各級醫(yī)療衛(wèi)生機構醫(yī)院霍亂診斷標準

1、 霍亂診斷標準范圍本標準規(guī)定了霍亂的診斷依據(jù)、診斷原則和鑒別診斷。本標準適用于全國各級各類醫(yī)療衛(wèi)生機構及其工作人員對霍亂病例及帶菌者的診斷、報告。術語和定義下列術語和定義適用于本標準。腹瀉 diarrhea指在24h內(nèi)排便3次或以上（或者排泄次數(shù)比個體正常情況下增多），且出現(xiàn)稀便、水樣便等（非血便）糞便性狀改變的一種臨床癥狀?；魜y cholera指由產(chǎn)霍亂腸毒素（cholera toxin， CT）的O1群或O139群霍亂弧菌（產(chǎn)毒株）經(jīng)腸道感染引起的急性傳染性腹瀉病。霍亂流行區(qū) cholera-endemic area指在最近三年內(nèi)發(fā)生本地傳播霍亂確診病例或外環(huán)境中存在O1群或O139群霍亂

2、弧菌產(chǎn)毒株的地區(qū)。診斷依據(jù)流行病學史生活在霍亂流行區(qū)、或發(fā)病前5d內(nèi)到過霍亂流行區(qū)或發(fā)病前5d內(nèi)有可疑不潔飲水或飲食史。發(fā)病前5d內(nèi)與霍亂病例或帶菌者有共同暴露史或密切接觸史。臨床表現(xiàn)潛伏期為數(shù)小時至5d，通常23d。臨床表現(xiàn)分型包括：輕型病例癥狀不明顯，起病較緩，大多數(shù)患者僅有輕度腹瀉，極少數(shù)伴有嘔吐，大便次數(shù)每日一般不超過10次，大便性狀為軟便、稀便或黃水樣便，一般無發(fā)熱、腹痛、里急后重。少數(shù)病例有腹部隱痛或飽脹感，個別有發(fā)熱（多見于兒童，但罕有高熱）及腹部陣發(fā)性絞痛。無明顯脫水、或有輕度脫水表現(xiàn)。中、重型病例起病急，腹瀉次數(shù)頻繁或劇烈，糞便性狀為“米泔水”樣或水樣，常伴有嘔吐，迅速出現(xiàn)脫

3、水或嚴重脫水、嚴重低鈉血癥引起的肌肉痙攣（特別是腓腸?。┘把h(huán)衰竭等休克表現(xiàn)。中毒型病例是一種特殊而罕見的類型（干性霍亂），起病后迅速進入休克狀態(tài)，無瀉吐或瀉吐癥狀較輕，無脫水或僅輕度脫水，但有嚴重感染性休克表現(xiàn)。實驗室檢測患者糞便、嘔吐物或肛拭子經(jīng)細菌培養(yǎng)分離到O1群或O139群霍亂弧菌產(chǎn)毒株，操作方法見附錄A。患者日常生活用品或家居環(huán)境中檢出O1群或O139群霍亂弧菌產(chǎn)毒株，操作方法見附錄A?；颊呒S便、嘔吐物或肛拭子標本霍亂弧菌快速輔助檢測試驗陽性，操作方法見附錄B?；颊呒S便、嘔吐物或肛拭子標本CT毒素基因特異性核酸檢測陽性，操作方法見附錄B?；颊呒S便、嘔吐物或肛拭子標本O1群或O139群

4、霍亂弧菌脂多糖特異性基因核酸檢測陽性，操作方法見附錄B。患者糞便、嘔吐物或肛拭子標本霍亂弧菌種特異性基因核酸檢測陽性，操作方法見附錄B。診斷原則依據(jù)患者的流行病學史、臨床表現(xiàn)及實驗室檢測結果進行綜合判斷。診斷標準帶菌者無3. 2中任一項，但具備3. 3. 1者。疑似病例具備3. 1中任一項，并同時具備3. 2中任一項。具備3. 2中任一項，并同時具備3. 3. 3者。具備3. 2中任一項，糞便、嘔吐物或肛拭子標本分離到O1群或O139群霍亂弧菌但未進行CT毒素基因檢測者。臨床診斷病例疑似病例具備3. 3. 2或同時具備3. 3. 4及3. 3. 5者。在一起確認的霍亂暴發(fā)疫情中，密切接觸者或共

