植物基因工程

1、第六章植植物基因因工程課程基因工程程原理與與技術(shù)班級生物科學(xué)學(xué)05生物技術(shù)術(shù)05教師詹亞光范桂枝學(xué)期第二學(xué)期期課時6學(xué)時上課日期期課的類型型理論授課章節(jié)節(jié)第六章 植物基基因工程程（1）植植物基因因轉(zhuǎn)化受受體系統(tǒng)統(tǒng)的條件件（2）植植物基因因轉(zhuǎn)化受受體系統(tǒng)統(tǒng)的類型型和特性性。（3）植植物基因因工程載載體的種種類和特特性（4）根根癌農(nóng)桿桿菌Tii質(zhì)粒的的結(jié)構(gòu)與與功能：T-DDNA、Virr區(qū)操縱縱子的基基因結(jié)構(gòu)構(gòu)與功能能。（5）農(nóng)農(nóng)桿菌TTi質(zhì)粒?；蜣D(zhuǎn)轉(zhuǎn)化機(jī)理理（6）農(nóng)農(nóng)桿菌TTi質(zhì)粒粒的改造造及載體體構(gòu)建（7）載載體構(gòu)建建中常用用的選擇擇標(biāo)記及及報告基基因（8）根根癌農(nóng)桿桿菌的轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化程序序及操作

2、作原理（9）外外源基因因在植物物中的表表達(dá)教學(xué)目的的和要求求了解植物物基因轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化受體體系統(tǒng)的的類型、特性掌掌握Tii質(zhì)粒的的結(jié)構(gòu)與與功能，植物載載體構(gòu)建建原理，植物基基因工程程常用的的載體類類型。教材分析析重點根癌農(nóng)桿桿菌Tii質(zhì)粒介介導(dǎo)的基基因轉(zhuǎn)化化的原理理和方法法難點植物載體體構(gòu)建原原理關(guān)鍵點轉(zhuǎn)基因植植物的獲獲取和檢檢測主要教具具和設(shè)備備材料投影儀、電腦、常規(guī)教教學(xué)設(shè)備備 教法板書與多多媒體授授課相結(jié)結(jié)合思考題1. 植植物基因因工程載載體種類類？2. 根根癌農(nóng)桿桿菌轉(zhuǎn)化化程序？心得在自然界界的許多多雙子葉葉植物中中，常常常發(fā)生一一種嚴(yán)重重危害植植物生長長的病害害冠癭癭。已知知90多科科，6

3、000多種種雙子葉葉植物都都能感染染這種病病。一般般認(rèn)為單單子葉植植物和裸裸子植物物對此病病不敏感感。700年代中中期，世世界上幾幾個實驗驗室發(fā)現(xiàn)現(xiàn)誘發(fā)腫腫瘤的根根癌農(nóng)桿桿菌中含含有大量量的誘瘤瘤質(zhì)粒TTi(ttumoor-iinduucinng pplassmidd),且且證實了了腫瘤的的形成正正是由于于pTii中的特特定片段段TT-DNNA轉(zhuǎn)移移并穩(wěn)定定地整合合進(jìn)植物物細(xì)胞核核基因組組中的結(jié)結(jié)果；由由于其上上載著的的冠癭堿堿合成基基因和激激素合成成基因表表達(dá)，因因此分泌泌冠癭堿堿并形成成腫瘤。人們就就把這種種冠癭的的形成過過程稱作作天然的的植物細(xì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化化系統(tǒng)。農(nóng)桿菌將將自身的的DNAA插

4、入植植物細(xì)胞胞誘發(fā)腫腫瘤只對對其本身身是有益益的，重重要原因因之一是是因為農(nóng)農(nóng)桿菌誘誘發(fā)植物物細(xì)胞合合成冠癭癭堿為自自己提供供食物。植物自自身不能能利用這這種物質(zhì)質(zhì)，只能能為它的的合成付付出代價價，別的的細(xì)菌也也不能利利用它，在自然然條件下下，只有有農(nóng)桿菌菌能分泌泌分解冠冠癭堿的的酶，將將這些特特異產(chǎn)物物作為唯唯一的碳碳源和氮氮源來利利用。腫瘤的產(chǎn)產(chǎn)生是由由于T-DNAA上的激激素合成成基因所所致，刺刺激細(xì)胞胞生長而而產(chǎn)生腫腫瘤，這這是T-DNAA轉(zhuǎn)入的的一個副副產(chǎn)品。Ti質(zhì)粒粒給自己己設(shè)計出出一套為為其自身身存活的的非常優(yōu)優(yōu)秀的進(jìn)進(jìn)化格局局：它感感染植物物細(xì)胞，使之出出現(xiàn)愈傷傷組織增增生，后

5、后者便產(chǎn)產(chǎn)生出供供帶有TTi質(zhì)粒粒的細(xì)菌菌用作能能源、碳碳源和氮氮源的冠冠癭堿；而冠癭癭堿的產(chǎn)產(chǎn)生又可可激發(fā)TTi質(zhì)粒粒轉(zhuǎn)移到到原先沒沒有存在在這種質(zhì)質(zhì)粒的土土壤農(nóng)桿桿菌中去去，如此此周而復(fù)復(fù)始得到到不斷發(fā)發(fā)展。Ti質(zhì)粒粒是一類類理想的的植物基基因工程程載體，通過它它們可以以將外源源DNAA轉(zhuǎn)移到到植物細(xì)細(xì)胞，并并再生出出能夠表表達(dá)外源源基因的的轉(zhuǎn)基因因植物。Ti質(zhì)粒粒還具有有若干其其他載體體所不具具備的優(yōu)優(yōu)點：（1）T-DDNA能能夠進(jìn)行行高頻的的轉(zhuǎn)移，而且這這種轉(zhuǎn)移移的DNNA通常常是以未未發(fā)生變變化的完完整形式式整合到到植物的的核基因因組上。（2）Ti質(zhì)粒粒不存在在包裝限限制問題題，大到

