公共場(chǎng)所環(huán)境樣品中嗜肺軍團(tuán)菌定量檢驗(yàn)方法

1、 公共場(chǎng)所環(huán)境樣品中嗜肺軍團(tuán)菌定量檢驗(yàn)方法范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了公共場(chǎng)所空氣、水、土等不同類別環(huán)境樣品中嗜肺軍團(tuán)菌的定量檢測(cè)方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于公共場(chǎng)所環(huán)境樣品中嗜肺軍團(tuán)菌的定量檢測(cè)，其他環(huán)境樣品中嗜肺軍團(tuán)菌的定量檢測(cè)可參照?qǐng)?zhí)行。規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T 18204.3 公共場(chǎng)所衛(wèi)生檢驗(yàn)方法 第3部分：空氣微生物GB/T 18204.5 公共場(chǎng)所衛(wèi)生檢驗(yàn)方法 第5部分：集中空調(diào)通風(fēng)系統(tǒng)空氣中嗜肺軍團(tuán)菌定量檢測(cè)原理采用液體沖擊法采樣、疊氮溴乙錠（EM

2、A）前處理結(jié)合定量聚合酶鏈反應(yīng)（qPCR）方法定量檢測(cè)室內(nèi)空氣和集中空調(diào)送風(fēng)中存活的嗜肺軍團(tuán)菌。儀器和設(shè)備微生物氣溶膠濃縮器：采樣流量100L/min，3.0m以上粒子的捕集效率80%（或濃縮比8）。液體沖擊式微生物氣溶膠采樣器：采樣流量7L/min15L/min，0.5m以上粒子的捕集效率90%。便攜式冷藏箱。冷凍離心機(jī)：溫度4C。恒溫水浴鍋或金屬?。簻囟确秶?0C99C。熒光定量PCR儀：非耦合6色激發(fā)光片和6色檢測(cè)濾光片通道，4C100C溫度范圍。鹵素?zé)簦?00W。渦旋震蕩器：調(diào)速范圍 03000 rpm。材料和試劑酵母浸出粉。蒸餾水。EMA固體粉：5mg/管。無核酸酶去離子水。礦物油，

3、用于減少氣溶膠采樣時(shí)的吸收液蒸發(fā)。核酸提取試劑盒：DNA產(chǎn)量1530g，A260/A280在1.71.9之間。引物：上游引物 5-GAAAATAAAGTAAAAGGGGAAGCC-3； 下游引物 5-ATCAATCAGACGACCAGTGTATTC-3。探針：5-FAM-AGGCGTTGTTGTATTGCCAAGTGGTT-TAMRA-3。標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒。熒光定量PCR反應(yīng)體系。離心管：1.5mL透明離心管和1.5mL棕色離心管。離心管：15mL，50mL。樣品的采集采樣吸收液成分： 酵母浸出粉 12 g 蒸餾水 1000 mL采樣吸收液制法：將酵母浸出粉（3.3.1）12g加蒸餾水至1000mL

4、，121 下高壓滅菌15 min，每20mL采樣吸收液分裝于滅菌后的50mL離心管（3.3.12）中備用。采樣點(diǎn)：室內(nèi)空氣按GB/T18204.3中6.4.1規(guī)定，集中空調(diào)送風(fēng)按GB/T18204.5 中9.5.1規(guī)定。將裝有采樣吸收液的離心管置于便攜式冷藏箱（3.2.3）中送到現(xiàn)場(chǎng)，開始采樣前將采樣吸收液（3.4.2）20mL倒入微生物氣溶膠采樣器（3.2.2）中，然后用吸管加入礦物油（3.3.5）1滴2滴。將微生物氣溶膠濃縮器（3.2.1）與微生物氣溶膠采樣器（3.2.2）連接，按照微生物氣溶膠濃縮器和微生物氣溶膠采樣器的流量要求調(diào)整主流量和濃縮流量。按濃縮器和采樣器說明書操作，每個(gè)氣溶膠

5、樣品采集空氣量1m32m3；并記錄環(huán)境溫度、大氣壓力和總采氣體積或采樣流量、采樣時(shí)間。采集的樣品倒入離心管置于便攜式冷藏箱中避光保存，4h內(nèi)送實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)。樣品處理方法與條件樣品的離心濃縮：將采集的氣溶膠樣品（3.4.7）于4下8000g離心20min（3.2.4），小心吸取棄去上清，剩余1mL左右沉淀全部轉(zhuǎn)移至1.5mL的透明離心管中，再次4下8000g離心20min，棄去上清，剩余0.5mL沉淀。EMA母液C21H18BrN5=10mg/mL的制備：取1管5mg EMA固體粉（3.3.3），短暫離心后加入0.5mL滅菌無核酸酶去離子水（3.3.4）。顛倒混勻，短暫離心收集管壁液體，每100l

