骨質(zhì)疏松動物模型介紹

1、骨質(zhì)疏松的動物模型骨質(zhì)疏松癥是以骨量減少及骨組織微觀結(jié)構(gòu)為特征的一種全身性骨骼疾病，伴有骨的脆性增加、易于發(fā)生骨折。骨質(zhì)疏松癥是目前世界上發(fā)病率、死亡率和醫(yī)療保健消耗較大的疾病之一。骨質(zhì)疏松起病隱襲，一旦發(fā)現(xiàn)，多已發(fā)展到一定程度。隨年齡增加，骨丟失和骨折發(fā)生率明顯增加。骨質(zhì)疏松性骨折可發(fā)生在任何部位，但以椎骨、腕部和髖部多見。髖部骨折最為嚴(yán)重，多需手術(shù)處理，且患者常合并慢性疾病，如高血壓、心血管、慢性呼吸道阻塞疾病及糖尿病等，導(dǎo)致醫(yī)療費(fèi)用和死亡率增加，一部分患者日常生活不能完全獨(dú)立，年平均生活質(zhì)量下降。女性由于峰骨量較低及絕經(jīng)后雌激素水平下降，發(fā)病率較男性為高。近年來隨著社會老齡化，人口壽命的

2、延長，女性絕經(jīng)后生存年限約占一生的1/3，據(jù)估計(jì)，從1990 2025，歐洲50 歲以上婦女將增加3040。男性預(yù)計(jì)增加更快，可達(dá)50。在同一時(shí)期內(nèi)，北美預(yù)期將增加83。亞非絕對增加數(shù)將為更為明顯。在1990 年全世界僅髖部骨折達(dá)130 170 萬，預(yù)期到 2025 年為 200 萬，甚至更多 1 。骨質(zhì)疏松癥已成為全世界范圍的嚴(yán)重的社會和經(jīng)濟(jì)問題。骨質(zhì)疏松癥的預(yù)防和治療已成為一個(gè)多學(xué)科的、當(dāng)前研究最活躍的課題之一。 建立理想的骨質(zhì)疏松癥的動物模型是對治療和預(yù)防骨質(zhì)疏松癥新藥的體內(nèi)過程、藥物代謝動力學(xué)、藥效學(xué)和影響藥物作用因素的基礎(chǔ)。隨著對骨質(zhì)疏松癥的研究的不斷深入，認(rèn)為骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生與遺傳

3、、營養(yǎng)、 生活習(xí)慣、激素、運(yùn)動、機(jī)械負(fù)荷和多種細(xì)胞因子有關(guān)。對骨質(zhì)疏松癥的動物模型提出了嚴(yán)格的要求。Rodgers等指出理想的動物模型應(yīng)有三個(gè)特點(diǎn)：（ 1） 方便性 （ Convenience） ：動物購來容易，價(jià)格低廉，實(shí)驗(yàn)操作易行。（ 2）關(guān)聯(lián)性（Relevance） ：與人體條件比較相似，得到的信息能轉(zhuǎn)化為人體的規(guī)律。（ 3） 適宜性 （ Appropriateness） ：為研究某一特定問題，最好用特定的動物模型模擬人體 2 。 骨質(zhì)疏松癥的動物模型涉及動物的選擇和復(fù)制的方法等方面，本文就此將國內(nèi)外的有關(guān)進(jìn)展進(jìn)行綜述。復(fù)制骨質(zhì)疏松模型的動物選擇用于骨質(zhì)疏松癥模型動物模型首先應(yīng)該考慮的是

4、模型應(yīng)與人類骨質(zhì)疏松的臨床癥狀及組織行為相似，但某些動物模型在各個(gè)方面完全與人類骨質(zhì)疏松癥的臨床表現(xiàn)一致是很困難的，因此動物模型側(cè)重與表現(xiàn)其某一階段、某些癥狀或一些病理生理變化，作為觀察特定階段和指征的病理模型。美國骨質(zhì)疏松藥物研究指南（美國FDA）認(rèn)為目前沒有一種動物模型能模擬人類骨質(zhì)疏松的所有特征。已有報(bào)道用小鼠，大鼠、兔、羊、猴等復(fù)制骨質(zhì)疏松模型 3 。靈長類動物與其他種屬相比，有許多優(yōu)點(diǎn)。靈長類動物保持經(jīng)常性的直立體位，生物力學(xué)與人類最為相似；體內(nèi)器官系統(tǒng)包括消化系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、骨代謝與人類接近；飲食要求相似；更重要的是，有些靈長類動物有與女性類似的周期的動情期和絕經(jīng) 4 。 但費(fèi)用

