ELISA基本原理和在手足口病實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)中的應(yīng)用培訓(xùn)課件

1、ELISA基本原理和在手足口病實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)中的應(yīng)用ELISA基本原理和在手足口病實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)中的應(yīng)用內(nèi) 容ELISA的基本原理ELISA的種類ELISA的組成ELISA結(jié)果判定ELISA中的幾個(gè)重要影響因素ELISA的質(zhì)量控制ELISA在手足口病致病病毒檢測(cè)中的應(yīng)用。2ELISA基本原理和在手足口病實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)中的應(yīng)用內(nèi) 容ELISA的基本原理2ELISA基本原理和在手足口1. ELISA的基本原理ELISA（Enzyme-linked immunosorbent assay 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)）是20世紀(jì)60年代發(fā)展起來(lái)的免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)，也是目前應(yīng)用最廣泛的傳染病檢測(cè)方法。ELISA的特點(diǎn)：敏感度和

2、特異度較高，重復(fù)性好。試劑比較穩(wěn)定，易于保存。操作簡(jiǎn)單，價(jià)格便宜，易于在基層大規(guī)模使用。易于標(biāo)準(zhǔn)化和對(duì)檢測(cè)對(duì)象進(jìn)行定量?？梢宰詣?dòng)化。3ELISA基本原理和在手足口病實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)中的應(yīng)用1. ELISA的基本原理ELISA（Enzyme-link抗原抗體反應(yīng)抗原或抗體在體外結(jié)合到某種固相載體表面后，仍然能保持其免疫學(xué)活性而能相互特異性結(jié)合。4ELISA基本原理和在手足口病實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)中的應(yīng)用抗原抗體反應(yīng)抗原或抗體在體外結(jié)合到某種固相載體表面后，仍然能IgG和IgM抗體的三維結(jié)構(gòu)5ELISA基本原理和在手足口病實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)中的應(yīng)用IgG和IgM抗體的三維結(jié)構(gòu)5ELISA基本原理和在手足口病將抗原或抗體與

3、某種酶連接成酶標(biāo)抗原或抗體后，這種酶標(biāo)抗原或抗體既能保留與相應(yīng)抗體或抗原結(jié)合的免疫活性，又同時(shí)保留酶的活性。由于酶具有很高的催化效率，因此可放大抗原抗體反應(yīng)效果，從而使測(cè)定方法達(dá)到很高的敏感性。 抗原抗體復(fù)合物與酶標(biāo)的二抗結(jié)合，加入合適的底物在酶的作用下顯色，顏色的深淺與特異性抗體水平成比例關(guān)系，可進(jìn)行定性和定量分析。6ELISA基本原理和在手足口病實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)中的應(yīng)用將抗原或抗體與某種酶連接成酶標(biāo)抗原或抗體后，這種酶標(biāo)抗原或抗7ELISA基本原理和在手足口病實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)中的應(yīng)用7ELISA基本原理和在手足口病實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)中的應(yīng)用2.ELISA的種類-檢測(cè)抗原競(jìng)爭(zhēng)法 ELISA將特異性抗體包被于固相

4、載體表面，洗滌后分為兩組，一組加入酶標(biāo)抗原和被測(cè)抗原的混合液，另一組只加入酶標(biāo)抗原，經(jīng)孵育洗滌后加底物顯色，兩組吸光度之差就是所測(cè)定未知抗原的量。 包被特異性抗體 酶標(biāo)抗原檢測(cè)抗原孵育洗滌后顯色加樣AB3.顯色3.孵育1.加樣8ELISA基本原理和在手足口病實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)中的應(yīng)用2.ELISA的種類-檢測(cè)抗原競(jìng)爭(zhēng)法 ELISA將特異性ELISA基本原理和在手足口病實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)中的應(yīng)用培訓(xùn)課件檢測(cè)抗體間接法ELISA（Indirect ELISA）將特異性抗原包被于固相載體表面，與標(biāo)本中相應(yīng)特異性抗體結(jié)合，洗滌后再加入酶標(biāo)的抗人IgG或IgM抗體與之結(jié)合，洗滌后加入底物顯色。1.加樣2.孵育3.洗滌4