6、分裝于1.5ml棕色離心管（3.3.11）中，-20避光保存。EMA工作液C21H18BrN5=100g/mL的制備：取10lEMA母液（3.5.2）加990l滅菌無核酸酶去離子水（3.3.4）。顛倒混勻，短暫離心收集管壁液體，置于1.5ml棕色離心管中。每1000l的EMA工作液可處理70份左右樣品，EMA工作液現(xiàn)用現(xiàn)配，使用前計(jì)算好所需EMA工作液量。樣品避光孵育：取0.5mL經(jīng)過離心濃縮的氣溶膠樣品（3.5.1）置于1.5mL透明離心管中，鋁箔包裹以便避光。加入13LEMA工作液（3.5.3），反復(fù)顛倒，混合均勻，短暫離心收集管壁液體，4避光孵育5min。樣品光照活化：去掉包裹離心管的鋁

7、箔，將離心管水平放置在碎冰上，調(diào)整樣品與鹵素?zé)簦?.2.7）的距離，使其垂直距離為15cm，光照5min。光照階段需混勻樣品1次2次，使光照均勻，防止樣品過熱。樣品存放：光照結(jié)束后，4保存樣品，24h內(nèi)提取核酸。樣品核酸提取由于樣品核酸提取的條件與操作步驟因使用試劑盒的不同而有差異，所以應(yīng)根據(jù)所使用的核酸提取試劑盒的操作手冊(cè)進(jìn)行操作。附錄A所列的空氣中嗜肺軍團(tuán)菌核酸提取操作步驟是一個(gè)實(shí)例。熒光定量PCR條件與擴(kuò)增步驟標(biāo)準(zhǔn)品系列制備：將標(biāo)準(zhǔn)品母液（3.3.8）以十倍梯度依次稀釋，在107copies/mL102copies/mL濃度范圍內(nèi)制備十倍梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品系列。稀釋方式舉例如下：取10L濃

8、度為X107copies/mL的標(biāo)準(zhǔn)品母液，編號(hào)為，加入90L無核酸酶去離子水輕柔混勻，濃度為X106copies/mL，編號(hào)為；取10L濃度為的標(biāo)準(zhǔn)品，加入90L 無核酸酶去離子水輕柔混勻，濃度為X105copies/mL編號(hào)為；以此類推。擴(kuò)增體系：每次檢測(cè)包括至少5個(gè)連續(xù)濃度標(biāo)準(zhǔn)品，每標(biāo)準(zhǔn)品至少進(jìn)行3個(gè)復(fù)孔檢測(cè)。每次檢測(cè)包括陽性和空白對(duì)照各一個(gè)。樣品進(jìn)行3個(gè)復(fù)孔檢測(cè)。熒光定量PCR擴(kuò)增體系（25L）：其中2RealMasterMix 10L，上下游引物（10mol/L）各1.25L，探針（10mol/L）0.625L，20Probe Enhance Solution 1.25L，模板2L，

9、ddH2O 8.625L。擴(kuò)增條件：94預(yù)變性4min；然后94變性20s，60退火延伸60s，61s檢測(cè)熒光信號(hào)，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。數(shù)據(jù)處理：標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)R20.99，標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率在-3-3.5之間，擴(kuò)增效率E在0.91.2之間。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和樣品Ct值計(jì)算樣品核酸中嗜肺軍團(tuán)菌濃度（copies/mL）。結(jié)果報(bào)告采氣體積換算：按式（1）換算成標(biāo)準(zhǔn)狀態(tài)下采氣體積。 （1）式中：V0 標(biāo)準(zhǔn)狀態(tài)下的采氣體積，單位為立方米（m3）；Vt 實(shí)際采氣體積，為采樣流量與采樣時(shí)間乘積，單位為立方米（m3）；t 采樣點(diǎn)的環(huán)境溫度，單位為攝氏度（）；T0 標(biāo)準(zhǔn)狀態(tài)下的絕對(duì)溫度，273K；P 采樣點(diǎn)的大氣壓，單