6、到50kkb的外外源DNNA也能能順利地地包裝與與轉(zhuǎn)移。一、植物物基因工工程載體體種類據(jù)載體的的功能和和構(gòu)建過過程，可可把有關(guān)關(guān)載體分分為四大大類型（九種載載體）?？寺≥d體體、中間間載體、卸甲載載體、轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化載體體據(jù)載體的的功能和和構(gòu)建過過程，可可把有關(guān)關(guān)載體分分為四大大類型，九種載載體。1、克隆隆載體（目的基基因的克克隆載體體）通常由多多拷貝的的E.ccolii小質(zhì)粒粒為載體體功能：保保存和克克隆目的的基因。2、中間間載體又又分為中中間克隆隆載體和和中間表表達(dá)載體體。中間克隆隆載體：由大腸腸桿菌質(zhì)質(zhì)粒插入入T-DDNA片片段及目目的基因因、標(biāo)記記基因等等構(gòu)建而而成。功能：構(gòu)構(gòu)建中間間表達(dá)載載體

7、的基基礎(chǔ)。分為：中中間粘粒粒載體、質(zhì)粒粘粘粒愈合合載體、基因標(biāo)標(biāo)記載體體。中間表達(dá)達(dá)載體：含有植植物特異異啟動子子的中間間載體功能：作作為構(gòu)建建轉(zhuǎn)化載載體的質(zhì)質(zhì)粒。3、卸甲甲載體解除武裝裝的Tii質(zhì)粒或或Ri質(zhì)粒粒。（oonc+ - oncc-）功能：作作為轉(zhuǎn)化化載體的的受體質(zhì)質(zhì)粒4、轉(zhuǎn)化化載體最后用于于目的基基因?qū)肴胫参锛?xì)細(xì)胞的載載體，亦亦稱工程程載體。它是由中中間表達(dá)達(dá)載體和和卸甲載載體構(gòu)建建而成。分為一元元載體系系統(tǒng)（順順式載體體）和雙雙元轉(zhuǎn)化化載體系系統(tǒng)（反反式載體體）。一元載體體系統(tǒng)包包括共整整合載體體和拼接接末端載載體（SSEV）。二、根癌癌農(nóng)桿菌菌Ti質(zhì)粒粒1、Tii質(zhì)粒的的類

8、型、結(jié)構(gòu)與與功能（1）類類型Ti質(zhì)粒粒是根癌癌農(nóng)桿菌菌染色體體以外的的遺傳物物質(zhì)，為為雙股共共價閉合合的環(huán)狀狀DNAA分子，分子量量為9551556 xx 1106DD，約1550 2000 KKb長。根據(jù)其其誘導(dǎo)的的冠癭堿堿種類不不同，TTi質(zhì)粒粒可分為為三類：章魚堿型型（occtoppinee）：pTTiAcch5, pTTiA66NC, pTTiB6653, pTTiAgg1622胭脂堿型型（noopallinee）：pTTiT337, pTTiT338, pTTiC558農(nóng)桿堿型型（aggroppinee）和農(nóng)農(nóng)桿堿素素型（aagroocinnopiine）或琥珀珀堿型（succcin

9、namoopinne）（2）結(jié)結(jié)構(gòu)和功功能各種Tii質(zhì)粒都都可分為為四個區(qū)區(qū)：T-DDNA區(qū)區(qū)（trranssferrredd-DNNA rregiionss）：是是農(nóng)桿菌菌侵染植植物細(xì)胞胞時，從從Ti質(zhì)粒粒上切割割下來轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移到植植物細(xì)胞胞的一段段DNAA。該DNNA片段段上的基基因與腫腫瘤的形形成有關(guān)關(guān)。Virr區(qū)（Viirullencce rregiion）：該區(qū)區(qū)段上的的基因能能激活TT-DNNA轉(zhuǎn)移移，使農(nóng)農(nóng)桿菌表表現(xiàn)出毒毒性，故故稱之為為毒性區(qū)區(qū)。T-DNAA區(qū)與viir區(qū)在在質(zhì)粒上上彼此相相鄰，合合起來約約占Tii質(zhì)粒DNNA的1/33。Conn區(qū)（reegioon oof rre

10、pllicaatioon）：質(zhì)粒結(jié)結(jié)合轉(zhuǎn)移移位點編編碼區(qū)，該區(qū)段段上存在在著與細(xì)細(xì)菌間接接合轉(zhuǎn)移移的有關(guān)關(guān)基因（traa），調(diào)調(diào)控Tii質(zhì)粒在在農(nóng)桿菌菌之間的的轉(zhuǎn)移。冠癭堿堿能激活活traa基因，誘導(dǎo)TTi質(zhì)粒粒轉(zhuǎn)移，因此，稱之為為接合轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移編碼碼區(qū)。Orii區(qū)（orrigiin of reepliicattionn）：該該區(qū)段基基因調(diào)控控Ti質(zhì)粒粒的自我我復(fù)制，稱之為為復(fù)制起起始區(qū)。3種成分分與Tii質(zhì)粒腫腫瘤誘導(dǎo)導(dǎo)有關(guān):T-DNNA：它它可轉(zhuǎn)移移至宿主主細(xì)胞，是一種種可移動動因子。毒性區(qū)：virr基因可可產(chǎn)生轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移活動動蛋白，對增強(qiáng)強(qiáng)植物細(xì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化是必必須的。土壤農(nóng)癌癌桿菌染染色體基基

11、因:間接參參與轉(zhuǎn)化化，負(fù)責(zé)責(zé)將細(xì)菌菌細(xì)胞接接合于植植物上。2、T-DNAA的基因因結(jié)構(gòu)和和功能（1）TT-DNNA的結(jié)結(jié)構(gòu)特點點長約233Kb在T-DDNA的的5和3端都都有真核核表達(dá)信信號，如如TATTAboox，AATTAAbbox及及pollyA等等。T-DNNA的兩兩端左右右邊界各各為255bp的的重復(fù)序序列，即即邊界序序列，分分別稱之之為左邊邊界（BBL或TL）和和右邊界界（BRR或TR）。該255bp邊邊界序列列屬保守守序列（TGAACACCGATTATAAT TTGGCCGGGGTAAAAC）。通常常右邊界界序列更更為保守守，左邊邊界在某某些情況況下有所所變化。左邊界界的缺失失突