5、.加入二抗5.孵育6.顯色10ELISA基本原理和在手足口病實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)中的應(yīng)用檢測(cè)抗體間接法ELISA（Indirect ELISA）檢測(cè)抗體捕獲法ELISA（Capture ELISA）專門(mén)用來(lái)檢測(cè)IgM型抗體的方法。將抗人IgM抗體包被于固相載體表面，與標(biāo)本中所有人IgM抗體結(jié)合，洗滌后加入特異性抗原與相應(yīng)的特異性IgM抗體結(jié)合，洗滌后再加入酶標(biāo)的抗原特異性抗體與之結(jié)合，洗滌后加入底物顯色。1.加樣2.孵育3.洗滌4.加入抗原孵育5.加入二抗孵育6.顯色11ELISA基本原理和在手足口病實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)中的應(yīng)用檢測(cè)抗體捕獲法ELISA（Capture ELISA）專檢測(cè)抗體雙抗原夾心法ELISA

6、檢測(cè)標(biāo)本中的總抗體（包括IgM和IgG型抗體） 。將特異性抗原包被于固相載體表面，與標(biāo)本中特異性IgM和IgG型抗體結(jié)合，洗滌后加入酶標(biāo)的特異性抗原與相應(yīng)的抗體結(jié)合，洗滌后加入底物顯色。3.洗滌1.加樣2.孵育6.顯色5.孵育4.加入酶標(biāo)抗原12ELISA基本原理和在手足口病實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)中的應(yīng)用檢測(cè)抗體雙抗原夾心法ELISA檢測(cè)標(biāo)本中的總抗體（包括I3.ELISA試劑的組成固相載體：許多物質(zhì)可以作為固相載體，如纖維素、聚丙烯、聚乙烯、聚氯乙稀和聚苯乙烯等等。目前最為常用的是聚苯乙烯材質(zhì)的微孔板，多為8 12道96孔板條。酶標(biāo)記物：酶與抗體的共價(jià)結(jié)合首先不影響酶及抗體的活性、不產(chǎn)生干擾物質(zhì)、不產(chǎn)生

7、非特異反應(yīng)。辣根過(guò)氧化物酶（HorseRadish Peroxidase，簡(jiǎn)稱HRP）是目前應(yīng)用最為廣泛的酶，是從辣根菜的根中提取。堿性磷酸酶（Alkaline Phosphatase ，簡(jiǎn)稱AP）是從小牛腸粘膜中提取。活性高，但提取工藝復(fù)雜，價(jià)格比較昂貴。底物：不同種類的酶要求使用不同的底物。HRP鄰苯二胺（Orthopenylenediamine，OPD） 、四甲基聯(lián)苯胺（Tetramethylbenzidine，TMB）和ABTS 2,2-連氮-雙-(3-乙基苯并噻唑啉磺酸)，OPD為在ELISA中應(yīng)用最多的底物，靈敏度高，比色方便，作用后變橙紅色，其缺點(diǎn)是配成應(yīng)用液后穩(wěn)定性差。TMB經(jīng)

8、酶作用后由無(wú)色變藍(lán)色，目測(cè)對(duì)比鮮明，加酸停止酶反應(yīng)后變黃色。AP對(duì)硝基苯磷酸酯（p-nitrophenylphosphate，p-NPP）作為底物。產(chǎn)物為黃色的對(duì)硝基酚，在405nm有吸收峰。用NaOH終止酶反應(yīng)后，黃色可穩(wěn)定一段時(shí)間。13ELISA基本原理和在手足口病實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)中的應(yīng)用3.ELISA試劑的組成固相載體：許多物質(zhì)可以作為固相載體，洗滌液：聚苯乙烯等塑料對(duì)蛋白質(zhì)的吸附作用是普遍性的，因此在ELISA在洗滌時(shí)應(yīng)非特異性吸附的干擾物質(zhì)洗滌下來(lái)。洗滌是最主要的關(guān)鍵技術(shù)，應(yīng)引起操作者的高度重視，應(yīng)嚴(yán)格按要求洗滌。洗滌液多為含非離子型洗滌劑的中性緩沖液，一般是吐溫20（聚山梨酯 ）。標(biāo)本稀

9、釋液：用來(lái)稀釋血清標(biāo)本，有時(shí)也稀釋酶結(jié)合物。RF吸附劑：在進(jìn)行IgM抗體檢測(cè)時(shí)，間接ELISA方法需要使用RF吸附劑去除類風(fēng)濕因子的干擾作用。14ELISA基本原理和在手足口病實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)中的應(yīng)用洗滌液：聚苯乙烯等塑料對(duì)蛋白質(zhì)的吸附作用是普遍性的，因此在E4.結(jié)果判斷S/CO：其中S為Sample(樣本)或Specimen(標(biāo)本)的簡(jiǎn)寫(xiě)，表示的是標(biāo)本測(cè)定的吸光度值，CO為Cut-off值的簡(jiǎn)寫(xiě)。除競(jìng)爭(zhēng)抑制法外，其它ELISA定性測(cè)定模式中，當(dāng)S/CO值大于或等于1時(shí)，標(biāo)本的測(cè)定為陽(yáng)性，小于1時(shí)為陰性。S/N或P/N：其中S為Sample(樣本)或Specimen(標(biāo)本)的簡(jiǎn)寫(xiě)，N為Negativ