10、位為千帕（kPa）；P0 標(biāo)準(zhǔn)狀態(tài)下的大氣壓，101kPa。濃度計(jì)算：空氣中存活的嗜肺軍團(tuán)菌濃度按式（2）計(jì)算。 （2） 式中： C 空氣中嗜肺軍團(tuán)菌濃度，單位為拷貝數(shù)每立方米（copies/m3）； C0 樣品核酸中嗜肺軍團(tuán)菌濃度，單位為拷貝數(shù)每毫升核酸（copies/mL）； V0 標(biāo)準(zhǔn)狀態(tài)下采氣體積，單位立方米（m3）。方法性能本方法最低檢出空氣中嗜肺軍團(tuán)菌核酸濃度為102copies/mL。當(dāng)采氣體積為2m3時(shí)，最低檢出空氣中嗜肺軍團(tuán)菌濃度為5 copies/m3。水樣品中嗜肺軍團(tuán)菌定量檢測(cè)分離培養(yǎng)法原理集中空調(diào)冷卻水、沐浴水、景觀水、娛樂用水等水樣品經(jīng)濃縮后，接種于GVPC瓊脂平板生

11、成單個(gè)軍團(tuán)菌菌落，并在BCYE瓊脂平板上生長而在L-半胱氨酸缺失的BCYE瓊脂平板上不生長，進(jìn)一步經(jīng)血清學(xué)實(shí)驗(yàn)鑒定確認(rèn)為嗜肺軍團(tuán)菌，依照樣品量、加標(biāo)回收率等定量計(jì)算得出水樣品中嗜肺軍團(tuán)菌濃度。儀器和設(shè)備CO2培養(yǎng)箱：5% CO2，3537。微生物過濾系統(tǒng)。恒溫水浴箱：505。生物安全柜。光學(xué)顯微鏡。平板振蕩器、渦旋振蕩器。具塞采樣瓶：容積500mL。材料和試劑硫代硫酸鈉溶液c（Na2S2O3）=0.1mol/L。濾膜：孔徑0.22m。酸處理液c（HCL-KCL）=0.2mol/L：pH 2.20.2。GVPC瓊脂平板。BCYE瓊脂平板。BCYE-CYE瓊脂平板（L-半光氨酸缺失的BCYE瓊脂平

12、板）。軍團(tuán)菌分型血清。氯化鈉溶液（NaCL）=0.85%。具塞試管。滅菌水。樣品采集將貝具采樣瓶（4.1.2.7）用前滅菌。每瓶中加入硫代硫酸鈉溶液（4.1.3.1）0.3mL0.5mL。采樣點(diǎn)按GB/T 18204.5中3.5.3規(guī)定。無菌操作采集水樣500mL。采集的樣品2d內(nèi)送達(dá)實(shí)驗(yàn)室，不必冷凍，但要避光和防止受熱，室溫下貯存不應(yīng)超過15d，盡快及時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。檢驗(yàn)步驟樣品預(yù)處理：水樣品如有雜質(zhì)可靜置去除沉淀，將樣品通過0.22m孔徑的微生物過濾系統(tǒng)（4.1.2.2）過濾，取下濾膜剪碎置于10mL原樣品中，渦旋振蕩器（4.1.2.6）充分振蕩洗脫，取洗脫液備用。樣品酸處理：取1mL預(yù)

13、處理后的樣品（4.1.5.1）于無菌具塞試管（4.1.3.9）中，加入適量酸處理液（4.1.3.3），使樣品pH值至2.02.2，輕輕搖勻，處理時(shí)間5min10min。樣品接種：取酸處理的樣品0.2mL，劃線接種GVPC平板（4.1.3.4），使培養(yǎng)后應(yīng)形成單個(gè)菌落。樣品培養(yǎng)：將接種平板靜置于5%CO2培養(yǎng)箱（4.1.2.1）中，溫度3537，孵育3d10d。菌落觀察：軍團(tuán)菌生長緩慢，易被其他菌掩蓋，從孵育第3d開始每天在顯微鏡上觀察。48h內(nèi)生長的菌落非軍團(tuán)菌，4872h長出的為可疑軍團(tuán)菌，72h后生長出的菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)并繼續(xù)進(jìn)行觀察。軍團(tuán)菌菌落通常呈白色、灰色、藍(lán)色或紫色。菌落整齊，表面濕潤

