌株的31%。在此期間，光滑念珠菌的感染率由2%

5、升到26%；熱帶念珠菌從2%升到24%；克柔念珠菌從9%升到20%。由此可見，隨著氟康唑廣泛應(yīng)用，導(dǎo)致了念珠菌菌血癥致病菌向非白念的變遷6。然而并非所有學(xué)者認(rèn)為臨床治療可導(dǎo)致酵母感染菌種變遷。Sbel在10余年的臨床理論中，對(duì)許多念珠菌性陰道炎患者盡管長期給予酮康唑治療，但并未發(fā)現(xiàn)引起陰道炎的酵母菌種發(fā)生改變7。二、念珠菌對(duì)唑類藥物產(chǎn)生耐藥的相關(guān)因素一細(xì)胞免疫低下或缺陷易導(dǎo)致耐藥菌株產(chǎn)生：對(duì)伴口咽念珠菌感染的HIV患者研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞免疫降低者對(duì)念珠菌有易感性，同時(shí)在這些患者身上也易發(fā)生耐藥現(xiàn)象。在臨床治療失敗的病例中，測(cè)其I值明顯升高，且在D4細(xì)胞數(shù)20l患者身上耐藥顯著高發(fā)，提示耐藥的產(chǎn)生除

6、與氟康唑的長期應(yīng)用有關(guān)外，D4細(xì)胞數(shù)減少更易產(chǎn)生耐藥菌株8。Redding觀察1例反復(fù)發(fā)生口咽念株菌感染的患者，在2年反復(fù)14次治療中，氟康唑有效量由100g/d快速升至800g/d，I值亦由0.25g/l上升到64g/l。其間測(cè)得患者D4細(xì)胞數(shù)是9/l。在第15次再次發(fā)病時(shí)，氟康唑800g/d已經(jīng)無效9。有學(xué)者推斷，免疫系統(tǒng)嚴(yán)重缺陷可能阻止抗真菌藥物效應(yīng)的正常發(fā)揮。二藥物與機(jī)體感染狀況對(duì)念珠菌耐藥有誘導(dǎo)作用：Vuffray等對(duì)口服氟康唑150g/d已耐藥的口咽念珠菌感染的HIV患者改用更高劑量，其中91例次治療失敗者既往用藥的平均累積量是10600g,而119例次治療有效的平均累積量是440

7、0g。兩者用藥累積量有顯著性差異P0.001。提示藥物的應(yīng)用與菌株耐藥的產(chǎn)生親密相關(guān)10。aern等隨機(jī)選擇87例HIV陽性患者分組研究，對(duì)其中22例有口咽或食管感染病癥和17例無病癥的白念別離菌株進(jìn)展唑類藥敏感試驗(yàn)兩組患者均有唑類藥應(yīng)用史，兩組I值有非常顯著性差異P0.0001；前者高于后者。接著又對(duì)分別來自未經(jīng)唑類藥治療的無病癥和有病癥患者的別離菌株進(jìn)展I值比照分析，其P值0.0001，有病癥者顯著高于無病癥者。以上研究結(jié)果顯示藥物應(yīng)用史和感染病癥與唑類藥物對(duì)其致病菌株的I值升高顯著相關(guān)。作者又對(duì)其余非白念菌株進(jìn)展上述比照研究，結(jié)論一樣11。三菌株的耐藥性可能經(jīng)遺傳獲得：挪威學(xué)者對(duì)13株挪

8、威念珠菌進(jìn)展氟康唑藥敏試驗(yàn)，其中11株別離自1990至1996年門診就醫(yī)的8例惡性病患者，其中僅2例有氟康唑治療史，另2株為60年前的保藏菌。結(jié)果對(duì)所有菌株I值均32g/l。60年前的保藏菌株和未經(jīng)治療者的致病菌株亦出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象，提示耐藥并非均為唑類藥物應(yīng)用所誘導(dǎo)，菌株的耐藥性很可能具有遺傳性12。有研究推測(cè)這些耐藥表型至少可以穩(wěn)定600代13。因此，患者最初感染的可能即為具有遺傳穩(wěn)定性的耐藥菌株，也可能在長期唑類藥臨床應(yīng)用中由敏感菌株突變成為耐藥菌株。耐藥的產(chǎn)生與許多和未知的因素有關(guān)，但藥物的長期反復(fù)治療和預(yù)防應(yīng)用起著關(guān)鍵作用。因此有學(xué)者指出應(yīng)最大限度地防止上述用藥方式。并提出兩條防止和延緩