5、昂貴，飼養(yǎng)管理要求高，有攜帶動物源性的傳染病，例 Marburg 病毒病、 Eloda 病毒病等。小鼠作為骨質(zhì)疏松動物模型的研究報(bào)道較少，但有人證實(shí)C57/6J 的小鼠峰值骨量低，C3H/HeJ 小白鼠的峰骨量高，且由于小鼠基因易于調(diào)控，可借助分子生物學(xué)技術(shù)，對其基因進(jìn)行研究，以便定位決定峰量骨值的基因。另外，SAM-P/6 小鼠有低峰值骨量和中、老年易發(fā)生脆性骨折的特點(diǎn)，是唯一證實(shí)可隨增齡出現(xiàn)脆性骨折的動物 5， 6 。 小鼠也存在骨骼太小，可供研究的血清較少，動情期不受下丘腦垂體軸調(diào)節(jié)等因素影響。羊、豬、狗因?yàn)轶w積大、飼養(yǎng)困難、對去卵巢的組織學(xué)反應(yīng)不一等因素，限制其的應(yīng)用。大鼠的骨代謝、解

6、剖與人類相似，成年雌鼠由于E2 的周期變化，每四天有一個(gè)動情期。1 歲后雌鼠可觀察到動情期的逐漸減少和松質(zhì)骨的丟失。大鼠卵巢切除后，骨轉(zhuǎn)化率增高；初始的快速骨丟失期，隨后的緩慢骨丟失期；骨松質(zhì)較皮質(zhì)骨骨丟失嚴(yán)重；腸道鈣吸收明顯降低，與絕經(jīng)后骨丟失有眾多相似之處 7 。 予雌激素替代治療時(shí)無骨轉(zhuǎn)化增加和失骨 8 。 抑制人骨轉(zhuǎn)化的藥物如雙磷酸鹽類和降鈣素也可以有相似的骨組織變化 9 。 其次， 大鼠來源豐富，費(fèi)用低廉，易于飼養(yǎng)管理等的優(yōu)點(diǎn)。但也有不足之處包括：皮質(zhì)骨哈佛氏單位重建不明顯；12 24 月后骨骺方閉合；終身維持活躍的骨塑建( modeling) ； 承載方式與人類不同等。目前， 大鼠

7、已成為骨質(zhì)疏松癥研究中使用最多的動物模型。選擇骨質(zhì)疏松動物模型應(yīng)注意的因素骨生長期和成年期理想的骨質(zhì)疏松動物模型應(yīng)有明確的生長期和成長期。在骨質(zhì)疏松研究中生長期的骨積累和成年期的骨峰值是重要的概念。在骨生長期，以骨塑建(bone modeling)為主，骨發(fā)育的代表是長軸骨的生長，骨塑形能力強(qiáng)，骨代謝活性高。，除了遺傳因素，生長期的營養(yǎng)、運(yùn)動、機(jī)械負(fù)荷和日照時(shí)間等決定峰值骨量。成年期的骨發(fā)育是以骨重建為主。，松質(zhì)骨的骨重建活性高于皮質(zhì)骨。骨代謝處于相對穩(wěn)定的狀態(tài)。測定峰值骨量和成年后的骨量丟失是骨質(zhì)疏松研究中的重要的手段。進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)，明確實(shí)驗(yàn)動物處于生長期，還是成年期。如實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖茄芯砍赡耆思?/p>

8、病的過程，應(yīng)用成年期的動物。若觀察危險(xiǎn)因素對骨骼系統(tǒng)生長的影響，應(yīng)選用生長期的動物。骨塑建與骨重建骨塑建與骨重建骨塑建(bone modeling)是骨生長期骨的形狀和結(jié)構(gòu)的生長變化，還在成年期期調(diào)整骨的構(gòu)筑和骨量分布而適應(yīng)外力環(huán)境的改變。骨重建(boneremodeling)是指骨組織中的基本單位新骨取代舊骨的骨吸收與骨重建過程，并無骨形狀的改變。骨質(zhì)疏松動物模型應(yīng)可觀察到松質(zhì)骨和皮質(zhì)骨明確的組織形態(tài)學(xué)變化。雌激素與絕經(jīng)大多數(shù)婦女經(jīng)歷2 7 年的自然絕經(jīng)期，手術(shù)女性因手術(shù)而絕經(jīng)。體內(nèi)雌激素水平下降導(dǎo)致多得快速失骨可持續(xù)5 8 年，逐漸進(jìn)入一個(gè)緩慢失骨期。這些變化主要發(fā)生在松質(zhì)骨和皮質(zhì)骨內(nèi)表面

