蘆丁的純化及其含量測(cè)定

1、蘆丁的純化及其含量測(cè)定【摘要】目的制備高純度蘆丁的目的是用作對(duì)照品或滿足其它特殊需要的試劑。方法從槐米中提取蘆丁，并將其制備成對(duì)照品。采用既簡(jiǎn)便又經(jīng)濟(jì)的酸提堿沉法從槐米中提取蘆丁，經(jīng)過精致，別離得蘆丁對(duì)照品，并用一般方法、薄層層析法、核磁共振法進(jìn)展鑒定，高效液相法測(cè)定其含量。結(jié)果經(jīng)化學(xué)法、薄層層析法鑒定，核磁共振鑒定說明蘆丁樣品與蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品圖根本一致；高效液相測(cè)得含量98.05%。結(jié)論此種實(shí)驗(yàn)室制備蘆丁對(duì)照品的方法操作簡(jiǎn)單易行，產(chǎn)品純度較高可作為對(duì)照品代替標(biāo)準(zhǔn)品用?！娟P(guān)鍵詞】蘆丁；別離；純化；高效液相色譜法；含量測(cè)定Abstrat：bjetiveTestablishtheethdsfrpuri

2、fiatin,identifiatinanddeterinatinfrutinreferenesubstane.ethdsExtratrutinfrSphrajapniaL.bythealkaliextratinandaidpreipitatin.Thenrefineentandseparatinftherutinreferenesubstaneasdne.Identifiedthesubstanebythenralay.TLandNR.HPLasusedtdeterinethententfrutin.ResultsAfteridentifiedbyheialay,TL,andNR,there

3、sultsshedthatthehartfthesaplefrutinandthehartfstandardsubstaneereunanius,theeanntentas98.05%.nlusinThisayfpreparingrutininthelabissipleandpratial.Theprdutsareverypure,sitanbeusedinplaefsubstanereplaedstandardsubstane.Keyrds：Rutin;Separatin;Purify；HPL；Deterinatin蘆丁是一種分布廣泛的黃酮類化合物，主要存在于槐米，蕓香，蕎麥，沙棘等植物。黃

4、酮類化合物在心腦血管疾病的治療上起到了舉足輕重的作用，蘆丁utin,又稱蕓香苷(rutnside)便是其中的一個(gè)典型代表，其效用同維生素P。能降低毛細(xì)血管通透性和脆性，促進(jìn)細(xì)胞增生和防止血細(xì)胞凝聚以及抗炎、抗過敏、利尿、解痙、鎮(zhèn)咳，降血脂等方面的作用1，臨床上蘆丁主要用于高血壓病的輔助治療和用于防治因蘆丁缺乏所致的其它出血癥，如防治腦血管出血、高血壓、視網(wǎng)膜出血、紫癜、急性出血性腎炎、慢性氣管炎，血液浸透壓不正?；謴?fù)毛細(xì)血管彈性等癥，同時(shí)還用于預(yù)防和治療糖尿病及合并高血脂癥2，國(guó)內(nèi)外醫(yī)藥工業(yè)中用蘆丁作原料消費(fèi)蘆丁片、維腦路通(羥乙蘆丁)、蘆丁鎂、槲皮素等心血管藥物3。蕓香苷廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥，保健

5、食品和化裝品中。在食品工業(yè)中蘆丁除了可作保健品外，還可作為抗氧劑和天然食用黃色素。在化裝品行業(yè)，蘆丁是目前較為理想的一種天然廣譜防曬劑4，本實(shí)驗(yàn)擬探究一種實(shí)驗(yàn)室制備高純度蘆丁的方法，用作對(duì)照品或滿足其他特殊需要的試劑。1儀器與試劑1.1儀器高效液相(aters)，電子分析天平(型號(hào)BS124S)，JB202-電熱恒溫枯燥箱(上海金忠科學(xué)儀器制造)，DL-360超聲波清洗皿(浙江象山縣石浦海天電子儀器廠)，TGL-16臺(tái)式高速離心機(jī)(上海冠戈實(shí)業(yè)制造)，紫外分光光度計(jì)2401P-日本島津。1.2試劑蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(中國(guó)藥品生物制品鑒定所)，甲醇為色譜醇，其它試劑均為分析醇，水為重蒸水。1.3材料購(gòu)于