9、耐藥產(chǎn)生的措施：短期大劑量用藥以盡快有效地殺滅真菌，降低耐藥突變的發(fā)生率。對(duì)于唑類耐藥的菌株，除了加大劑量外，適時(shí)換用其它藥物也是非常必要的14。三、念珠菌對(duì)唑類藥物的耐藥機(jī)理迄今為止，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為念珠菌對(duì)唑類藥物的耐藥主要通過以下三條途徑：細(xì)胞膜對(duì)唑類藥物通透性改變，細(xì)胞攝取和蓄積的藥物量降低。藥物作用的靶酶-14去甲基化酶14D產(chǎn)生過多。靶酶對(duì)藥物的親和力降低。后二條可歸納為唑類藥物作用靶酶的改變。通常認(rèn)為，膜通透性的改變起更重要的作用。有學(xué)者對(duì)敏感和耐藥的光滑念珠菌研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)3H標(biāo)記的氟康唑，敏感菌株攝入率是0.330.02pl/in，耐藥菌株幾乎不能顯示熒光攝入。同時(shí)測(cè)兩者I5050

10、%inhibitinfinrpratin值相近，I50反映藥物對(duì)靶酶抑制作用，靶酶改變無明顯差異。說明膜通透性改變?cè)谀退幃a(chǎn)生中起關(guān)鍵作用15。一對(duì)靶酶變化的研究：唑類藥物作用的靶酸是膜成分麥角固醇合成中不可缺少的中間合成酶，唑類藥物對(duì)此具有強(qiáng)的親和性，從而抑制酶的催化活性，麥角固醇合成受阻，胞膜構(gòu)造破壞，真菌生長抑制。靶酶構(gòu)造改變以及其過度表達(dá)均可導(dǎo)致念珠菌耐藥，許多學(xué)者對(duì)這一耐藥機(jī)理進(jìn)展了研究。從理論上講，靶酶編碼基因Erg16的擴(kuò)增可致其過度表達(dá)。Sanglard等人用URA3-14D雜交基因探針對(duì)別離自5例艾滋病患者的16株白念進(jìn)展DNA分析，結(jié)果無論耐藥還是敏感菌株，其靶酶基因Erg1

11、6的拷貝數(shù)均無變化。因此推測(cè)靶酶的過度表達(dá)并非由基因Erg16的擴(kuò)增所致。Sanglard又采用Nrthernblt方法對(duì)耐藥和敏感菌株靶酶的RNA含量進(jìn)展測(cè)定。發(fā)現(xiàn)大部分RNA含量高的菌株，其I值相應(yīng)增高。但有1株靶酶RNA含量高的菌株，I值卻顯著低于另1株RNA含量低的菌株。因此僅用靶酶RNA含量升高只能部分地解釋耐藥現(xiàn)象的產(chǎn)生16。由靶酶過分表達(dá)而耐唑類藥物的實(shí)驗(yàn)室根據(jù)有待進(jìn)一步深化討論。hite曾對(duì)17株白念Erg16基因進(jìn)展分析，該基因含有始動(dòng)區(qū)域的5個(gè)片段PAPE，編碼區(qū)域的7個(gè)片段和終止區(qū)域的3個(gè)片段TAT。利用PR-SSP技術(shù)對(duì)這些片段擴(kuò)增后行序列分析。與敏感菌株相對(duì)照，耐藥菌

12、株在編碼區(qū)域第7片段近3端的1547位點(diǎn)發(fā)生堿基突變，鳥嘌呤G由腺嘌呤A取代，相應(yīng)地Erg16編碼蛋白質(zhì)也發(fā)生改變，位于467位點(diǎn)的精氨酸Arg由賴氨酸Lys替代。這一位點(diǎn)正處于靶酶的活性中心，它改變了酶的活性，也引起菌株對(duì)唑類的耐藥。對(duì)PE片段位點(diǎn)-367至-284序列分析發(fā)現(xiàn)，耐藥菌株可以有多處等位基因異質(zhì)性hetergeniity，并在-284位點(diǎn)有等位基因缺失突變。推測(cè)可能與基因重組和基因轉(zhuǎn)換有關(guān)，這些突變基因與菌株對(duì)唑類耐藥有關(guān)17。二細(xì)胞膜對(duì)唑類藥物通透性改變是真菌耐藥的一個(gè)主要因素：有實(shí)驗(yàn)測(cè)知敏感白念菌株胞內(nèi)唑類濃度是胞外的2.5倍以上，而耐藥菌株胞內(nèi)僅是胞外的1/2。耐藥菌株膜