10、e(陰性對(duì)照)的簡(jiǎn)寫(xiě)，P為Patient（患者）的簡(jiǎn)寫(xiě)。較早的試劑盒很多都使用S/N或 P/N2.1為陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn)，現(xiàn)仍有一些試劑盒使用這種方式。這種方式與S/CO方式無(wú)根本性區(qū)別，只不過(guò)是前者將陰性對(duì)照（N）的2.1倍視為Cut -off值而已 。15ELISA基本原理和在手足口病實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)中的應(yīng)用4.結(jié)果判斷S/CO：其中S為Sample(樣本)或Spec5.ELISA的幾個(gè)影響因素ELISA本身方法學(xué)上，敏感度和特異性不能達(dá)到100%。敏感度增加，則特異度降低，反之亦然。不同的檢測(cè)目的對(duì)敏感度和特異度的要求不同。如篩查需高敏感的檢測(cè)試劑，而風(fēng)疹CRS則需要高度特異的檢測(cè)試劑。不同生產(chǎn)商。

11、外部因素孵育時(shí)間和溫度。標(biāo)本的條件。實(shí)驗(yàn)對(duì)照。實(shí)驗(yàn)操作人員的教育背景和培訓(xùn)。試劑保存條件和批號(hào)。實(shí)驗(yàn)設(shè)備。結(jié)果解釋（免疫史、接觸史等）。結(jié)果的抄寫(xiě)和報(bào)告。16ELISA基本原理和在手足口病實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)中的應(yīng)用5.ELISA的幾個(gè)影響因素ELISA本身外部因素16ELIELISA的影響因素-標(biāo)本采集時(shí)間。有無(wú)溶血、黃疸。血紅蛋白中含有血紅素基團(tuán)，其有類似過(guò)氧化物的活性，因此，在以HRP為標(biāo)記酶的ELISA測(cè)定中，如血清標(biāo)本中血紅蛋白濃度較高，則其就很容易在溫育過(guò)程中吸附于固相，從而與后面加入的HRP底物反應(yīng)顯色。有無(wú)細(xì)菌污染。細(xì)菌生長(zhǎng)所分泌的一些酶可能會(huì)對(duì)抗原抗體等蛋白產(chǎn)生分解作用；一些細(xì)菌的內(nèi)源

12、性酶如大腸桿菌的-半乳糖苷酶本身會(huì)對(duì)用相應(yīng)酶作標(biāo)記的測(cè)定方法產(chǎn)生非特異性干擾。有無(wú)反復(fù)凍融。機(jī)械剪切力將對(duì)標(biāo)本中的蛋白等分子產(chǎn)生破壞作用，從而引起假陰性結(jié)果。17ELISA基本原理和在手足口病實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)中的應(yīng)用ELISA的影響因素-標(biāo)本采集時(shí)間。17ELISA基本原理和6.ELISA的質(zhì)量控制內(nèi)部質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)化操作(SOP)儀器設(shè)備的維護(hù)和校準(zhǔn)數(shù)據(jù)處理和報(bào)告試劑內(nèi)部質(zhì)量控制外部質(zhì)量控制人員培訓(xùn)職能考核實(shí)驗(yàn)室間復(fù)核現(xiàn)場(chǎng)認(rèn)證確保實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確和可信。容許范圍內(nèi)的實(shí)驗(yàn)室結(jié)果人員培訓(xùn)職能考核實(shí)驗(yàn)室間復(fù)核現(xiàn)場(chǎng)認(rèn)證試劑內(nèi)部質(zhì)量控制數(shù)據(jù)處理、記錄和報(bào)告操作規(guī)程儀器校準(zhǔn)、維護(hù)18ELISA基本原理和在手