12、變?nèi)匀阅苤铝隽?，但右右邊界缺缺失則不不致瘤，這時幾幾乎完全全沒有TT-DNNA的轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移，這這說明右右邊界在在T-DDNA的的轉(zhuǎn)移中中的重要要性。胭脂堿型型腫瘤，為一連連續(xù)的一一段序列列，長約約23.4Kbb，有腫腫瘤系，僅一個個拷貝，有的TT-DNNA是多多拷貝的的。章魚堿型型腫瘤：T-DDNA分分左右兩兩部分（TL-DNAA和TR-DNAA），各各自帶有有左右邊邊界序列列。左區(qū)區(qū)的順序序變化不不大，長長度約113Kbb，通常常一個拷拷貝，但但也有幾幾個拷貝貝首尾相相連排列列。含章章魚堿合合成酶基基因和致致瘤基因因。TRR-DNNA較短短，長約約6-77Kb，拷貝數(shù)數(shù)達(dá)數(shù)個個或數(shù)十十個，有有的

13、腫瘤瘤系中沒沒有TRR-DNNA。TR-DNAA編碼5個基因因，如甘甘露堿和和冠癭堿堿合成酶酶基因。（2）TT-DNNA上的的編碼基基因及功功能章魚堿型型和胭脂脂堿型TT-DNNA的轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄有下下述共同同特點：T-DNNA的兩兩條鏈都都是有意意義鏈；T-DNNA上每每個基因因都有各各自的啟啟動子；基因的轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄由植植物細(xì)胞胞RNAA聚合酶酶II完成成；T-DNNA具典典型的真真核生物物RNAA合成起起始和終終止的調(diào)調(diào)節(jié)信號號，在其其5端轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄起始始處有TTATAA和CAAAT盒。另外，至少在在5個T-DDNA基基因中發(fā)發(fā)現(xiàn)有一一個8bbp的相相同順序序（TTTTCAAA GGA），同時AAATAA

14、AA加加尾信號號也在同同一條鏈鏈上發(fā)現(xiàn)現(xiàn)。植物或農(nóng)農(nóng)桿菌中中可能有有甲基化化或去甲甲基化的的調(diào)節(jié)基基因活性性。3、Viir區(qū)操操縱子的的基因結(jié)結(jié)構(gòu)與功功能毒性區(qū)的的大多數(shù)數(shù)基因產(chǎn)產(chǎn)物都控控制T-DNAA的轉(zhuǎn)移移，這個個區(qū)域的的突變往往往導(dǎo)致致農(nóng)桿菌菌感染植植物能力力的下降降。（1）VVir區(qū)區(qū)操縱子子的基因因結(jié)構(gòu)章魚堿型型Ti質(zhì)粒粒：Viir區(qū)大大小為440kbb，含有有VirrA、B、C、D、E、F、G、H（PinnF）等等8個操縱縱子，共共24個基基因。大大多數(shù)操操縱子含含有多個個基因VVirAA（1）、ViirB（11）、VirrC（2）、ViirD（4）VirrE（2）、ViirF（1

15、）、ViirH（2）。胭脂堿型型Ti：有有7個操縱縱子，少少一個VVirFF，它們們的第一一個操縱縱子也不不同，章章魚堿型型Ti是VirrH，而而胭脂堿堿型Tii是Tzss，其功功能也不不同。Vir區(qū)區(qū)基因的的表達(dá)有有兩種方方式：組成型表表達(dá)；在在無植物物誘導(dǎo)分分子存在在下依然然保持一一定的表表達(dá)水平平，viirA，virrG、virrH誘導(dǎo)型表表達(dá)：這這些基因因的表達(dá)達(dá)必須在在土壤農(nóng)農(nóng)桿菌感感染植物物時，在在植物受受傷組織織分泌的的信號分分子作用用下才能能啟動表表達(dá)，如如virrB、C、D、EvirGG雖屬于于組成型型表達(dá)，但有植植物信號號分子存存在下表表達(dá)量提提高100倍，也也具誘導(dǎo)導(dǎo)表達(dá)

16、特特性。（2）VVir區(qū)區(qū)操縱子子的基因因的功能能Virr A單單個基因因，2.4kbb，僅編編碼一條條多肽。Virr A編編碼一種種結(jié)合在在膜上的的化學(xué)受受體蛋白白（922KD），可直直接對植植物產(chǎn)生生的酚類類化合物物感應(yīng)，是一種種感應(yīng)蛋蛋白。Vir A的活活化：當(dāng)當(dāng)AS與Virr A的的受體部部分結(jié)合合后，會會使整個個Virr A蛋蛋白構(gòu)象象發(fā)生變變化，其其C端活化化。Viir AA蛋白的的胞質(zhì)區(qū)區(qū)有自激激酶的功功能，可可在保守守的組氨氨酸殘基基上磷酸酸化，從從而Viir AA蛋白被被激活。激活后后的Viir AA具有轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移其磷磷酸基至至Virr G蛋蛋白的一一個宿存存的天冬冬氨酸殘殘基的

17、能能力，使使Virr G蛋蛋白激活活。Virr GVVir G ，只有11Kb，單基因因，編碼碼DNAA結(jié)合蛋蛋白,其C端有DNNA結(jié)合合活性，N端具有有磷酸化化的酸性性結(jié)構(gòu)。從總體效效應(yīng)講，Virr G基基因是屬屬于組成成型表達(dá)達(dá)的，這這對于細(xì)細(xì)菌迅速速地將外外部環(huán)境境信號傳傳遞到細(xì)細(xì)胞內(nèi)十十分有利利。當(dāng)磷酸化化的A蛋白將將其磷酸酸基轉(zhuǎn)到到Virr G保保守的天天冬氨酸酸殘基上上時，使使Virr G蛋蛋白活化化，活化化Virr G蛋蛋白可以以二體或或多體形形式結(jié)合合到Viir啟動動子的特特定區(qū)，從而成成為其它它Virr 基因因轉(zhuǎn)錄的的激活因因子，打打開Viir BB、C、D、E、H等幾個個基