5、同暴露者具備3. 2中任一項者。確診病例具備3. 2中任一項，并同時具備3. 3. 1者。具備3. 2中任一項，并同時具備3. 3. 4、3. 3. 5和3. 3.6者。糞便培養(yǎng)檢出O1群或（和）O139群霍亂弧菌產(chǎn)毒株前5d內(nèi)有腹瀉癥狀者。鑒別診斷霍亂應與其他病原微生物引起的腹瀉相鑒別，主要鑒別診斷包括：副溶血弧菌性腸炎、大腸桿菌性腸炎、沙門菌性腸炎、空腸彎曲菌性腸炎、病毒性胃腸炎和急性細菌性痢疾等（參見附錄C）。（規(guī)范性附錄）霍亂弧菌的分離與鑒定標本的收集患者的糞便、嘔吐物或（和）肛拭子為必取標本。水樣便或嘔吐物采樣量一般為13 ml，成形便采取指甲大小的糞量；肛拭子可用直腸棉拭或采便管由

6、肛門插入直腸內(nèi)35 cm（幼兒約23 cm）處旋轉后取出，以看到棉拭子上沾有糞便為佳。標本的送檢采得的樣本應立即接種于培養(yǎng)基，不能立即接種的，應放入pH 8.49.2的堿性蛋白胨水或文臘二氏保存液或插入Cary-Blair半固體保存培養(yǎng)基中，于冷藏箱內(nèi)保存、送檢。糞便或嘔吐物等標本與運送培養(yǎng)基或增菌液的比例約為1:10，肛拭子應插入5 ml運送培養(yǎng)基或增菌液中。分離培養(yǎng)增菌后分離培養(yǎng)：標本接種于pH8.49.2的堿性蛋白胨水（初次分離提倡使用pH8.48.6）置37增菌68h后，從菌膜下表層取一接種環(huán)培養(yǎng)物，劃線接種于強、弱選擇性平板各一個，置37培養(yǎng)1824h。必要時可取0.1ml一次增菌液

7、于5ml的pH8.49.2的堿性蛋白胨水進行二次增菌培養(yǎng)后再劃線接種強、弱選擇性平板。也可選用分離效果較好的弧菌顯色瓊脂。直接分離培養(yǎng)：對急性期患者水樣便標本在進行增菌培養(yǎng)的同時可取一接種環(huán)或用肛拭子直接接種強、弱選擇性平板各一個置37培養(yǎng)1824h。選擇性培養(yǎng)基：常用強選擇性培養(yǎng)基包括慶大霉素瓊脂、TCBS瓊脂和四號瓊脂等。弱選擇性培養(yǎng)基一般使用堿性營養(yǎng)瓊脂等。霍亂弧菌菌落特征堿性營養(yǎng)瓊脂：霍亂弧菌在堿性營養(yǎng)瓊脂上生長的菌落呈現(xiàn)為無色、圓形、透明或半透明、表面光滑、潤濕、扁平或稍凸起、邊緣整齊，菌落直徑一般約為2mm。慶大霉素瓊脂和四號瓊脂：菌落特征與堿性營養(yǎng)瓊脂上生長的菌落相似，但透明性略

8、差，多呈半透明狀，由于這類培養(yǎng)基均含有亞碲酸鹽成分，菌落中央常呈灰色或灰黑色，并隨培養(yǎng)時間的XX而加深。TCBS瓊脂：菌落生長呈黃色發(fā)亮、表面光滑、潤濕、稍凸起、邊緣整齊。弧菌顯色瓊脂：霍亂弧菌在不同品牌弧菌顯色瓊脂上的菌落顏色不同，具體參考廠家說明。菌株鑒定菌株初篩包括玻片凝集試驗、氧化酶試驗和產(chǎn)毒與否檢測。玻片凝集試驗從選擇性平板上挑取疑似菌落接種于普通營養(yǎng)瓊脂純培養(yǎng)（37 1824h），取純培養(yǎng)物與霍亂弧菌O1群多價血清和O139群血清做玻片凝集，進行O1群和O139群霍亂弧菌的初篩。在1min內(nèi)出現(xiàn)肉眼可見的明顯凝集顆粒，但在生理鹽水中不產(chǎn)生凝集者為陽性，在1min內(nèi)不出現(xiàn)凝集顆粒者判

