膠回收原理及注意事項

1、DNA的凝膠回收一、瓊脂糖凝膠電泳片斷回收的常用方法介紹：柱回收試劑盒：可謂目前最簡單快速的回收方法，只需要將電泳凝膠中的產(chǎn)物 條帶切下，用溶解Buffer徹底溶解，上包埋有純化填料的純化柱，離心，再洗 滌一次，離心后用洗脫緩沖液洗脫。全程不過10多分鐘，得到的產(chǎn)物溶液可以 直接用于后繼實驗。這個方法幾乎不需要什么技巧就能得到穩(wěn)定的結(jié)果，也是目 前最多商品化試劑盒選擇的方法。但是這個方法不適合用于大片段的回收。玻璃奶/純化填料膠回收試劑盒：這個方法比前面的方法更為靈活，可以根據(jù) 每次回收實驗時預(yù)期回收量來調(diào)整純化填料的量，使得實驗不受限于柱子的載 量，也不會造成浪費(fèi)。前面的操作步驟和上者一樣，

2、將電泳凝膠的條帶切下，B uffer溶解，（區(qū)別在于這里|）加入純化填料吸附混合，快速離心沉淀去上清，洗滌 沉淀后，干燥沉淀，最后用洗脫液純化介質(zhì)中吸附的片段釋放出來，離心，取上 清，就是回收的產(chǎn)物。這個方法適合各種不同大小的片段，特別是大片段的回收， 但是操作就較前者復(fù)雜一些，涉及到多次離心沉淀和取上清，有可能會誤吸了微 量的沉淀;另外干燥的程度也有點(diǎn)技巧，干過了不好洗脫，沒干透又影響結(jié)果。 后來的改進(jìn)版本有將混合了純化介質(zhì)后的凝膠溶解液加入到一種離心過濾柱上， 這種柱子不帶純化填料，只有一層過濾膜，離心過濾后，填料在柱子里，溶液被 甩掉，這樣就避免了上述的問題。3|低熔點(diǎn)瓊脂糖：傳統(tǒng)手工操

3、作方法之一，低熔點(diǎn)瓊脂糖制備凝膠，電泳后切割 目的條帶，在TE溶液中65度保溫融化，用傳統(tǒng)的酚氯仿抽提，乙醇沉淀。這 個方法需要用到酚氯仿等有機(jī)試劑，由于乙醇沉淀需時較長，而且低熔點(diǎn)瓊脂糖 價格較高現(xiàn)在用的人已經(jīng)不多了，除非用于大片段的回收。4透析帶電洗脫。切下的條帶放在充滿TAE的透析帶中再電泳一段時間，讓 DNA走出凝膠，走向溶液中，再反向電泳一會兒，將附在透析帶上的DNA趕回 溶液中，取溶液部分，再用TAE洗洗袋子，合并溶液后傳統(tǒng)方法酚抽沉淀，那 塊膠通常還要再染色看看殘留。由于綁透析帶非常難搞，只有在萬不得己的非常 大的片段時才會考慮的。也是丙烯酰胺電泳凝膠產(chǎn)物回收的方法之一。以色列的

4、 一個小公司GeBA出了一種簡易透析管，就是將小管兩邊各開一小窗，貼上透 析膜，把膠塊放在管中再電泳。由于不需要綁透析帶，使用方便;而且管中溶液 體積小，容易處理;膜的面積也小吸附也少;頓時覺得是救星。Pierce也推出了類 似的東西，買起來更方便一點(diǎn)。5.DEAE纖維素膜紙片法和其他改良法。早期實驗室最常用方法之一。將DEAE 纖維素膜裁成小條活化處理。電泳后在目的條帶前切一刀，將比條帶略寬的DE AE纖維素膜插入切口，不留氣泡，繼續(xù)電泳一會兒，條帶上的DNA被膜片截 留，取出膜片沖洗后轉(zhuǎn)移到離心管中加緩沖液65度保溫洗脫，直到膜上沒有D NA 了，將溶液用酚氯仿抽提沉淀。這個方法不適合做較

