高通量測序科研入門常用名詞意義整理

1、目錄 TOC o 1-5 h z HYPERLINK l bookmark0 o Current Document 一、OTU分類和統(tǒng)計2 HYPERLINK l bookmark2 o Current Document 二、生物信息分析 2 HYPERLINK l bookmark4 o Current Document 三、16SrRNA 3 HYPERLINK l bookmark6 o Current Document 四、Alpha 多樣性4 HYPERLINK l bookmark8 o Current Document 五、稀疏性分析 r rarefaction analysis

2、 ）和稀疏性曲線（rarefaction curve ） 7 HYPERLINK l bookmark10 o Current Document 六、Shannon-Weiner指數(shù)8 HYPERLINK l bookmark12 o Current Document 七、Rank Abundance曲線9 HYPERLINK l bookmark14 o Current Document 八、微生物種屬鑒定及相關(guān)分析 1.0 HYPERLINK l bookmark16 o Current Document 九、OTU群落聚類及相關(guān)分析 14 HYPERLINK l bookmark18 o

3、 Current Document 十、Rank Abundance 曲線15 HYPERLINK l bookmark20 o Current Document H一、韋恩圖（Venn ） 1.6-、OTU分類和統(tǒng)計OTU（operationaltaxonomicunits）是在系統(tǒng)發(fā)生學(xué)研究或群體遺傳學(xué)研究中，為了便于進行分析，人為給某一個分類單元（品系，種，屬，分組等）設(shè)置的同 一標志。通常按照97%勺相似性閾值將序列劃分為不同的 OTU每一個OTU!常 被視為一個微生物物種。相似性小于 97瓶可以認為屬于不同的種，相似性小于 93%-95%可以認為屬于不同的屬。樣品中的微生物多樣性和不

4、同微生物的豐度 都是基于對OTUB分析。Coverage是指各樣品文庫的覆蓋率，其數(shù)值越高，則樣本中序列沒有被測出的 概率越低。該指數(shù)實際反映了本次測序結(jié)果是否代表樣本的真實情況。計算公式為：C=1-n1/N其中口1=只含有一條序列的OTU勺數(shù)目；N才由樣中出現(xiàn)的 總的序列數(shù)目。分類水平統(tǒng)計表主要是對每個樣本在分類學(xué)水平上的數(shù)量進行統(tǒng)計， 并且在表格 中列出了在每個分類學(xué)水平上的物種數(shù)目（只顯示前 10個樣本，如果樣本超過10個，請查看結(jié)果中taxon_all.txt 文件） 其中SampleNamefe示樣本名稱；Phylum表示分類到門的 OTIM量；Class表示 分類到綱的OTU&量；

5、Order表示分類到目的OTU量；Family表示分類到科的 OTUJ&量；Genus表示分類到屬的OT吸量；Species表示分類到種的OT吸量。二、生物信息分析.數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析1）有效測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計2）可供精準分析的數(shù)據(jù)統(tǒng)計.數(shù)據(jù)回歸樣品1）根據(jù)tag信息將測序數(shù)據(jù)回歸各自樣品.單樣品微生物種類及豐度分析1）序列聚類 OTU（OperationalTaxonomicUnits ）2）取樣深度判定（RarefactionCurve ）3）計算菌群多樣性和豐度指數(shù)4）單樣品群落結(jié)構(gòu)分析.多樣品間比較分析1）全樣品相似度比對2）多樣品OTU比較3）多樣品群落結(jié)構(gòu)分析4）PCA （Principalc

6、omponentanalysis ）分析5）WeightedunifracPCA 分析6）組間顯著性差異分析16SrRNA為核糖體的RNA勺一個亞基，16SrDNAft是編碼該亞基的基因。細菌 rRNA （核糖體RNA按沉降系數(shù)分為3種，分別為5S、16S和23SrRNA 16SrDNAl 細菌染色體 上編碼16SrRN片目對應(yīng)的DNAff列，存在于所有細菌染色體基因中。16SrDNA細菌的系統(tǒng)分類研究中最有用的和最常用的 分子鐘，其種類少， 含量大（約占細菌DNAt量的80% ,分子大小適中，存在于所有的生物中，其 進化具有良好的時鐘性質(zhì)，在結(jié)構(gòu)與功能上具有高度的保守性2,素有“細菌化石”之