9、為凝集陰性。O1群菌株需用小川和稻葉血清型特異性的診斷血清做玻片凝集進一步確定血清型別。a）玻片凝集試驗使用的血清效價范圍及結果判定參考廠家說明書。注意事項：堿性營養(yǎng)瓊脂、慶大霉素瓊脂及四號瓊脂上的疑似菌落如足夠大，可直接挑取疑似菌落進行玻片凝集試驗。但TCBS培養(yǎng)基上的疑似菌落常因培養(yǎng)基中蔗糖的影響造成難以乳化，不宜直接進行玻片凝集試驗，應挑取可疑菌落，先接種普通瓊脂純培養(yǎng)后再作玻片凝集。b）注意同一標本存在O1群和O139群霍亂弧菌混合感染的可能，每份標本至少挑選5個以上的疑似菌落逐一進行鑒定。氧化酶試驗用鉑金環(huán)或牙簽取生長在普通瓊脂或其它無碳水化合物成份的非選擇性培養(yǎng)基上的新鮮培養(yǎng)物涂抹

10、在清潔的濾紙上，然后滴加1%鹽酸對氨基二甲基苯胺或鹽酸二甲基對苯二胺水溶液或相應商品化試劑，如培養(yǎng)物在l2min內(nèi)岀現(xiàn)粉紅-紫紅-紫藍色，有的最后呈紫黑色，判斷為氧化酶試驗陽性，不顯色判為陰性。產(chǎn)毒株檢測通過檢測CT毒素的編碼基因ctxAB來確認是否為產(chǎn)毒株（詳見附錄B）。菌株保存和上送經(jīng)初篩陽性或可疑陽性的菌株，在發(fā)出初步鑒定報告的同時，應盡快送當?shù)丶膊☆A防控制中心（CDC）進行復核鑒定。復核結果符合O1群或O139群霍亂弧菌產(chǎn)毒株的菌株，按菌株管理的要求進行保存與上送；如復核結果出現(xiàn)疑問，應盡快將菌株上送省級或省級以上CDC（參比實驗室）進行確認分析。菌株復核菌株的復核鑒定應以純培養(yǎng)物為基

11、礎，至少應包括以下項目：血清分型、革蘭染色、粘絲試驗、氧化酶試驗、動力試驗、CT毒素基因檢測（參見附錄B），也可選擇生化鑒定條或全自動微生物生化鑒定系統(tǒng)。玻片凝集反應不典型或者懷疑為彥島型的菌株應增做試管凝集試驗。菌株血清群的鑒定也可用PCR方法擴增O1群和O139血清群脂多糖特異性基因rfb來確定（參見附錄B）?；魜y弧菌系統(tǒng)生化鑒定詳見表A.1部分弧菌科細菌的系統(tǒng)生化鑒定項目霍亂弧菌擬態(tài)弧菌副溶血弧菌創(chuàng)傷弧菌溶藻弧菌河弧菌弗尼斯弧菌海魚弧菌霍利斯弧菌麥氏弧菌辛辛那提弧菌鯊魚弧菌最適生長溫度373737373737372525，363725，3537氧化酶+-+黏絲實驗+/-+/-+/-+硝酸

12、鹽還原+靛基質+/-+/-+V-P試驗+/+/+-+/-尿素酶/+.L-賴氨酸+-+/+L-鳥氨酸+/-+/L-精氨酸+-+/葡萄糖產(chǎn)氣+-/+乳糖-/+/-+/麥芽糖+-+D-甘露醇+/-+-+-+/-蔗糖+/+-+/-L-阿拉伯糖-+-+-+-+-纖維二糖+-/+-/+-水楊素+-明膠素+在不同鹽量胨水中生長試驗0% NaCl+_3% NaCl+6% NaCl+/-+/-+/-+/-+/-+8% NaCl-+-+-+/+/10% NaCl+/O/129敏感性10gSaSRSRRRSRSRR150gSaSSSSSSSSSSSa部分O139群霍亂弧菌為抗性R（資料性附錄）霍亂診斷的相關實驗技術