9、 10 。雌激素替代療法可減少骨量的丟失，骨折發(fā)生率降低。骨質(zhì)疏松模型選擇的動物如有周期性的月經(jīng)或動情期，有自然絕經(jīng)現(xiàn)象和對雌激素替代療法有良好的反應(yīng)，可能是用于骨質(zhì)疏松研究的最佳模型。比如， 大鼠去勢模型是研究絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的經(jīng)典動物模型。其它動物骨骼的形態(tài)、骨密度和骨生理與人類不盡相同，而且骨質(zhì)疏松癥的變化往往經(jīng)歷數(shù)年或數(shù)十年，但動物模型在數(shù)周或數(shù)月復(fù)制出相像的變化，二者是否有差距，有待進(jìn)一步研究，因此在實(shí)驗(yàn)結(jié)果判定和外推時(shí)需慎重。復(fù)制骨質(zhì)疏松癥的方法骨質(zhì)疏松動物模型的建立有手術(shù)切除卵巢、藥物誘導(dǎo)、飲食限制和制動術(shù)等幾種方法。也有將卵巢切除與其他方法結(jié)合應(yīng)用以加快失骨的報(bào)道。切除卵巢去勢法

10、以大鼠為例，大鼠有明顯的生長期和成年期，雌性大鼠發(fā)情期規(guī)律，每四天出現(xiàn)一次持續(xù)18小時(shí)的雌二醇峰值時(shí)間。當(dāng)卵巢切除以后，如上所述，出現(xiàn)骨轉(zhuǎn)化率增加，松質(zhì)骨出現(xiàn)顯著的骨丟失，骨小梁變細(xì)，單位體積骨小梁骨量降低，骨強(qiáng)度下降；經(jīng)歷約4 月的快速骨丟失期，隨后為一段較長的緩慢的丟失階段。肥胖對骨丟失有一定保護(hù)的作用；腸道的鈣吸收減少；這種特征較好地復(fù)制了女性正常絕經(jīng)時(shí)骨量丟失的情況。予雌激素替代治療時(shí)無骨轉(zhuǎn)化增加和失骨。抑制人骨轉(zhuǎn)化的藥物如雙磷酸鹽類和降鈣素也可有阻止大鼠的高轉(zhuǎn)化率和骨丟失。這與絕經(jīng)后婦女對相同治療的應(yīng)用效果一致。該模型已被反復(fù)證實(shí)，切除大鼠卵巢，血中雌激素水平顯著降低，并出現(xiàn)骨質(zhì)疏松

11、病理變化，該法已成為制造絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥動物模型的有效方法。雌激素減少后的骨量的減少和骨形成關(guān)系如何尚未闡明。骨骼成熟后，在一生中仍不斷進(jìn)行更新與改造，這就是骨重建。骨重建過程是舊骨的吸收，新骨的形成的復(fù)雜過程。主要有兩種細(xì)胞在發(fā)生作用：一種是通過分解代謝促使骨質(zhì)吸收的破骨細(xì)胞，一種是通過合成代謝促進(jìn)骨形成的成骨細(xì)胞。正常的骨再建過程有賴于這兩種細(xì)胞作用的平衡。在骨表面同時(shí)存在著破骨細(xì)胞和各個(gè)分化階段的成骨細(xì)胞，無論在組織學(xué)上，還是在功能上都做為一個(gè)生理單位發(fā)生作用，這一系列的細(xì)胞群被稱為基本的多細(xì)胞單位(basic multicelluar unit,BMU) 。 任何一種可以改變破骨細(xì)胞活