7、稱。在大多數(shù) 原核生物中rDNA都具有多個拷貝，5S、16S、23SrDNA勺拷 貝數(shù)相同。16SrDNAS于大小適中，約1.5Kb左右，既能體現(xiàn)不同菌屬之間的差 異，又能利用測序技術(shù)較容易地得到其序列，故被細菌學(xué)家和分類學(xué)家接受。16SrRNA 16SrDNA勺區(qū)另16S中的S是一個沉降系數(shù),亦即反映生物大分子在離心場中向下沉降速 度的一個指標，值越高，說明分子越大。rDNA和rRNA中的小寫字母r是 ribosome（核糖體）的縮寫。rDNA指的是基因組中編碼核糖體 RNA（rRNA）分子的 對應(yīng)的DNAff列，也就是編碼16SrRNA勺基因。rRNA指的是rDNA的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物， 它是構(gòu)成核

8、糖體的重要成分，核糖體由許多小的rRNA分子組裝而成，16SrRNA是其中一個組件.一般所分析的對象都是16srDNA因為DNAE取容易，也比較 穩(wěn)定。16S rRNA具有多項功能。.對于核糖體蛋白的固定起到腳手架的作用。2.3末端包含反向的 SD序列，用來與 mRNA的AUG起始密碼子結(jié)合。16S rRNA的 3端與S1、S21的結(jié)合被發(fā)現(xiàn)與蛋白質(zhì)合成的開始有關(guān)系。.與23S進行交互，幫助兩個 核糖體子單元的結(jié)合。（50S+30S ）.在A site穩(wěn)定密碼子與反密碼子的正確配對。16SrDNA定方法隨著生物技術(shù)的飛速發(fā)展，傳統(tǒng)的微生物鑒定方法常常難以鑒定眾多的生長 習(xí)性復(fù)雜的微生物，因而基

9、于基因組序列的分子鑒定受到廣泛關(guān)注。在細菌基因 組中，編碼16SrRNAW rDNA基因具有良好的進化保守性，適宜分析的長度（約| 為1540bp）,以及與進化距離相匹配的良好變異性，所以成為細菌分子鑒定的 標準標識序列。16SrDNA勺序歹U包含9或10個可變區(qū)（variableregion ）和11 個恒定區(qū)（constantregion ）。保守序列區(qū)域反映了生物物種間的親緣關(guān)系，而 高變序列區(qū)域則能體現(xiàn)物種間的差異。16SrDN6子的序列特征為不同分類級別 的近緣種系統(tǒng)分類奠定了分子生物學(xué)基礎(chǔ)。目前16SrDNA勺序列信息已經(jīng)廣泛應(yīng) 用于菌種鑒定和系統(tǒng)發(fā)生學(xué)研究。16SrDNAR據(jù)分析

10、初始數(shù)據(jù)層面：質(zhì)量統(tǒng)計，序列長度及分布統(tǒng)計，數(shù)據(jù)預(yù)處理，有效序列統(tǒng) 計。QTUU面：OTUb類學(xué)統(tǒng)計，Alpha多樣性分析，稀疏性曲線，Shannon-Wiene 曲線，Rankabundance曲線。物種豐度層面：物種分類注釋，Beta多樣性分析，樣本問OT必異分布分 析，OTU度分布聚類分析，主成分分析，顯著性差異分析，樣本組間差異分析。群落結(jié)構(gòu)層面多樣本物種分布比較，群落相似度比較， 群落相似度PCoA 分析，基于組間進化的差異顯著性(Un)WeightedUnifrac 分析，RDA/CCA1群與 環(huán)境因子之間的關(guān)系分析，系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建，含種類分級的進化樹的構(gòu)建。四、Alpha多樣性

11、在微生物多樣性分析的報告 中主要包括五個部分：Alpha多樣性分析、Beta 多樣性分析、物種組成分析、進化關(guān)系分析、相關(guān)性分析 ，其中Alpha多樣性分 析是生態(tài)學(xué)中生物多樣性的一個重要的組成部分，也是比較基礎(chǔ)的一部分。Alpha多樣性是指一個特定區(qū)域或生態(tài)系統(tǒng)內(nèi)的多樣性，是反映豐富度和均勻度的綜合指標。Alpha多樣性主要與兩個因素有關(guān)：一是種類數(shù)目，即豐富度； 二是多樣性，群落中個體分配上的均勻性。群落豐富( Communityrichness )的 指數(shù)主要包括Chao指數(shù)和ACE旨數(shù)。群落多樣性(Communitydiversity )的指 數(shù)，包括Shannon指數(shù)和Simpson