13、霍亂弧菌靶標基因特異性核酸PCR檢測CT毒素是霍亂弧菌的主要致病因子，對其編碼基因ctxAB的檢測可用于對霍亂弧菌產(chǎn)毒株的確認。菌株血清群的檢測也可用PCR方法擴增O1群和O139群霍亂弧菌脂多糖特異性基因rfb來確定。種特異性基因位點的PCR擴增也可納入霍亂弧菌的檢測鑒定中。這些方法需要在符合PCR檢測要求的實驗室中進行，其中實時熒光PCR方法較普通PCR操作更簡便，可盡可能避免交叉污染。樣品核酸制備糞便、嘔吐物或肛拭子標本用核酸提取試劑盒提取糞便、嘔吐物或肛拭子標本中的細菌核酸作為PCR檢測模板，標本前處理和核酸提取操作方法參照相應試劑盒說明書。疑似菌落挑取慶大霉素等選擇性瓊脂或普通營養(yǎng)瓊

14、脂等平板上的12個可疑菌落，以1 ml生理鹽水稀釋后，用核酸提取試劑盒提取DNA作為PCR檢測模板。另一個替代方法是將12個可疑菌落于200l純水中煮沸10min，冰浴5min，10，00012，000 rpm 4離心5min，取23l上清液作為檢測模板。堿性蛋白胨水增菌培養(yǎng)液從增菌培養(yǎng)液液體表面菌膜下緣處取12ml的培養(yǎng)液，10，00012，000 rpm 離心3min，棄上清，沉淀用1ml純水重懸，用核酸提取試劑盒提取DNA作為PCR檢測模板。另一個替代方法是沉淀用1ml純水重懸、再離心、洗滌兩次后，加100200l純水重懸煮沸10min，冰浴5min，10，00012，000 rpm 4

15、離心5min，取上清液作為檢測的模板。普通PCR檢測CT毒素基因檢測檢測CT毒素基因ctxAB的參照引物序列見表B. 1，擴增參數(shù)：預變性94 5min；94 30s，60 30s，72 30s，30個循環(huán)；最后72延伸7min。O1/O139群霍亂弧菌脂多糖特異性rfb基因檢測擴增O1/O139群霍亂弧菌脂多糖特異性rfb基因的參照引物序列見表B.1，擴增參數(shù)：預變性94 5min；94 30s，55 30s，72 45s，30個循環(huán)；最后72延伸5min?；魜y弧菌種特異性hlyA基因檢測擴增霍亂弧菌種特異性hlyA基因序列的參照引物序列見表B. 1，擴增參數(shù)：預變性94 5min；94 3

16、0s，55 30s，72 45s，30個循環(huán)；最后72延伸5min?；魜y弧菌普通PCR檢測參照引物檢測基因引物核苷酸序列（5-3）產(chǎn)物大小（bp）ctxAB毒素基因ctxA-P1CTCAGACGGGATTTGTTAGGCACG302ctxA-P2TCTATCTCTGTAGCCCCTATTACGO1群rfb基因O1rfb-P1GTTTCACTGAACAGATGGG192O1rfb-P2GGTCATCTGTAAGTACAACO139群rfb基因O139rfb-P1AGCCTCTTTATTACGGGTGG449O139rfb-P2GTCAAACCCGATCGTAAAGGhlyA基因hlyA-P1GC

17、AAACAGCGAAACAAATACC497hlyA-P2TCCACCCCACCAGTCACC實時熒光PCR檢測可考慮選擇使用商業(yè)化的實時熒光PCR檢測試劑盒，也可以參考B. 1. 3. 2中推薦序列實驗室合成引物探針檢測。商品化試劑盒選擇使用經(jīng)國家食品藥品監(jiān)督管理機構批準的商品化實時熒光PCR檢測試劑盒。CT毒素基因、O1/O139群脂多糖特異性rfb基因和種特異性ompW基因實時熒光PCR檢測霍亂弧菌CT毒素基因ctxAB、O1/O139血清群脂多糖特異性rfb基因和種特異性ompW基因的TaqMan實時熒光PCR檢測參照引物和探針序列見表B. 2。擴增循環(huán)條件為：95 30s；95 5s