5、大的DNA，因為洗脫比 較困難。常規(guī)片段級（DNA片段為100bp-10kb）：主流方法是柱回收試劑盒大片段級（DNA片段7kb）：可選方法是玻璃奶/純化填料膠回收試劑盒，電洗脫 低熔點(diǎn)瓊脂糖小片段級（DNA片段100bp）:丙烯酰胺凝膠回收，也有專門的柱回收試劑盒注意：幾乎所有膠回收試劑盒進(jìn)行膠回收時，離心都是在室溫下進(jìn)行，嚴(yán)禁低溫離不同的膠回收試劑盒適合回收DNA片段的大小不同，根據(jù)試劑情況進(jìn)行選擇。 對于分子量小于100bp的DNA片段，試劑盒的回收效率低，建議用PAGE電泳 分離，核酸抽提沉淀的方法回收；3、在結(jié)合（binding）步驟中，建議使用低轉(zhuǎn)速離心，這樣可以增加結(jié)合時間， 促

6、進(jìn)回收效率，其它步驟中都用10000-12000rpm離心?；静襟E：1：切膠（要盡量輕）2：溶膠（必須要保證完全溶解）3：上回收柱4：洗滌5： 洗脫DNA能夠跟吸附柱結(jié)合的條件是高鹽低pH下結(jié)合，低鹽高pH條件下洗脫，其中 小分子DNA結(jié)合能力差但洗脫能力強(qiáng)，大分子DNA結(jié)合能力強(qiáng)但洗脫能力差，一 般吸附柱能結(jié)合的DNA范圍在50-50kb之內(nèi)。Thermo GeneJET Gel Extraction Kit（該試劑盒比較貴，除了回收分子量較大7kb以上的DNA片段選擇此試劑盒，否則選擇其 他國產(chǎn)試劑盒）原理 HYPERLINK /order/catalog/product/K0692?I

7、CID=search-k /order/catalog/product/K0692?ICID=search-k 0692從瓊脂糖凝膠中切出目的DNA片段，置于離心管中，加入結(jié)合液進(jìn)行溶解， 之后轉(zhuǎn)入回收柱中。結(jié)合液中的促溶劑溶解瓊脂糖、使蛋白變性、促使DNA結(jié)合 于回收柱中的硅膜上。結(jié)合液中含有顏色指示劑，能夠方便監(jiān)測溶液pH是否最 為適合DNA結(jié)合。通過簡單的漂洗步驟去除雜質(zhì)。純化的DNA通過加入洗脫液從 回收柱中洗脫出來。該試劑盒可用于回收25bp到20kb大小的DNA片段。每個回收柱擁有結(jié)合 25ug DNA的能力，能處理多達(dá)1g的瓊脂糖凝膠。步驟1：用干凈的手術(shù)刀或刀片（用酒精棉球擦拭

8、）切割含有DNA片段的凝膠， 盡可能的靠近DNA片段切割，以減小凝膠的含量，將膠片放在事先稱重的1.5 毫升離心管并稱重。記錄膠塊的重量。注意：如果純化的DNA片段用于克隆反應(yīng)，要避免暴露在紫外燈下對DNA的 損害。盡量減少紫外線照射時間，或在紫外照射期間保持凝膠在玻璃或塑料盤中。2：加1:1量的Binding Buffer到膠塊中（體積：重量）（如每100毫克凝 膠加 100 微升的 Binding Buffer）其他回收試劑盒一般加的溶膠液是100mg凝膠加入300ul溶膠液，不足100mg 的安裝100mg計量注意：對于瓊脂糖含量大于2%的凝膠，向膠塊中加入2： 1體積的Binding

9、Buffer。3：在50-60度的條件下溫育凝膠混合物10 min以上等到凝膠全部融化。每 隔幾分鐘顛倒離心管，促進(jìn)膠融化，保證膠全部溶解。加入回收柱前短暫渦旋凝 膠混合物。注意檢查溶液的顏色，黃色是結(jié)合DNA的最佳PH。如果顏色是橙色或紫色， 加10 UL 3 M的乙酸鈉溶液，混勻，溶液會變?yōu)辄S色。在溶膠的過程中，膠溶解的好壞直接會影響DNA的回收效率。4：（此步驟適用于W500bp和10kb的DNA片段）如果該DNA片段500 bp，向溶解的凝膠溶液中加入1:2體積的異丙醇（如 100mg凝膠溶于100uL Binding Buffer中，加入100uL異丙醇），混勻。如果該DNA片段10