12、指數(shù)。(Simpson指數(shù)是評價優(yōu)勢度，Shannon 是評價多樣性；Simpson指數(shù)越高代表物種多樣性越低；Simpson指數(shù)和Shannon 指數(shù)是相反關(guān)系)匕IDReadg(LOSOTUKEdw3仁口VEI70EshniaKL! andImm21U1Z?3145)128 (1-20.95覦%Z63 wii VW(2.f4( 2C】)Q+2W1 (Ok 1921, & 2082)n 曳 eooom10846154154 143.178)157(13. IM)0.箱76031(2.S9h 2. 6&)Ou 2041 (0L 1988.0. 213S)134, 000000士皿，leA310

13、B0312(194, IE幻14031,1Z】f ) 0. 99TSM2.祐 (2.6f 2.68)0lM2 g 1901, & 204n126.0000001005122130 (125, US)12T (173,140)0. 966072.M1(2. 65, 2.12)0L1969(0l 1EB4, Q. 2fl35)122.00000010004US：3h”27,3)131U23,15EQ. 997BO12.33ft色之3T)OlZ, . 10. 270Sh Q. 2B加i群落豐富度指OTU數(shù)目的指數(shù)，chaol在生態(tài)學(xué)中常用來估計物種總數(shù),由 Chao(1984)OTU數(shù)目的指數(shù)，ch

14、aol在生態(tài)學(xué)中常用來估計物種總數(shù),由 Chao(1984)只含有一演序列的口TV數(shù)目f如喇金心V),七只含存商條序列的cti：數(shù)n(如山阿皿”工Ace：用來估計群落中含有 OTU數(shù)目的指數(shù)，由 Chao提出，是生態(tài)學(xué)中估計物種總數(shù)的常用指數(shù)之一, 與Chaol的算法不同。 080胃4好該等級OTU中序列數(shù)的相對百分含量，即屬于該 OTU的序列數(shù)除以總序列數(shù)，縱坐標軸上數(shù) 字，例如“108弋表相對豐度為100%, “1酰表相對豐度為10%,依次類推。八、微生物種屬鑒定及相關(guān)分析分類學(xué)分析在之前的分析步驟中，已經(jīng)將序列按照其自身的堿基組成的相似性，分歸到各OTU中。在進行分類學(xué)分析時， 首先，將

15、每一條優(yōu)質(zhì)序列都與 SILVA 119數(shù)據(jù)庫進行比對， 找出其最相近且 可信度達80%以上的種屬信息。之后，將每一個OTU中的所有序列進行類比，找出同一 OTU中 的不同序列的最近祖先的種屬信息。最后，將得到的結(jié)果記錄在表格文件中。這樣做，可以在保留最可能多的信息量的情況下，確保得出信息的準確性。使用軟件：mothur10PFl nameA二CQT腐田EKjperidngdomphylimdasaoideirfamilygenusspeciescmji$2639711,SISAl GPXP&.k MTWHjoBxim 域Pm觀s%向GaninfinaMbx“叩fjgSlRlilV-blyWid

16、y口而。珈IEurwult M .回心m uDTU221322C H制的Al第。IP.日盛舊聞rM*upi6*一箱域FiELgESelM中即中ui出uihcuUjiM iuwn bucci ifn01U3102?HU?的AJ GROLP,日就而或 rWXsuiM目TFinicucKAl1小。出10叱*（麻j . jih./iurcult 既ur把nMcuoma1加1J58522577Al樂琪只Bam伊喇即BaLiena日;th巾蝴fi日和lerdd值存*n*urcult bc urntetc-su12E51E24即驍再Al GROtPr日m MYiupi口齪1時dFimicub網(wǎng)W r#id5

17、、汕京Eiyvpflal 向Sd 出 Hwiuirurt- ulLi n 15 競口 bat 匕ur575276222N由值加r加旌up日團:中金Fini監(jiān)tk哥蚓皿畛%lwr Q(W岫 1 5V&l jilt 就史&SeliKumtmat% HUiriUf J： biff i.1251:21站d魚Al GP.3LP.BjHt a加池伊昵呼&Finicj踮H-juLhxl：*恥如IITHMKWE蔚字筆=L，. dsk. lurtult pc rumn bactiiirCfTLfl215245195(7Al GFCiLPBjLir日ad前人日必皿加科Oacls1 adiiuKuHbied iim