18、因。Virr A或或G突變后后會減弱弱或完全全失去對對其他VVir 位點活活化的誘誘導(dǎo)，VVirAA及 Viir GG 的這這種調(diào)控控作用被被稱為雙雙因子調(diào)調(diào)控體系系。Vir H、Virr F及及Tzss這些基因因?qū)|(zhì)粒粒是特異異的，在在章魚堿堿型中有有Virr F、Virr H，在胭脂脂堿型中中有Tzzs。 Virr H：對植物物產(chǎn)生的的某些殺殺菌或抑抑菌化合合物起解解毒作用用，從而而使自身身生不受受抑制，可增強(qiáng)強(qiáng)致瘤能能力。Vir F：編編碼一個個23KKD蛋白白，通過過Virr 系統(tǒng)統(tǒng)傳遞到到植物細(xì)細(xì)胞中，對T-DNAA起運輸輸作用。Tzs：大部分分胭脂堿堿型菌株株的Tii質(zhì)粒上上均有T

19、Tzs基基因，轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)運玉米米素合成成酶基因因，在細(xì)細(xì)菌中表表達(dá)后將將玉米素素分泌到到細(xì)胞外外。該細(xì)細(xì)胞分裂裂素被植植物吸收收后，能能促進(jìn)農(nóng)農(nóng)桿菌感感染部位位的植物物組織脫脫分化和和細(xì)胞分分裂，提提高植物物對農(nóng)桿桿菌轉(zhuǎn)化化的感受受性。三、農(nóng)桿桿菌Tii質(zhì)?；蜣D(zhuǎn)化化機(jī)理1. TT-DNNA的加加工及轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移首先在下下鏈255bp重重復(fù)序列列的右邊邊界左起起第3和第4堿基間間剪切，從缺口口的3端開始始合成新新的DNNA鏈，并一直直延伸到到左邊界界第222bp處處。置換換出原來來的下鏈鏈，形成成ssDDNA，即T鏈。VirDD蛋白的的功能：VirrD1及及 ViirD22分別編編碼166KD和和47K

20、KD蛋白白，與TT-DNNA的加加工有關(guān)關(guān)，決定定在邊界界重復(fù)序序列的特特定位點點上形成成切口，產(chǎn)生TT鏈斷裂裂。 VVirDD2蛋白白的功能能：特特異剪切切，并與與T鏈的5端共價價結(jié)合。導(dǎo)向向功能；2.T鏈鏈蛋白復(fù)復(fù)合體的的形成及及VirrE的功功能T鏈必須須橫向跨跨越細(xì)菌菌細(xì)胞膜膜、細(xì)菌菌細(xì)胞壁壁、植物物細(xì)胞壁壁、植物物細(xì)胞膜膜及核膜膜才能整整合進(jìn)植植物基因因組。T鏈以一一種DNNA-蛋蛋白復(fù)合合體（TT復(fù)合體體）的形形式存在在。目前已知知至少兩兩種Viir特異異蛋白即即VirrE2和和VirDD2與T鏈蛋白白復(fù)合體體的形成成有關(guān)。VirEE2的功功能：編編碼sssDNAA結(jié)合蛋蛋白，該該

21、蛋白可可非特異異地一與與任何sssDNNA結(jié)合合，通過過與T鏈非共共價結(jié)合合，ViirE22可包被被T鏈形成成細(xì)長的的核-蛋白絲絲，使sssDNNA抗3和5外切切核酸酶酶和內(nèi)切切核酸酶酶。3、T鏈鏈復(fù)合體體通過細(xì)細(xì)菌細(xì)胞胞膜的轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)運及VVirBB的功能能（1）VVirBB的功能能VirBB啟動子子有111個基因因，大多多數(shù)編碼碼跨膜蛋蛋白或膜膜結(jié)合蛋蛋白，能能在膜上上形成一一種類似似細(xì)菌接接合轉(zhuǎn)移移時從供供體菌轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)至受體體菌所必必須的結(jié)結(jié)構(gòu)接合孔孔或性毛毛。T-DNAA通過這這種孔由由細(xì)菌進(jìn)進(jìn)入植物物細(xì)胞。同時，VirrB也可可能起運運輸和提提供能量量的作用用。按功能，可將VVirBB蛋白分分

22、成五類類：R：在內(nèi)內(nèi)膜上或或內(nèi)膜內(nèi)內(nèi)的某些些蛋白，可能作作為T復(fù)合體體的受體體；A：此類類蛋白可可能作為為能源，作為一一種ATTP酶促促進(jìn)T復(fù)合體體被泵出出細(xì)菌細(xì)細(xì)胞，VVirBB11可可能是這這種A類蛋白白。C：形成成通道的的作用，如：VVirBB4是一一種富集集蛋白，無疏水水區(qū)，無無信號肽肽，可能能在T鏈轉(zhuǎn)運運中起一一種結(jié)構(gòu)構(gòu)作用，形成至至少一部部分特殊殊的通道道結(jié)構(gòu)。S：載體體蛋白，起運載載T 復(fù)合體體穿過通通道的作作用，這這類蛋白白可能與與所有膜膜成分（內(nèi)膜、外膜及及周膜）有關(guān)。P：位于于外膜上上，可能能作為結(jié)結(jié)合植物物細(xì)胞膜膜的一種種受體。（2）TT復(fù)合體體向植物物細(xì)胞核核的轉(zhuǎn)運運V

23、irDD2可能能以一種種極性方方向，將將T復(fù)合體體定向至至核孔，而ViirE22則作為為一種促促進(jìn)因子子，保證證很長的的T復(fù)合體體在進(jìn)入入核孔時時不受干干擾。在T-DDNA轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移過程程中，VVirDD2具有有火車頭頭的作用用，牽制制T復(fù)合體體以5端到3端的方方向向核核遷移，而ViirE22則只助助推器的的角色，幫助未未折疊的的長形TT復(fù)合物物不被打打斷，并并方便其其向核運運動。已知ViirE22-sssDNAA可以抗抗拒內(nèi)切切酶的作作用，如如核酸外外切酶VVII對對VirrE2-ssDDNA降降解能力力將相當(dāng)當(dāng)于對sssDNNA的6%，對對S1核酸酸酶的效效果也相相似。4、細(xì)菌菌染色體體上與T