18、，60 20s，循環(huán)40次，在退火階段檢測熒光。O1群和O139群特異性rfb基因可用作雙重檢測。表B. 2 霍亂弧菌實時熒光PCR檢測參照引物和探針序列檢測基因引物和探針核苷酸序列（5-3）ctxAB毒素基因ctx-FCTTCCCTCCAAGCTCTATGCTCctx-RTACATCGTAATAGGGGCTACAGAGctx-PFAM-ACCTGCCAATCCATAACCATCTGCTGCTG-BHQ1O1群rfb基因O1rfb-FGGAATAACTCAAGGCGATGAAGTGO1rfb-RTAGAGACTCACCTTCGATTTCAGCO1rfb-PFAM-AAACGGGTAACGCAC

19、CACACTGGACT-BHQ1O139群rfb基因O139rfb-FCGATGGCGTGTTCATTAGAAGGO139rfb-RTCCCTTTCCACCTCGGTATTTCO139rfb-PHEX-CGGCAAACTGGCAGCAAACTCAGCA-BHQ1ompW基因ompW-FTTGCTGCTAACGTTGGCTTTGompW-RCTGCTTTGTAGGTTGCCGTTGompW-PFAM-TGCTCAATGATAGCTGGTTCCTCAACGC-BHQ1霍亂弧菌快速輔助檢測膠體金免疫層析法目前可使用的霍亂弧菌膠體金快速免疫層析檢測條較多，該方法主要針對檢測O1群和O139群霍亂弧菌抗

20、原成分，操作簡單。此類方法的檢岀限為105個菌/ml，因此在輕型病例及帶菌者調(diào)查中存在漏檢的可能，需要進行增菌培養(yǎng)后檢測，以提高檢出率?；魜y弧菌動力-制動試驗在玻片的兩側各加一滴急性期病人的水樣便，直接鏡檢（推薦使用暗視野或相差顯微鏡）。觀察視野內(nèi)是否有快速穿梭運動的細菌，若有即為動力試驗陽性，否則為陰性。動力陽性的標本需進行下列實驗：分別加入12滴霍亂弧菌O1群或O139群特異性診斷血清，鏡檢若細菌運動停止，凝集成塊，即制動試驗陽性，否則為陰性。用于霍亂弧菌感染診斷時，需以制動試驗結果進行判斷。這種特殊動力-制動試驗，可在幾分鐘之內(nèi)輔助做出初步診斷。注意特異免疫診斷血清使用不加防腐劑的，使用

21、的血清效價范圍參考廠家說明書。（資料性附錄）霍亂的鑒別診斷副溶血弧菌性腸炎多數(shù)起病急驟，有進食海（水）產(chǎn)品和（或）不潔食物史，潛伏期2h 4d，常先吐后瀉，常為水樣或類似痢疾樣膿血便，個別重型患者大便可有清水樣或洗肉水樣，排便前有腸鳴音，伴陣發(fā)性腹部劇痛。早期常有發(fā)熱和其他中毒癥狀。大便培養(yǎng)檢出副溶血弧菌。大腸桿菌性腸炎腸產(chǎn)毒性大腸桿菌（ETEC）性腸炎：潛伏期424h，有發(fā)熱、惡心嘔吐及腹部絞痛，腹瀉呈黃水或清水樣便，無膿血便，嚴重腹瀉者亦可產(chǎn)生重度脫水，嬰幼患兒常因此而危及生命。腸致病性大腸桿菌（EPEC）性腸炎：主要癥狀為腹瀉，大便為黃色和黃綠色蛋花樣稀水便，量較多，常有特殊腥臭味，重癥者可有脫水等全身癥狀。以上兩者糞便培養(yǎng)均可獲得相應的大腸桿菌。沙門菌性腸炎由非傷寒沙門菌感染引起的以腹瀉為主的腸道感染，人群普遍易感，嬰幼兒（尤其1歲以內(nèi)）更為易感。全年均可發(fā)病，夏秋季常見。潛伏期多為624h，急性起病，伴惡心、嘔吐、腹痛、腹瀉、發(fā)熱或不伴發(fā)熱。新生兒病情尤為嚴重，較易發(fā)生脫水和電解質紊亂。嬰幼兒糞便多為黃色或綠色稀水便，亦可帶有粘液和鮮血，大便培養(yǎng)可獲得非傷寒沙門菌，常見的感染血清型有鼠傷寒沙門菌、腸炎沙門菌等?？漳c彎曲菌性腸炎本菌