18、erl bEeriiTiOTU name 為 OTU 編號;第二列至OTUsize列的前一列為各樣本的序列在所有OTU中的含有情況。例如，第二行第二列的數(shù)字代表樣品 A中有多少序列被劃分入 OTU1中。OTUsize為該OTU中所含序列的數(shù)量；Taxonomy列為OTU對應(yīng)的種屬信息。種屬信息按照分類學(xué)水平分為多列，我們將物種 的門、綱、目、科、屬、種的信息進行了分類分析，便于對數(shù)據(jù)的篩選提取。例如，需要提 取所有含有屬信息的 OTU的相關(guān)信息，可在excel中選取屬這一列，在工具欄的數(shù)據(jù)項中， 點選篩選，查看該列第一行的單元格，在下拉菜單中的文本篩選項下方的區(qū)域內(nèi)，取消選擇“空白”，點確定，

19、即得到所有含有屬信息的OTU言息。注：分類學(xué)數(shù)據(jù)庫中會出現(xiàn)一些分類學(xué)譜系中的中間等級沒有科學(xué)名稱，以 norank作 為標記。分類學(xué)比對后根據(jù)置信度閾值的篩選，會有某些分類譜系在某一分類級別分值較低，在統(tǒng)計時以Unclassified 標記。6個水平分別提取信息，分將OTU6個水平分別提取信息，分例表:11分黑的熱制z11345e1ag3 UsdjeIpjporkinjd&mi由口 iWIR11?B1920731曄i1531851仃14聊11133icm海phvl 師Prcrf-nnaclPfia41153S304839153S37&6131BD鋁發(fā)181mas晅T - nxjtpgpe69U

20、5812B71&5S99網(wǎng)53395J125K?19S3的53512phyiumFi-micxrle3236郵4乳a117295154i72011S32Biphylumi日各口日療用演三合1:12Ua的5015璇31TMS制4da.GamnroleDbactefia374B3300止.謝13a73119B?10C771420024013日96102751classTherrTotDae33932S351324310225T0叫1T563362204 Heflspoleobadlfai 的324224到470加316172152寸classClOStridiiEi切474a第1居TG5S113力

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23、41672306S0JtMMJmpeoHth -.iliedt34HdglEd“1M3Dg124bi21業(yè)2? 146EHAlOtJIlr9呼Huncu:uredtplGque-Ua 口 Tn 出口 K AHodin-ium口 g陽zcurn口 Annoe&opnryaO 心 yrOdmuiTiDwrF 四皿口一口 小呻3M%Maxiiffiipod 941 %other在圖中顯示other在圖中顯示多樣品相似度樹與柱狀圖組合分析13左邊是樣品間基于群落組成的層次聚類分析（ bray-curtis算法），右邊是樣品的群落結(jié)構(gòu)柱狀圖例圖:GyFOOlniumGyFOOlniumpg 即Ani侯廂

24、 hryCochlodin umGonyiuljxColKzoumNsoceratiumHeTerodin(umKirKidm nrr.口l-nplnT+cn小 閂 irtniwtftninnTelonemanFil / OCyStiE一TinseirnisDubciscquella曰ythrqpsidiniiiniIwencielaTeleaulaKtrcKiibidiLmHeraconL&F im：j|kisPrymnesiuniCrry&ociwcmuiinaB jBtDdiiiiuinChytriddniifntixdridiunr口RlvzosptiMflaothers九、OTU群落

25、聚類及相關(guān)分析OTU（Operational Taxonomic Units ）是在系統(tǒng)發(fā)生學(xué)研究或群體遺傳學(xué)研 究中，為了便于進行分析，人為給某一個分類單元（品系，種，屬，分組等）設(shè) 置的同一標志。在生物信息分析中，一般來說，測序得到的每一條序列來自一個 菌。要了解一個樣品測序結(jié)果中的菌種、 菌屬等數(shù)目信息，就需要對序列進行歸 類操作（cluster ）。通過歸類操作，將序列按照彼此的相似性分歸為許多小組， 一個小組就是一個OTU根據(jù)客戶指定的相似度（96% 97前者98% ,對所有 序列進行OTU劃分并進行生物信息統(tǒng)計分析。通常在97%勺相似水平下的OTU進 行生物信息統(tǒng)計分析。14QTUnawAB口EFGHIJKLOTU sicQT晅*IM10C2104CN6前國.潴222舊詢aorg7m7M?4WMF11M幅111Q1K3K?OTUSd器4-m33ffl&l俯?85WHKForw139fi而1?ra1-fcXJ1M3-&T3335冊？FifidS