12、性和成骨細(xì)胞分泌能力的因素均可對骨的再建產(chǎn)生深刻的影響。雌激素通過多個(gè)環(huán)節(jié)維持骨吸收和骨形成的平衡。( 1) 雌激素增加降鈣素的分泌,抑制甲狀旁腺激素的活性,從而抑制骨鈣溶解、促進(jìn)鈣在腸內(nèi)的吸收、幫助活性維生素D(1,25-二羥維生素D)在腎臟的合成、促進(jìn)骨的重建。(2)而且許多研究發(fā)現(xiàn)骨細(xì)胞內(nèi)存在雌激素受體。實(shí)驗(yàn)表明, 在成骨細(xì)胞上存在雌激素受體。雌激素具有刺激骨形成作用,破骨細(xì)胞是雌激素的靶細(xì)胞 11 。 (3)雌激素通過影響局部的細(xì)胞因子如IGF-I、 TGF-、 IL-1 、 TNF、 IL-6 等而調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞的功能狀態(tài)，進(jìn)而影響骨代謝 12 。藥物誘導(dǎo)常用誘導(dǎo)骨質(zhì)疏松動物

13、模型有維甲酸和糖皮質(zhì)激素。維甲酸是維生素A 的衍生物，臨床上作為治療白血病的藥物，對骨代謝有明顯的影響，大鼠維甲酸70mg/kg 灌胃兩周，即出現(xiàn)骨密度降低，骨小梁吸收，斷裂，稀疏；骨髓腔增大。骨礦含量降低,骨板結(jié)構(gòu)破壞及骨骼負(fù)重功能損害;骨生成減少而骨吸收增加等。利用這一特性，可成功復(fù)制出骨質(zhì)疏松動物模型。在造型過程中，動物會出現(xiàn)厭食，體重減輕，倦怠等表現(xiàn)，且易感染。此模型的組織形態(tài)學(xué)改變，及對雌激素治療的反應(yīng)與人類有較好相似性 13 。是大鼠急性骨質(zhì)疏松的復(fù)制方法。維甲酸誘導(dǎo)大鼠骨質(zhì)疏松主要是激活破骨細(xì)胞的分化、增殖，促進(jìn)骨吸收作用，而造成骨吸收大于骨形成的負(fù)平衡狀態(tài)，造成骨丟失。同時(shí)文獻(xiàn)

14、報(bào)道，維甲酸可造成卵巢重量明顯減輕，子宮萎縮，維甲酸有損傷卵巢功能的作用，雌激素水平下降 14 ，體內(nèi)雌激素減少是導(dǎo)致骨質(zhì)疏松的主要原因?？屡d氏綜合癥或接受皮質(zhì)類固醇激素治療的病人，約半數(shù)發(fā)生骨質(zhì)疏松，借此，予動物大劑量長期使用皮質(zhì)類固醇激素可誘導(dǎo)骨質(zhì)疏松模型，常用強(qiáng)的松或強(qiáng)的松龍，皆可觀察到顯著的骨丟失。糖皮質(zhì)激素直接抑制成骨細(xì)胞的功能， 減少前成骨細(xì)胞向功能性成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化，降低前成骨細(xì)胞的骨膠原的合成，使骨基質(zhì)形成減少，破骨細(xì)胞間接由于偶聯(lián)因素及PTH 增加的刺激而骨吸收加速 15 。血鈣水平下降，是皮質(zhì)類固醇抑制小腸鈣吸收的結(jié)果。又進(jìn)而刺激PTH 分泌， 血清降鈣素濃度輕度下降，也是骨吸

15、收活躍的原因。皮質(zhì)類固醇可抑制腎小管對鈣磷的重吸收 16 。 此模型在一定程度上模擬骨形成減少的變化。但不夠理想，原因在于動物真正的骨生成減少較為少見。并且與原發(fā)性骨質(zhì)疏松的發(fā)病機(jī)理與病程不一致，因此不適合用于觀察藥物對骨吸收抑制作用的研究模型。飲食限制決定和影響骨量的因素可概括為遺傳因素和環(huán)境因素。其中環(huán)境因素有營養(yǎng)、體力活動和生活習(xí)慣等。營養(yǎng)對骨量的維持有必不可少的作用，特別是其中的蛋白質(zhì)及鈣質(zhì)。但只是環(huán)境因素之一，對骨量的影響較小。因其是可控因素，加之骨量的微細(xì)變化可致骨折風(fēng)險(xiǎn)大大增加，所以合理的營養(yǎng)在原發(fā)性骨質(zhì)疏松的防治上有一定作用。骨質(zhì)疏松的飲食危險(xiǎn)因素包括鈣攝入減少，蛋白質(zhì)、維生素