6、石河子大學(xué)一附院藥房經(jīng)鑒定無誤。2方法與結(jié)果2.1蘆丁的提取精制采用酸提堿沉法，稱取槐米粉，置500l燒杯中，加沸水、硼砂攪拌，于石棉網(wǎng)上加熱至微沸，然后參加適量飽和石灰水溶液，保持pH89之間，并不斷地?cái)嚢?，微?0in后，過濾，濾液搜集，濾渣在置于500l燒杯中，加沸水l，硼砂攪拌，于石棉網(wǎng)上加熱至微沸，然后在參加適量飽和石灰水溶液，調(diào)pH89之間，并不斷的攪拌，微沸30in后，過濾，濾渣棄去，濾液合并，待濾液溫度降至6070之間時(shí)用濃鹽酸調(diào)pH45之間，當(dāng)溫度降至室溫時(shí)放入冰箱靜置12h，使沉淀完全，抽濾，沉淀用蒸餾水洗至中性，枯燥得粗品蘆丁，蒸餾水重結(jié)晶，得精制蘆叮2.2蘆丁的純化用葡

7、聚糖凝膠柱進(jìn)一步別離純化，稱取精制蘆丁0.25g，用少量甲醇使之溶解，參加葡聚糖凝膠柱頂，用甲醇洗脫，試管搜集，15l/管，共搜集22管，用聚酰胺膜鑒定蘆丁并作如下合并搜集液。第1瓶110管，第2瓶1122管；然后水浴濃縮至原液的一半，冷置，僅第一瓶出現(xiàn)黃綠色微細(xì)針狀結(jié)晶，再繼續(xù)濃縮，60枯燥即得蘆丁純品。2.3蘆丁的鑒定2.3.1一般鑒定本品為黃色結(jié)晶粉末，熔點(diǎn)經(jīng)梯勒熔點(diǎn)管測(cè)定熔程為188190，與文獻(xiàn)報(bào)道一致；鹽酸鎂粉反響呈陽(yáng)性；氨性氯化鍶反響呈陽(yáng)性顯示有鄰二酚羥基；鋯鹽枸櫞酸反響呈陽(yáng)性顯示有3及5-羥基存在。水解液用薄層層析鑒定，顯示有葡萄糖及鼠李糖存在。轉(zhuǎn)貼于論文聯(lián)盟.ll.2.3.2

8、薄層層析鑒別純度用35的聚酰胺膜，選3種展開劑：分別為A，丙酮水31；B，氯仿甲醇54；，醋酸乙酯甲酸水811。氨熏后噴顯色劑3%的三氯化鋁顯色，經(jīng)重結(jié)晶的蘆丁樣品在上述3種展開劑中均顯兩個(gè)斑點(diǎn)，Rf值較低的點(diǎn)與槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品的Rf值相等，因此證明蘆丁中含有少量槲皮素。繼續(xù)用葡聚糖凝膠別離純化，結(jié)果蘆丁在上述3種展開劑中，只顯一個(gè)斑點(diǎn)。結(jié)果見圖1。2.3.3氫核磁共振法鑒定由圖可說明蘆丁樣品與蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品圖一致，結(jié)果見圖2。2.4蘆丁含量測(cè)定(HPL法)2.4.1色譜條件流動(dòng)相為甲醇4.3%乙酸(5545)，應(yīng)用前經(jīng)混合纖維素酯微孔濾膜過濾，超聲脫氣，流速為1.0l/in，進(jìn)樣量為20l，檢測(cè)波長(zhǎng)

9、為254n，蘆丁的出峰時(shí)間為34in，該色譜條件下對(duì)照品及樣品的色譜圖結(jié)果見圖34。2.4.2最大波長(zhǎng)的選擇配置蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液，濃度為0.00204g/l在紫外分光光度計(jì)中掃描得如下列圖：結(jié)果顯示最大吸收波長(zhǎng)有214，254，360n，由于在214n處干擾因素多，因此高效液相選擇在254n處測(cè)定。結(jié)果見圖3。2.4.3供試品溶液的配制精細(xì)稱取經(jīng)變色硅膠枯燥的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品0.01005g，蘆丁樣品1號(hào)(為經(jīng)過葡聚糖凝膠柱別離的)0.01005g，蘆丁樣品2號(hào)(未經(jīng)葡聚糖凝膠柱別離的)0.01002g，分別置于50l容量瓶?jī)?nèi)，用甲醇定容，在超聲清洗皿中超聲3in，使之全部溶解，然后在分別倒少量入EP