24、T-DNNA轉(zhuǎn)移移有關(guān)的的基因目前已知知農(nóng)桿菌菌染色體體上有110個基基因與TT-DNNA轉(zhuǎn)移移有關(guān)，它們主主要涉及及細(xì)菌與與植物細(xì)細(xì)胞的接接觸和細(xì)細(xì)菌向植植物傷口口的趨化化性。chvEE編編碼一個個葡萄糖糖和半乳乳糖結(jié)合合蛋白，主要結(jié)結(jié)合組成成植物細(xì)細(xì)胞壁的的單糖；可能由由于識別別植物受受傷產(chǎn)生生的糖單單體，導(dǎo)導(dǎo)致細(xì)菌菌向植物物傷口的的趨化性性；在低低pH值、磷酸饑饑餓條件件下啟動動VirrG表達(dá)達(dá)。chvDD編編碼一種種細(xì)菌AATP結(jié)結(jié)合蛋白白，在低低pH值、磷酸饑饑餓條件件下誘導(dǎo)導(dǎo)VirrG蛋白白含量升升高，然然后ViirA接接受ASS信號，刺激VVirGG轉(zhuǎn)化成成活性形形式，啟啟動其他

25、他VirrG 基基因表達(dá)達(dá)。chvAA 、chvvB、 chhvC與環(huán)環(huán)狀-11，2-葡聚聚糖的合合成和運運輸有關(guān)關(guān)； cchvBB產(chǎn)物催催化合成成葡聚糖糖， cchvAA產(chǎn)物將將多糖從從胞質(zhì)運運到胞外外，影響響農(nóng)桿菌菌對植物物細(xì)胞的的附著能能力。pscAA和Exooc與多糖糖的合成成有關(guān)，并影響響農(nóng)桿菌菌對植物物細(xì)胞的的附著能能力。四、農(nóng)桿桿菌Tii質(zhì)粒的的改造及及載體構(gòu)構(gòu)建1、野生生型Tii質(zhì)粒直直接作為為基因工工程載體體的障礙礙：（1）分分子量大大，16602240KKb；（2）有有各種限限制性內(nèi)內(nèi)切酶的的多個切切點；（3）TT-DNNA區(qū)中中含有許許多編碼碼基因與與基因轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移無關(guān)關(guān)，如

26、致致瘤基因因，其存存在還會會導(dǎo)致植植物體喪喪失形態(tài)態(tài)發(fā)生能能力；（4）TTi質(zhì)粒粒不能在在大腸桿桿菌中復(fù)復(fù)制。2、Tii質(zhì)粒構(gòu)構(gòu)建的幾幾個重要要因素（1）右右邊界序序列；（2）完完整的VVir基基因群；（3）有有獨特的的酶切點點；（4）有有在植物物中可表表達(dá)的選選擇性基基因；（5）有有在細(xì)菌菌中可表表達(dá)的選選擇性基基因；（6）章章魚堿型型農(nóng)桿菌菌品系需需要獨特特的增強(qiáng)強(qiáng)子。3、載體體構(gòu)建先將T-DNAA片段克克隆到大大腸桿菌菌質(zhì)粒中中，并插插入外源源基因，最后通通過三親親交配或或接合轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移把外外源基因因引入農(nóng)農(nóng)桿菌TTi質(zhì)粒粒上。Ti質(zhì)粒粒的載體體系統(tǒng)分分兩類：一元載載體和雙雙元載體體例：雙元

27、元載體的的構(gòu)建雙元載體體系統(tǒng)由由兩個分分別含TT-DNNA和Virr區(qū)的相相容質(zhì)粒粒構(gòu)成。（1）構(gòu)構(gòu)建原理理Ti質(zhì)粒粒上的VVir基基因可以以反式激激活T-DNAA的轉(zhuǎn)移移，T-DNAA和Virr區(qū)處于于不同的的Ti質(zhì)粒粒上同樣樣能起到到轉(zhuǎn)移TT-DNNA的作作用。雙元載體體含有廣廣泛寄主主范圍質(zhì)質(zhì)粒的復(fù)復(fù)制起點點（orriv），從而而代替了了在共整整合載體體中用以以重組的的同源區(qū)區(qū)，它們們能在任任何農(nóng)桿桿菌寄主主里自發(fā)發(fā)復(fù)制。所以寄寄主僅需需一套完完整的vvir質(zhì)質(zhì)粒就可可。主要要的轉(zhuǎn)移移區(qū)載在在小重組組Ti質(zhì)粒粒上。（2）微微型Tii質(zhì)粒（minni-TTi pplassmidd）含有T-

28、DNAA邊界，缺失VVir基基因的質(zhì)質(zhì)粒；含含廣譜質(zhì)質(zhì)粒的復(fù)復(fù)制位點點OriiV及選選擇標(biāo)記記基因。（3）輔輔助質(zhì)粒含Virr區(qū)段的的Ti質(zhì)粒粒，heelpeer TTi,是是T-DDNA缺缺失的突突變型TTi（卸卸甲Tii），提提供Viir基因因功能，反式激激活T-DNAA的轉(zhuǎn)移移。LBA444044中含有有pALL44004(ppTiAAch55的衍生生質(zhì)粒)，野生生型Tii也可做做Hellperr Tii,有更更強(qiáng)的毒毒性。五、根癌癌農(nóng)桿菌菌侵染植植物細(xì)胞胞的機(jī)理理1、根癌癌農(nóng)桿菌菌的生物物學(xué)特性性分類農(nóng)桿菌屬屬，也稱稱土壤桿桿菌屬和和根瘤菌菌屬，是是同屬于于根瘤科科的革蘭蘭氏陰性性菌。