16、D 不足，膳食中的鈉、有機(jī)磷含量過高等 17。鈣是人體含量較多的元素之一，99 的鈣存在骨骼和牙齒中，對維持骨骼的結(jié)構(gòu)與功能，以及保持血鈣有重要的作用。其余 1% 的體鈣分布于各種細(xì)胞和細(xì)胞間液中，具有多種生理功能。當(dāng)鈣攝入不足、鈣吸收功能低下或高鈣排出使機(jī)體缺鈣時(shí)，可繼發(fā)引起甲狀旁腺激素(PTH)分泌增多，使骨吸收亢進(jìn)，長期缺鈣將導(dǎo)致骨量丟失，發(fā)生骨質(zhì)疏松癥。另外，有報(bào)道骨量與遺傳、機(jī)械負(fù)荷、骨峰量值和營養(yǎng)內(nèi)分泌狀況等有關(guān)。從胎兒時(shí)期保持充足的鈣攝入量，可以提高骨峰量值。骨峰量值增高，骨儲備多，對中老年的骨量丟失緩沖能力強(qiáng)，使骨量減少保持在閾值以上，從而延緩或減輕骨質(zhì)疏松的發(fā)生 18 。大鼠

17、在幼時(shí)鈣攝入不足，其骨峰量值下降，而低骨峰量值使增齡后骨質(zhì)疏松發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)大大增加 19 。其次， 有流行病調(diào)查報(bào)道，人群中蛋白質(zhì)攝入量與骨密度顯著負(fù)相關(guān) 20 。高蛋白攝入使尿中代謝固定酸含量增加，腎近曲小管鈣重吸收減少，尿鈣增加，同時(shí)激發(fā)胰島素與胰島素生長因子對骨細(xì)胞調(diào)節(jié)作用 21 。蛋白質(zhì)攝入大多與磷結(jié)合，同時(shí)增加磷的吸收。后者能減少尿鈣排泄，抵消高蛋白攝入引起的尿鈣增加，但磷使鈣從糞便中排泄量上升，所以過多的蛋白攝入的凈效應(yīng)是增加負(fù)鈣平衡 22 。另外， 無論男性或女性，隨著增齡其日照時(shí)間減少，維生素 D 合成不足，體內(nèi)鈣吸收不足。如發(fā)生在高齡人群，常加速骨量的丟失。研究表明，高磷攝入導(dǎo)

18、致高磷血癥、低鈣血癥、骨丟失和軟組織鈣化等，主要與繼發(fā)性甲狀旁腺功能亢進(jìn)有關(guān) 23 。以上單因素營養(yǎng)因素控制造成大鼠骨質(zhì)疏松動物模型，往往易受其他因素的影響，而且建立模型所需時(shí)間長，一般需40 周以上。因此需以低鈣飼料為主，輔以其他危險(xiǎn)因素或藥物等聯(lián)合造成大鼠骨質(zhì)疏松模型。制動法廢用性骨質(zhì)疏松或骨丟失模型，是人工方法使動物部分肢體處于不負(fù)重狀態(tài)而建立的活體模型。由于動物肢體的骨量和骨代謝與復(fù)制、肌肉活動、神經(jīng)血管對肌肉骨骼的營養(yǎng)等因素密切相關(guān)。復(fù)制的方法很多，常用的是機(jī)械固定法、懸吊法、腱切除法和離斷坐骨神經(jīng)等。 其中機(jī)械固定法和懸吊法優(yōu)點(diǎn)在于在同一動物上即可研究失重時(shí)的骨丟失，又可以觀察承重

19、肢超重時(shí)骨代謝變化，去除固定后還能觀察骨質(zhì)疏松的恢復(fù)。且易于操作 24 ?？偨Y(jié)隨著新技術(shù)的不斷涌現(xiàn)和對骨質(zhì)疏松的認(rèn)識的深入，骨質(zhì)疏松動物模型也不斷地改進(jìn)，有必要對各種骨質(zhì)疏松動物模型的特點(diǎn)和機(jī)理進(jìn)行深入的研究。在評價(jià)新藥的防治效果時(shí)，應(yīng)注意選用適宜的動物和造模方法，藥物作用機(jī)理與造模方法在病因?qū)W上的一致性。只有使用標(biāo)準(zhǔn)的、與人類骨質(zhì)疏松相關(guān)性強(qiáng)的動物模型，才能得到可靠地研究數(shù)據(jù)，準(zhǔn)確評價(jià)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。參考文獻(xiàn)、 Cooper C, Campion G, Melton LJ, Hip fractures in the elderly: a world-wide projection. Osteop

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