10、 kb，向溶解的凝膠溶液中加入1:2體積的水（如100mg 凝膠溶于100uL Binding Buffer中，加入100u L水），混勻。5：將800UL凝膠溶液轉(zhuǎn)移到回收柱。2000 rpm室溫離心1分鐘。倒掉廢液， 然后將柱放回收集管。注意：如果凝膠溶液總量超過800 UL，溶液可以分幾次加入回收柱。每次操 作后離心30-60 s并丟棄廢液，直到加入所有凝膠溶液，每個回收柱不能超過1 克瓊脂糖凝膠。低轉(zhuǎn)速離心可以增加DNA與硅膜的結(jié)合時間，有利于增加回收 效率；6：可選步驟。此步驟適用于回收的DNA直接用作測序。向回收柱中加入100UL Binding Buffer。離心1分鐘，倒掉廢液

11、，然后將 柱子放回收集管。7：向回收柱中加入700 u L Wash Buffer （已用無水乙醇稀釋。10000rpm離 心1分鐘。倒掉廢液，然后將柱子放回收集管。8：將空的回收柱再離心1分鐘，徹底去除殘留的Wash Buffer。注意：此步是為了避免回收的DNA溶液中殘留乙醇。若DNA中殘留乙醇，可 能抑制下游酶促反應(yīng)。9：將GeneJET回收柱轉(zhuǎn)入新的1.5 ml離心管，向回收柱中膜中心加50uL洗 脫液。離心1分鐘。注意：（1）對于DNA含量較低，可適當(dāng)減小洗脫體積以增加DNA濃度。洗 脫體積在20-50 u L之間，不會明顯減少DNA產(chǎn)量。但是洗脫體積應(yīng)不小于10山。（2）如果DNA

12、片段10 kb，洗脫液在加入回收柱之前應(yīng)預(yù)熱至65 C。（3）如果洗脫體積為10 u L，DNA含量W5微克，在室溫時放置1分鐘再離心。10 :丟掉GeneJET回收柱，回收的DNA儲存于-20C。實驗室其他膠回收試劑盒原理和用法與上述試劑盒相似，只是結(jié)合液（又稱 為溶膠液）與凝膠塊的比例不一樣。使用試劑盒，先看說明書。注意事項：膠回收時電泳槽中的緩沖液要更換。做膠時要選用的合適的梳子，使電泳后的條帶成為銳利的一條帶，條帶盡 可能的細(xì)，不能糊，所以可以將最小號的梳子根據(jù)所需體積使用膠帶粘了以后使 用。電泳時根據(jù)條帶大小調(diào)節(jié)電壓，低電壓有利于提高電泳的分辨率。盡量減少紫外線照射DNA的時間，防止

13、DNA突變。切膠時在保證切下目的條帶時，凝膠切得越小越好。凝膠時要確保凝膠全部溶解，并注意觀察凝膠溶液顏色。溶膠后等降至室溫在加入回收柱中，確保DNA更好地與膜結(jié)合。凝膠溶液加入到回收柱中后可以先室溫靜置1-2min，再離心凝膠溶液加入到回收柱中后可以低速離心，離心后可將溶液再加入回收柱 中重新結(jié)合。使用Wash Buffer前，確定是否使用無水乙醇稀釋。漂洗后要空轉(zhuǎn)1min，并開蓋靜置1-2分鐘（時間太長不利于洗脫）揮發(fā) 乙醇。洗脫前現(xiàn)將洗脫液預(yù)熱可增加洗脫效率，加洗脫液時要加到膜的中心，并靜置2-3min。DNA的PAGE凝膠回收PAGE凝膠適合分離小片段DNA，比如100bp以下，由于PAGE凝膠后不能再 溶解，因此其回收比較難，按照洗脫原理不同，可以分為2類，直接洗脫法和電 洗脫法。直接洗脫是DNA片段在溶劑的浸泡下自由擴(kuò)散