13、足口病實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)中的應(yīng)用6.ELISA的質(zhì)量控制內(nèi)部質(zhì)量控制確保實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確內(nèi)部質(zhì)控血清（In-house Control, IHC）什么是IHC？在每次ELISA試驗(yàn)時(shí)都要加入一個(gè)實(shí)驗(yàn)室自制的IHC。通過(guò)對(duì)IHC檢測(cè)結(jié)果的監(jiān)測(cè)，來(lái)確保不同時(shí)間、不同地點(diǎn)的相同檢測(cè)結(jié)果的正確性和可重復(fù)性。為什么不能用試劑本身的對(duì)照作為IHC？不能監(jiān)測(cè)標(biāo)本處理過(guò)程。試劑對(duì)照本身的局限性，不能用于不同試劑。有些試劑對(duì)照不是真血清。19ELISA基本原理和在手足口病實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)中的應(yīng)用內(nèi)部質(zhì)控血清（In-house Control, IHC）什質(zhì)控圖（舉例）3SD-3SD2SD-2SD20ELISA基本原理和在

14、手足口病實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)中的應(yīng)用質(zhì)控圖（舉例）3SD-3SD2SD-2SD20ELISA基本6.ELISA在手足口病致病病毒檢測(cè)中的應(yīng)用。商業(yè)化試劑檢測(cè)EV71病毒IgM抗體。貝爾萬(wàn)泰捕獲法ELISA.仍在評(píng)價(jià)中。結(jié)果要謹(jǐn)慎判斷。21ELISA基本原理和在手足口病實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)中的應(yīng)用6.ELISA在手足口病致病病毒檢測(cè)中的應(yīng)用。商業(yè)化試劑檢測(cè) 手足口病的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)發(fā)病后從皰疹液、腦脊液、咽部、糞便中檢測(cè)EV-71或CAV-16等腸道病毒特異性核酸陽(yáng)性。在血液或腦脊液中查到抗EV-71或CAV-16等腸道病毒lgM抗體。急性期與恢復(fù)期血清中EV-71或CAV-16等腸道病毒IgG抗體陽(yáng)轉(zhuǎn)或有4倍增高。急

15、性期與恢復(fù)期血清中EV-71或CAV-16等腸道病毒中和抗體陽(yáng)轉(zhuǎn)或有4倍增高。從皰疹液、腦脊液、咽部、糞便中分離到EV-71或CAV-16等腸道病毒者。22ELISA基本原理和在手足口病實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)中的應(yīng)用 手足口病的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)發(fā)病后從皰疹液、腦脊液、咽部、糞便中檢捕獲法ELISA測(cè)抗體IgM捕獲法（貝爾試劑）1.無(wú)IgG或類風(fēng)濕因子的干擾2.敏感性和特異性高23ELISA基本原理和在手足口病實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)中的應(yīng)用捕獲法ELISA測(cè)抗體IgM捕獲法（貝爾試劑）23ELISAEV-71病毒IgM抗體檢測(cè)-貝爾試劑室溫平衡30min以上。配液：將濃縮洗滌液用蒸餾水或去離子水20倍稀釋。編號(hào)：將標(biāo)本對(duì)應(yīng)微

16、孔板按序編號(hào)，每板應(yīng)設(shè)陰性對(duì)照3孔，陽(yáng)性對(duì)照1孔和空白對(duì)照1孔。加稀釋液：每孔加入標(biāo)本稀釋液100l，空白孔和陰性、陽(yáng)性對(duì)照孔除外。加樣：分別在相應(yīng)孔中加入陰性、陽(yáng)性對(duì)照100l，待測(cè)標(biāo)本10l，輕輕振蕩混勻。孵育：用封板膜封板后，37孵育50min。洗板：小心揭掉封板膜，用洗板機(jī)洗滌5遍，最后一次扣干。加酶標(biāo)工作液：每孔加入100l，空白孔除外。孵育：用封板膜封板后，37孵育50min。洗板：操作同上。顯色：每孔加入顯色劑A、B液各50l，輕輕振蕩混勻，37避光顯色15min。測(cè)定：每孔加入終止液50l，輕輕振蕩混勻，10min內(nèi)測(cè)定結(jié)果。設(shè)定酶標(biāo)儀波長(zhǎng)于450nm，用空白孔調(diào)零后測(cè)定各孔A值。24ELISA基本原理和在手足口病實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)中的應(yīng)用EV-71病毒IgM抗體檢測(cè)-貝爾試劑室溫平衡30min以上試劑對(duì)照范圍陰性對(duì)照A值0.1。若1孔陰性對(duì)照A值0.1應(yīng)舍棄，若2孔或3孔陰性