14、，典型菌落呈毛玻璃狀，在紫外燈下，部分菌落有熒光。菌落鑒定：孵育72h后，從GVPC平板上用接種環(huán)挑取可疑菌落，接種BCYE平板（4.1.3.5）和BCYE-CYS平板（4.1.3.6）。3537培養(yǎng)2d，凡在BCYE瓊脂平板上生長而在BCYE-CYE瓊脂平板不生長的則為軍團(tuán)菌菌落。嗜肺軍團(tuán)菌鑒定：經(jīng)血清學(xué)凝集實(shí)驗(yàn)確定嗜肺軍團(tuán)菌。在潔凈玻片（可用滅菌平板替代）上滴加兩滴彼此分離的氯化鈉溶液（4.1.3.9）約15L，挑取適量待檢菌落分別加在兩滴氯化鈉溶液上，混勻。其中一滴上加入15L LP1型診斷血清（4.1.3.8），另外一滴加入15L氯化鈉溶液作為陰性對(duì)照，分別混勻玻片上的兩種混合液。輕輕

15、搖動(dòng)玻片40s，觀察。于40s內(nèi)呈明顯凝集者為LP1型嗜肺軍團(tuán)菌，呈均勻渾濁者為非LP1型嗜肺軍團(tuán)菌。重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)過程，分別進(jìn)行LP2LP15單價(jià)或多價(jià)血清凝集實(shí)驗(yàn)。結(jié)果報(bào)告水樣品中嗜肺軍團(tuán)菌濃度按式（3）計(jì)算。 （3） 式中： C 水樣品中嗜肺軍團(tuán)菌濃度，單位為菌落形成單位每升（CFU/L）； n 每個(gè)平板上嗜肺軍團(tuán)菌平均菌落數(shù)，單位為菌落形成單位每皿CFUu/皿）； D 洗脫稀釋倍數(shù)，本方法中為10； V1 水樣品采集量，單位為毫升（mL）；V2 平板接種量，單位為毫升每皿（mL/皿），本方法中為0.2mL/皿； 水樣品平均加標(biāo)回收率，本方法為0.9。方法性能當(dāng)水樣品體積為500mL時(shí)，最

16、低檢出嗜肺軍團(tuán)菌濃度為5CFU/mL。當(dāng)水樣品中嗜肺軍團(tuán)菌濃度為50cfu/mL和500CFU/mL時(shí)，加標(biāo)回收率為80%100%。EMA+qPCR法原理采用疊氮溴乙錠（EMA）前處理結(jié)合定量聚合酶鏈反應(yīng)（qPCR）方法定量檢測(cè)集中空調(diào)冷卻水、洗浴水、景觀水、娛樂水等水樣品中存活的嗜肺軍團(tuán)菌。儀器和設(shè)備冷凍離心機(jī)：溫度4C。恒溫水浴鍋或金屬?。簻囟确秶?0C99C。熒光定量PCR儀：非耦合6色激發(fā)光片和6色檢測(cè)濾光片通道，4C100C溫度范圍。鹵素?zé)簦?00W。渦旋震蕩器：調(diào)速范圍 03000 rpm。微生物過濾系統(tǒng)。具塞采樣瓶：容積500mL。材料和試劑硫代硫酸鈉溶液c（Na2S2O3）=0

17、.1mol/L。濾膜：孔徑0.22m。EMA固體粉：5mg/管。無核酸酶去離子水。核酸提取試劑盒：DNA產(chǎn)量1530g，A260/A280在1.71.9之間。引物：上游引物 5-GAAAATAAAGTAAAAGGGGAAGCC-3； 下游引物 5-ATCAATCAGACGACCAGTGTATTC-3。探針：5-FAM-AGGCGTTGTTGTATTGCCAAGTGGTT-TAMRA-3。標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒。熒光定量PCR反應(yīng)體系。EP管。離心管。樣品的采集水樣品采集見4.1.4。樣品處理方法與條件樣品的過濾濃縮：見4.1.5.1。樣品的離心濃縮：取5mL洗脫液（4.2.5.1）于15mL離心管，室溫下

18、6000g離心15min，小心吸取棄去上清，剩余1mL左右沉淀全部轉(zhuǎn)移至1.5mL的EP管中，再次室溫下6000g離心15min，棄去上清，剩余0.5mL沉淀。EMA母液C21H18BrN5=10mg/mL的制備：見3.5.2。EMA工作液C21H18BrN5=100g/mL的制備：見3.5.3。樣品避光孵育：見3.5.4。樣品光照活化：見3.5.5。樣品存放：光照結(jié)束后，4保存樣品，24h內(nèi)提取核酸。樣品核酸提取由于樣品核酸提取的條件與操作步驟因使用試劑盒的不同而有差異，所以應(yīng)根據(jù)所使用的核酸提取試劑盒的操作手冊(cè)進(jìn)行操作。附錄B所列的水樣品中嗜肺軍團(tuán)菌核酸提取操作步驟是一個(gè)實(shí)例。熒光定量PC