29、土壤桿菌菌屬有44 個種種：根癌癌農(nóng)桿菌菌、放射射形農(nóng)桿桿菌、毛毛根農(nóng)桿桿菌和懸懸鉤子農(nóng)農(nóng)桿菌。根癌農(nóng)桿桿菌，根根據(jù)其誘誘導(dǎo)植物物細(xì)胞產(chǎn)產(chǎn)生的冠冠癭堿種種類不同同可分為為三種類類型即章章魚堿型型、胭脂脂堿型和和農(nóng)桿堿堿型。生活習(xí)性性土壤桿菌菌屬都是是土壤習(xí)習(xí)居菌，主要生生活在曾曾被多種種植物生生活過的的土壤中中，好氧氧，但也也能在低低氧壓的的植物組組織中生生長，最最適溫225330，pH44.012.0,最最適pHH6.009.0。形態(tài)結(jié)構(gòu)構(gòu)農(nóng)桿菌細(xì)細(xì)胞呈桿桿形，00.8xx1.553.0mm,以144根周生生鞭毛運運動，不不形成芽芽孢，菌菌落無色色，隨菌菌齡增加加，光滑滑的菌落落逐漸變變成有

30、條條紋，但但也有許許多菌株株生成的的菌落呈呈粗糙型型。寄主范圍圍根癌農(nóng)桿桿菌廣泛泛存在于于雙子葉葉植物中中，根據(jù)據(jù)不完全全統(tǒng)計，約有993屬6433種雙子子葉植物物對根癌癌農(nóng)桿菌菌敏感。裸子植植物對該該菌同樣樣具敏感感性，能能誘發(fā)腫腫瘤，對對絕大多多數(shù)單子子葉植物物無侵染染能力。2、根癌癌農(nóng)桿菌菌侵染的的誘導(dǎo)信信號及作作用機(jī)理理（1）酚酚類化合合物酚類物質(zhì)質(zhì)農(nóng)桿桿菌浸染染植物細(xì)細(xì)胞所必必需的誘誘導(dǎo)物，同時將將其作為為趨化物物來識別別。實驗證明明，一些些植物中中常見的的酚類化化合物的的混合物物都可激激活Viir區(qū)基基因。如如：兒茶茶酚、沒沒食子酸酸、焦性性沒食子子酸、-羥基基苯甲酸酸、原兒兒茶酸

31、、香草醛醛。Stacchell等在煙煙草葉片片的傷口口誘出液液中確認(rèn)認(rèn)了兩種種主要的的Virr區(qū)基因因誘導(dǎo)物物：乙酰酰丁香酮酮AS和羥羥基乙酰酰丁香酮酮OH-AS。AS效果果最好，0.551.0mmol/L即可可誘導(dǎo)VVir活活化。（2）中中性糖和和酸性糖糖中性糖在在Virr基因誘誘導(dǎo)和致致病毒力力中也起起重要作作用。SShimmodaa等人，在限定定AS誘導(dǎo)導(dǎo)條件下下，發(fā)現(xiàn)現(xiàn)許多中中性糖（L-阿拉拉伯糖、D-木糖糖、D-葡萄糖糖、D-甘露糖糖、D-艾杜糖糖、D-半乳糖糖、D-塔羅糖糖、2-脫氧-DD-葡萄萄糖）都都可增強(qiáng)強(qiáng)一些VVir區(qū)區(qū)基因的的誘導(dǎo)。這些中中性糖是是通過cchvEE和Vir

32、rA起作作用，cchvEE編碼葡葡萄糖和和半乳糖糖結(jié)合蛋蛋白，識識別傷口口產(chǎn)生的的糖單體體，導(dǎo)致致農(nóng)桿菌菌的趨化化作用。酸性多糖糖是組成成植物細(xì)細(xì)胞壁中中果膠質(zhì)質(zhì)的主要要成分。最近的的實驗證證明，酸酸性糖（胡蘿卜卜根提取取物中蒸蒸餾出來來）可改改變農(nóng)桿桿菌基因因的表達(dá)達(dá)。蛋白白質(zhì)標(biāo)記記實驗表表明，至至少有110種蛋蛋白質(zhì)合合成被其其誘導(dǎo)，一種被被阻遏。（3）ppH值5.05.55的低pHH值。誘誘導(dǎo)物對對pH的要要求是.6.0, 在農(nóng)桿桿菌培養(yǎng)養(yǎng)在含有有酚類化化合物（AS）的的培養(yǎng)基基中時，pH55.0 5.8Viir的誘誘導(dǎo)達(dá)到到一個最最高水平平3、根癌癌農(nóng)桿菌菌的侵染染能力及及其特異異性（

33、1）常常用的根根癌農(nóng)桿桿菌胭脂堿型型（Noop）菌菌株：染染色體背背景為CC58，生長快快，不結(jié)結(jié)球，轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化中容容易操作作，常用用的菌株株有C558、pGVV38550、A2008SEE等。章魚堿型型（Occt）菌菌株：染染色體背背景為AAch55，生長長慢，結(jié)結(jié)球，轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化中難難操作，培養(yǎng)后后不易洗洗掉，常常用的菌菌株有LLBA444044,LBBA10010,GV222600,GVV31111SEE,K661等。農(nóng)桿堿型型（Aggr）菌菌株，也也稱琥珀珀堿型（Succ）：染染色體背背景為AA2811或A1336，具具有胭脂脂堿型菌菌株的特特點，以以A1336為染染色體背背景的常常用菌株株是E

34、HHA1001，生生長快，不結(jié)球球，侵染染能力強(qiáng)強(qiáng)，常用用的菌株株有A2281、EHAA1011、EHAA1055等。（2）、根癌農(nóng)農(nóng)桿菌的的侵染能能力差異異根據(jù)侵染染能力大大小將農(nóng)農(nóng)桿菌分分為：廣宿主菌菌株：大大多數(shù)雙雙子葉、若干裸裸子植物物、少量量單子葉葉植物；如：ppTiBB05442、pTiiA6；窄宿主菌菌株：有有限的幾幾種植物物上誘發(fā)發(fā)腫瘤，如pTTiAgg1622,僅能能在葡萄萄的幾個個品種上上誘發(fā)腫腫瘤。不同植物物對農(nóng)桿桿菌侵染染的敏感感性不同同，在轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化中，二者的的選配十十分重要要，要選選農(nóng)桿菌菌與植物物之間有有高侵染染力的配配合。如如：楊樹樹莖，用用C588優(yōu)于LBBA44