10、管中離心10in，12000r/in。得蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度為0.201g/l，蘆樣1號(hào)濃度為0.201g/l，蘆樣2號(hào)濃度為0.2022g/l。2.4.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液的濃度為0.201g/l，將其稀釋成1，1/2，1/4，1/16，1/64，1/256系列濃度，編號(hào)為1，2，3，4，5，6，汲取20l進(jìn)樣，以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線如下，進(jìn)展線性回歸處理，求出回歸方程：Y=4E+07X-2660.2，r=0.9996，濃度單位是g/l，峰面積的范圍在228710.5Vs7494036.5Vs內(nèi)，結(jié)果說明蘆丁的在0.006281250.201g/l濃度范圍內(nèi)，濃

11、度與峰面積呈良好的線性關(guān)系。結(jié)果見圖6。2.4.5樣品含量測(cè)定5將配制好的蘆丁樣品1號(hào)，2號(hào)進(jìn)樣，測(cè)得峰面積，然后代入標(biāo)準(zhǔn)曲線得濃度。結(jié)果見表12。表1樣品1號(hào)含量測(cè)定結(jié)果略表2樣品2號(hào)含量測(cè)定結(jié)果略2.4.6加樣回收實(shí)驗(yàn)分別取3份濃度的樣品1號(hào)溶液0.8l放入EP管中，在分別加標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.1，0.2，0.3l，甲醇0.2，0.1，0l，定于1.1l，離心10in，12000r/in，結(jié)果見表3。表3回收率測(cè)定結(jié)果略2.4.7蘆丁樣品精細(xì)度實(shí)驗(yàn)精細(xì)量取蘆丁樣品1號(hào)溶液1l放入EP管中，離心10in，12000r/in。共測(cè)5次。結(jié)果見表4。表4精細(xì)度實(shí)驗(yàn)結(jié)果略2.4.8蘆丁樣品重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)精細(xì)

12、量取蘆丁樣品1號(hào)溶液0.8l于EP管中，在加0.2l甲醇，分別做5份，離心10in，12000r/in。結(jié)果見表5。表5樣品重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果略3討論3.1用酸提堿沉法提取蘆丁具有工藝簡(jiǎn)單、效率高和較經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)，采用高效液相法測(cè)定蘆丁的含量，該法使用的試劑常見，方法準(zhǔn)確、靈敏、線性范圍寬，穩(wěn)定性和重現(xiàn)性均能滿足要求。測(cè)得蘆丁的含量為98.05%，可以代替對(duì)照品測(cè)定物質(zhì)的含量和滿足其它特殊需要的試劑。3.2在蘆丁的提取工藝中，由于用的是酸提堿沉法，所以參加的石灰水的量和濃鹽酸的量是本試驗(yàn)的關(guān)鍵，當(dāng)pH為10時(shí)，產(chǎn)品質(zhì)量為1.5g，當(dāng)pH為9時(shí)，產(chǎn)品質(zhì)量為2.3g，當(dāng)pH為8時(shí)，產(chǎn)品質(zhì)量為1.97g，

13、當(dāng)pH為7時(shí)，產(chǎn)品質(zhì)量為1.10g。3.3經(jīng)鑒定精致的蘆丁中含有少量槲皮素，再用葡聚糖凝膠柱進(jìn)一步純化。葡聚糖凝膠對(duì)別離黃酮類化合物效果很好，此方法即簡(jiǎn)便，又合適實(shí)驗(yàn)室操作。實(shí)驗(yàn)產(chǎn)品純度高，含量達(dá)98.05%，可代替蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)定蘆丁制劑中的蘆丁含量。3.4實(shí)驗(yàn)中筆者發(fā)現(xiàn)蘆丁極易被氧化變色，要注意避光枯燥保存。3.5選擇沸水溶液提取以破壞酶，而且在槐米中果膠和黏液質(zhì)較多。提取液通常因含有大量黏稠的雜質(zhì)而難以過濾，所以本文直接用水加石灰乳提取蘆丁，方法更加有效，但應(yīng)注意加硼砂以保護(hù)臨二酚羥基，而且整個(gè)過程對(duì)酸度控制要求較高。3.6柱溫對(duì)含量測(cè)定的影響較小，隨著柱溫的增加，保存時(shí)間有所縮短，峰的擴(kuò)散有所改善，但對(duì)含量測(cè)定影響較?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1Patriz,R.etti,etal.,PreventinfDiabetesfInreasedAgingEffetnRatllagen-IinredFlureesenebyAinguanidneandRudin