13、通透性的改變，主要依賴膜上兩種蛋白泵的功能改變。一種泵是ATP能量依賴型的多藥載體亦稱ABtransprters，進(jìn)展能量依賴的主動(dòng)運(yùn)輸；另一種泵簡稱BEN，通過電化學(xué)勢(shì)能進(jìn)展被動(dòng)運(yùn)輸，屬于非能量依賴型載體。這兩種與耐藥有關(guān)的載體被劃屬于AB超家族和F超家族16。這兩種泵將細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞外。研究發(fā)現(xiàn)，膜對(duì)唑類通透性降低不是由于藥物攝入的減少，而是由胞內(nèi)泵出藥物的增多，即兩種泵功能的增強(qiáng)與耐藥親密相關(guān)。有學(xué)者對(duì)這兩種蛋白泵的基因進(jìn)展分析，在別離自5例艾滋病患者的17株白念中，菌株2號(hào)、3號(hào)、16號(hào)、17號(hào)的I值較基余菌株有明顯升高。用斑點(diǎn)雜交的方法檢測(cè)兩種蛋白泵基因DR編碼AB蛋白泵和DR

14、編碼BEN蛋白泵的RNA程度。結(jié)果DR的RNA程度在16和17號(hào)菌株比在115號(hào)菌株約增高5倍。DR的RNA程度根本呈現(xiàn)隨I值而升高的趨勢(shì)，第1株反映RNA程度的熒光信號(hào)很弱，RNA程度很低，2號(hào)和3號(hào)菌株熒光信號(hào)大大增強(qiáng)，RNA程度分別是1號(hào)的12倍和25倍。因此推測(cè)蛋白泵的RNA程度升高是耐藥的分子生物學(xué)改變5。進(jìn)一步分析認(rèn)為轉(zhuǎn)錄程度的升高和RNA加帽和多聚尾的修飾改變可能是RNA含量升高的主要原因。也有學(xué)者認(rèn)為一些開放閱讀框架RFs，編碼氨基酸的三聯(lián)體長鏈，無終止密碼子，是基因存在的區(qū)域可能與AB和F兩家族的基因編碼有關(guān)。Alar的研究結(jié)果顯示對(duì)白念F家族的編碼基因BEN的啟動(dòng)子AP1的

15、過分表達(dá)可致菌株耐藥，但開放閱讀框架有缺失突變時(shí)該菌株的耐藥性可被大大地抑制或消失。FLR1Flunazleresistane1的表達(dá)又受AP1蛋白的調(diào)節(jié)，F(xiàn)LR1的表達(dá)可被AP1的過分表達(dá)所誘導(dǎo)。因此FLR1，這個(gè)編碼F家族多藥載體的開放閱讀框架可能是受AP1蛋白調(diào)控的一種決定菌株耐藥性的分子因素18。上述研究顯示，在菌株產(chǎn)生耐藥過程中，可能通過三條耐藥途徑，也可能主要通過一條途徑。但耐藥機(jī)理的說明尚需多方面拓寬和深化研究。參考文獻(xiàn)NeanSLetal.linInfetDis,1994;19:684686LaDetal.JAntiirbhether,1996,34:659668HeXGeta

16、l.AntiirbAgentshether,1994;38(10):24952497hiteTetal.AntiirbAgentshether,1997;41(7):14821487PrieFetal.AntiirbAgentshether,1994;38(6):14221424SbelJDetal.linInfetDis,1992;14(Suppl1):148153brSangerzanJAetal.AJed,1994;97(4)：339346ReddingSLetal.linInfetDis,1994;18:240242VuffrayAetal.AIDS,1994;8:708709aernetal.AntiirbAgentshether,1993;37(11):24492453SandveaDetal.AntiirbAgentshether,1997;41(6):13751376hiteTetal