35、404；蘋果，6種基因因型比較較，葉：EHAA1011（pEHHA1001）優(yōu)優(yōu)于LBBA44404，C588；莖：A2881優(yōu)于于C588，ACHH5，A3448。農(nóng)桿菌的的染色體體背景對對宿主范范圍同樣樣有著重重要作用用。因為為除Viir區(qū)功功能外，農(nóng)桿菌菌對植物物表面識識別與結(jié)結(jié)合有關(guān)關(guān)的功能能還取決決于農(nóng)桿桿菌染色色體上基基因位點點。農(nóng)桿桿菌所展展示出不不同的生生長速率率、多糖糖產(chǎn)生和和對植物物細(xì)胞的的毒力都都會影響響轉(zhuǎn)化率率和宿主主范圍。六、根癌癌農(nóng)桿菌菌轉(zhuǎn)化程程序及操操作原理理1、根癌癌農(nóng)桿菌菌Ti質(zhì)粒粒轉(zhuǎn)化的的基本程程序選擇適宜宜的培養(yǎng)養(yǎng)基，使使創(chuàng)傷部部位能產(chǎn)產(chǎn)生盡可可能多的的再

36、生植植株。確定供體體植物最最適的培培養(yǎng)條件件。確定最佳佳外植體體類型、大小、部位等等：再生生途徑，愈傷組組織起源源（細(xì)胞胞類型、層次），保證證轉(zhuǎn)化愈愈傷組織織和芽原原基由創(chuàng)創(chuàng)傷部位位的淺層層細(xì)胞發(fā)發(fā)育而來來。確定適宜宜的抗生生素水平平：抑菌菌抗生素素Ceff ，Cb ，能抑抑制細(xì)菌菌生長，還能保保證愈傷傷組織正正常生長長和分化化。確定選擇擇壓力的的最低水水平。優(yōu)化農(nóng)桿桿菌接種種和共培培養(yǎng)條件件改進(jìn)篩篩選條件件，促進(jìn)進(jìn)抗性細(xì)細(xì)胞恢復(fù)復(fù)再生能能力：采采用無毒毒的生化化物質(zhì)。2、根癌癌農(nóng)桿菌菌的培養(yǎng)養(yǎng)、純化化、保存存及工程程菌液的的制備（1）農(nóng)桿桿菌的培培養(yǎng)常用的農(nóng)農(nóng)桿菌培培養(yǎng)基有有 LBB、 YE

37、MM、 YEBB、 TY、 5233、PA及 MiinA等等培養(yǎng)基基。這些培養(yǎng)養(yǎng)基中，LB、YEBB、YEMM及5233屬富集集培養(yǎng)基基，其營營養(yǎng)成分分豐富，包括有有各種有有機(jī)成分分。在這這些培養(yǎng)養(yǎng)基中農(nóng)農(nóng)桿菌生生長快，分裂旺旺盛，它它們是常常用制備備工程菌菌液的培培養(yǎng)基。 PA和和 TYY培養(yǎng)基基是屬營營養(yǎng)較好好的培養(yǎng)養(yǎng)基，氨氨基酸及及碳源、氮源都都很豐富富。農(nóng)桿桿菌在這這些培養(yǎng)養(yǎng)基上生生長也很很快，是是常用的的農(nóng)桿菌菌選擇培培養(yǎng)時的的培養(yǎng)基基。MinAA培養(yǎng)基基與前幾幾種培養(yǎng)養(yǎng)基有明明顯差異異：只提提供必要要的無機(jī)機(jī)鹽，并并用葡萄萄糖和（NH44）2SOO4 提供碳碳源和氮氮源。 Minn

38、imaal只用用相應(yīng)的的冠癭堿堿如 NNOpaalinne、 Occtoppinee等取代代蔗糖、氨基酸酸和無機(jī)機(jī)氮作為為農(nóng)桿菌菌的碳源源和氮源源。農(nóng)桿菌在在MinnA和Minnimaal培養(yǎng)養(yǎng)基上生生長較慢慢。在進(jìn)進(jìn)行三親親雜交時時通常用用這兩種種培養(yǎng)基基，并加加相應(yīng)的的抗生素素選擇轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化的農(nóng)農(nóng)桿菌。含重組組質(zhì)粒的的大腸桿桿菌及含含輔助質(zhì)質(zhì)粒 ppRK220 113的HB1101因因不能利利用冠癭癭堿作為為碳源和和氮源而而不能生生長，同同時還存存在抗生生素的選選擇，因因此有利利于選擇擇轉(zhuǎn)化的的農(nóng)桿菌菌的生長長。農(nóng)桿菌的的生長周周期農(nóng)桿菌培培養(yǎng)方式式：分為為固體平平板培養(yǎng)養(yǎng)和液體體振蕩培培養(yǎng)，

39、固體培養(yǎng)養(yǎng)一般需需23d，液液體培養(yǎng)養(yǎng)生長更更快，一一般需112d。農(nóng)桿菌接接種在培培養(yǎng)液后后，并不不立即開開始增殖殖。一般般在25530時時，需112 hh細(xì)菌才才開始分分裂。當(dāng)生長開開始后，細(xì)菌數(shù)數(shù)目以一一恒定的的指數(shù)速速率倍增增，直至至培養(yǎng)基基成分改改變和供供氧缺乏乏時才停停止增殖殖。當(dāng)細(xì)細(xì)菌增長長速率達(dá)達(dá)到對數(shù)數(shù)指數(shù)時時稱之為為對數(shù)生生長狀態(tài)態(tài)。當(dāng)細(xì)菌密密度達(dá)到到 1777ml時，空氣中中的氧氣氣便難以以很快地地擴(kuò)散到到細(xì)胞內(nèi)內(nèi)。在振振蕩或通通氣條件件下培養(yǎng)養(yǎng)，細(xì)菌菌濃度也也很少超超過 223 XX 1009ml。測定農(nóng)桿桿菌濃度度的方法法：最簡簡單的方方法是光光密度測測定法。將菌液液