19、R條件與擴(kuò)增步驟見3.7。結(jié)果報(bào)告水樣品中存活的嗜肺軍團(tuán)菌濃度按式（4）計(jì)算。 （4）式中： C 水樣品中嗜肺軍團(tuán)菌濃度，單位為拷貝數(shù)每升（copies/L）； n 樣品核酸中嗜肺軍團(tuán)菌濃度，單位為拷貝數(shù)每毫升核酸（copies/mL）； D 洗脫稀釋倍數(shù)，本方法中為2；V 水樣品采集體積，單位為毫升（mL）。方法性能本方法最低檢出水樣品中嗜肺軍團(tuán)菌核酸濃度為102copies/mL。當(dāng)水樣品采集體積為500mL時(shí)，最低檢出水樣品中嗜肺軍團(tuán)菌濃度為50 copies/L。土類樣品中嗜肺軍團(tuán)菌定量檢測(cè)原理集中空調(diào)風(fēng)管積塵、花卉土、景觀土等土類樣品經(jīng)振蕩洗脫后，接種于GVPC瓊脂平板生成單個(gè)軍團(tuán)菌

20、菌落，并在BCYE瓊脂平板上生長而在L-半胱氨酸缺失的BCYE瓊脂平板上不生長，進(jìn)一步經(jīng)血清學(xué)實(shí)驗(yàn)鑒定確認(rèn)為嗜肺軍團(tuán)菌，依照樣品量、加標(biāo)回收率等定量計(jì)算得出土樣品中嗜肺軍團(tuán)菌濃度。儀器和設(shè)備見4.1.2。材料和試劑見4.1.3。樣品采集樣本采集原則：遵循無菌操作原則采集土類樣品，樣品采集、儲(chǔ)存所使用的器材均經(jīng)滅菌；土類樣品去除磚石瓦塊、枝葉秸稈等塊狀物，風(fēng)管積塵避免采集風(fēng)管及過濾網(wǎng)上的絮狀纖維雜物。景觀土、花卉土等采樣：取土樣時(shí)選取1m2按5點(diǎn)采樣方法，去除1cm左右的土壤表層后，挖取土樣；花卉土等去除表面落葉雜物后，在花卉的周圍均勻采取土樣，土樣量不少于20g/份置于滅菌采樣容器中。空調(diào)風(fēng)管

21、積塵采樣：根據(jù)風(fēng)管積塵量確定采樣面積，積塵量多時(shí)可選用5點(diǎn)采樣方法，積塵量少則可將一定面積內(nèi)的風(fēng)管積塵全部收集，積塵樣品量不少于1.5g/份。樣品保存：采集的樣品在62、避光的條件下保存，2d內(nèi)送實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)。檢驗(yàn)步驟樣品預(yù)處理：采集的樣品（5.4.4）充分混勻后無菌操作稱取0.5g空調(diào)風(fēng)管積塵樣品或5g花卉土、景觀土樣品，風(fēng)管積塵樣品加入4.5mL 0.01%PBS-Tween80洗脫液，花卉土、景觀土樣品加入45mL 0.01%PBS-Tween80洗脫液，200-250r/min振蕩2030min，室溫靜置20min至上層液體澄清，取上清液備用。樣品酸處理：見4.1.5.2。樣品接種：見4

22、.1.5.3。樣品培養(yǎng)：見4.1.5.4。菌落觀察：見4.1.5.5。菌落鑒定：見4.1.5.6。嗜肺軍團(tuán)菌鑒定：見4.1.5.7。結(jié)果報(bào)告土類樣品中嗜肺軍團(tuán)菌濃度按式（5）計(jì)算。 （5） 式中： C 土類樣品中嗜肺軍團(tuán)菌濃度，單位為菌落形成單位每克（CFU/g）； n 每個(gè)平板上嗜肺軍團(tuán)菌平均菌落數(shù)，單位為菌落形成單位每皿（CFU/皿）； D 洗脫稀釋倍數(shù)，本方法中風(fēng)管積塵為5，其他為50； G1 土類樣品采集量，單位為克（g），本方法中風(fēng)管積塵為0.5g，其他為5g；G2 平板接種量，單位為毫升每皿（mL/皿），本方法中為0.2mL/皿； 土類樣品平均加標(biāo)回收率，本方法為0.5。方法性能最

23、低檢出土類樣品中嗜肺軍團(tuán)菌濃度為102CFU/g。當(dāng)土類樣品中嗜肺軍團(tuán)菌濃度為103cfu/g時(shí)，加標(biāo)回收率為30%90%。（資料性附錄）空氣中嗜肺軍團(tuán)菌樣品核酸提取操作步驟注：本附錄為空氣中嗜肺軍團(tuán)菌樣品核酸提取操作步驟的一個(gè)實(shí)例。材料和試劑OMEGA公司E.Z.N.A. Bacterial DNA Kit核酸提取試劑盒。TE Buffer。無水乙醇操作步驟實(shí)驗(yàn)前的準(zhǔn)備：溶菌酶存儲(chǔ)液=50mg/mL保存于-20并在使用前解凍，Elution Buffer使用前預(yù)熱到65，無水乙醇稀釋DNA Wash Buffer濃縮液。取0.5mL經(jīng)過EMA處理后的氣溶膠樣品（3.5.6）8000g離心20

24、min，棄去上清。加入180L的TE Buffer（A.1.2）重懸樣品，加入20L溶菌酶存儲(chǔ)液（A.2.1）30水浴30 min。室溫條件下5000g離心5min，沉淀消化后的細(xì)菌，棄去上清，加入200L的buffer BTL渦旋以懸浮細(xì)菌。加25mg40mg的玻璃珠，室溫條件下高速渦旋5min。靜置讓玻璃珠沉淀下來，小心吸取上清致一新的滅菌1.5mL離心管中。加入25L的蛋白酶K并渦旋均勻，將混合均勻的液體放入55流動(dòng)水浴中1h左右，完全溶解細(xì)菌。如果沒有流動(dòng)水浴，可孵育在55的水浴鍋中，每隔20-30min短暫渦旋離心管。加入5L的RNA酶A并反復(fù)顛倒混勻，在室溫條件下孵育30min。室

25、溫10000g離心5min，沉淀不溶解的物質(zhì)，小心地吸取上清到新的1.5mL離心管中，避免吸到有不溶解的沉淀。加入220L的Buffer BDL，短暫渦旋混勻，65孵育10min。在加入Buffer BDL后，可能會(huì)有絮狀沉淀出現(xiàn)，并不影響DNA的復(fù)性。加入220L的無水乙醇，高速渦旋20s，有沉淀出現(xiàn)，用槍頭反復(fù)吹打以破碎沉淀。將所得到的所有液體轉(zhuǎn)至DNA結(jié)合柱內(nèi)，其中包括在步驟A.2.9過程中形成的沉淀，室溫10000g離心1min，丟棄收集管和其中的濾出液。將柱子裝入一個(gè)新的收集管，加入500L的Buffer HB，室溫10000g離心1 min，丟棄收集管中的濾出液。將柱子裝回剛才收集

26、管，加入700L無水乙醇稀釋后的DNA Wash Buffer（A.2.1），室溫10000g離心1 min，丟棄收集管中的濾出液。再次加入700L無水乙醇稀釋后的DNA Wash Buffer（A.2.1），室溫10000g離心1min，丟棄收集管中的濾出液。將柱子裝回剛才的收集管中，高速（10000g）離心2min以干燥DNA結(jié)合柱，丟棄收集管和濾出液。將柱子置于滅菌的1.5mL離心管上，向DNA結(jié)合柱的膜中央加入50L經(jīng)65預(yù)熱的Elution Buffer，65孵育15 min。室溫10000g離心1min，將DNA從柱子上洗脫下來。向DNA結(jié)合柱的膜中央再次加入50L經(jīng)65預(yù)熱的Elution Buffer，65孵育15 min。室溫10000g離心1min，將基因組DNA從柱子上洗脫下來?？偣搏@得100lLDNA溶液，-20保存。（資料性附錄）水樣品種嗜肺軍團(tuán)菌核酸提取操作步驟注：本附錄為水樣品中嗜肺軍團(tuán)菌樣品核酸提取操作步驟的一個(gè)實(shí)例。材料和試劑OMEGA公司E.Z.N.A. Water DNA Kit核酸提取試劑盒。無水乙醇。操作步驟實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備：DNA Wash Bu