40、裝入比比色杯汽汽在分光光光度計計上選用用6000nm波波長測定定其ODD值。光光密度與與濃度換換算公式式是1OOD約等等于 88 X 1088ml。（2）工工程菌的的純化純化菌種種的方法法主要采采用常規(guī)規(guī)的微生生物純化化方法，即劃線線法。用用接種針針劃線，然后用用石蠟?zāi)つし饪冢瑢⑵矫竺蟮怪梅欧藕銣叵湎鋬?nèi)，在在2528條條件下培培養(yǎng)過夜夜，次日日或即日日看到分分離的單單菌落。挑取單單菌落接接種在液液體培養(yǎng)養(yǎng)基內(nèi)進(jìn)進(jìn)行液體體振蕩培培養(yǎng)。（3）工工程菌侵侵染懸浮浮液的制制備液體振蕩蕩培養(yǎng)的的工程菌菌，通常常培養(yǎng) 1224 h后即即可達(dá)到到對數(shù)生生長期。用離心心管取一一定數(shù)量量的菌液液進(jìn)行440000

41、rminn離心，倒掉上上清液，再加入入植物外外值體誘誘導(dǎo)愈傷傷組織或或分芽的的液體培培養(yǎng)基，使其光光密度OOD值達(dá)達(dá)到05，即可可用作接接種外植植體的工工程菌液液。注意：因因為農(nóng)桿桿菌培養(yǎng)養(yǎng)基中通通常含有有抗生素素，它對對外植體體的生長長、脫分分化或分分化有不不良影響響，放需需通過離離心除去去細(xì)菌培培養(yǎng)基，加入植植物培養(yǎng)養(yǎng)基。也也有的做做法是，將農(nóng)桿桿菌加入入植物培培養(yǎng)基后后再振蕩蕩培養(yǎng) 12 h，當(dāng)當(dāng)細(xì)菌生生長達(dá)到到對數(shù)生生長期后后再離心心，倒掉掉上清液液，用新新的植物物液體培培養(yǎng)基稀稀釋至一一定ODD值，再再作為工工程菌液液使用。（4）工工程菌的的保存菌種的保保存的目目的是創(chuàng)創(chuàng)造一個個適合

42、細(xì)細(xì)菌休眠眠的環(huán)境境（低溫溫、干燥燥、缺氧氧），使使其得以以長期保保存。其其功能在在于盡量量減少菌菌株的傳傳代次數(shù)數(shù)；使菌菌種經(jīng)保保存后不不死亡、不污染染雜菌，并保持持其原有有性狀，降低菌菌種的變變異率；最終目目的是的的基因不不能丟失失。菌種保存存的方法法根據(jù)其其保存時時間長短短可分為為三種方方法：短期保存存數(shù)月月）：采采用斜面面或平板板保存法法。斜面面菌種置置于4可保存存數(shù)月，平板用用石蠟?zāi)つっ芊夂蠛笠部稍谠诘蜏?04下放放置數(shù)月月。中長期保保存（數(shù)數(shù)年）：中長期期保存采采用穿刺刺法，這這是一種種菌種接接入柱狀狀培養(yǎng)基基的方法法。經(jīng)常常應(yīng)用的的是半固固體柱狀狀培養(yǎng)基基，用接接種針沾沾取少量量

43、問后直直接插入入柱狀培培養(yǎng)基中中。需注注意的是是，要從從培養(yǎng)基基中間插插入，直直插到接接近管底底，但不不要穿透透培養(yǎng)基基，再慢慢慢按原原途徑拔拔出接種種針，切切勿攪動動，以免免使接種種線不整整齊而影影響觀察察，甚至至?xí)蛴糜昧噭觿釉斐煽湛障短蟠筮M(jìn)入空空氣，而而影響保保存效果果。穿刺刺培養(yǎng)的的菌種用用蠟封口口，在室室溫下可可保存數(shù)數(shù)年。長期保存存菌種：主要采采用甘油油保存法法。在77二甲甲基亞（DMSSO）或或 155甘油油中，菌菌種可于于- 700冰箱或或液氮中中長期保保存。當(dāng)當(dāng)甘油含含量增加加40 500%時，細(xì)菌可可在- 20或- 700條件下下，保存存若干年年而不失失活。將將冰凍菌菌

44、種從冰冰柜中取取出時，應(yīng)當(dāng)放放在冰浴浴上慢慢慢融化，不可直直接將其其放室溫溫下，否否則會導(dǎo)導(dǎo)致菌體體失活，更不能能直接接接種至液液體培養(yǎng)養(yǎng)基內(nèi)228振蕩培培養(yǎng)。3、Viir基因因活化誘誘導(dǎo)物的的使用（1）誘誘導(dǎo)物：常用誘導(dǎo)導(dǎo)物是乙乙酰丁香香酮（AAS）和和羥基乙乙酰丁香香酮（OOHAS），其中效效果優(yōu)是是AS。但但最近又又有新的的發(fā)現(xiàn)，有兩種種特殊化化合物比比AS的誘誘導(dǎo)活性性高1001000倍。（2）誘誘導(dǎo)物的的使用方方法在農(nóng)桿菌菌液體培培養(yǎng)時加加 ASS，加入入時間般在制制備工程程菌浸染染液使用用前46 hh加入。使農(nóng)桿桿菌既處處于對數(shù)數(shù)生長期期，又處處于viir基因因高度活活化狀態(tài)態(tài)，從

45、而而提高侵侵染能力力。也有有的在農(nóng)農(nóng)桿菌懸懸浮液離離心后用用植物外外植體培培養(yǎng)基稀稀釋成侵侵染液時時加入。AS加在在農(nóng)桿菌菌和外植植體共培培養(yǎng)的培培養(yǎng)基中中。共培培養(yǎng)的過過程是TTi質(zhì)粒粒實現(xiàn) TT-DNNA轉(zhuǎn)化化時期。一般農(nóng)農(nóng)桿菌附附著 166 h后后才能進(jìn)進(jìn)行轉(zhuǎn)化化，這時時需要vvir基基因的高高度活化化。因此此，許多多科學(xué)家家贊成這這種使用用方法。在農(nóng)桿菌菌液體培培養(yǎng)基中中及共培培養(yǎng)基中中都加入入AS。這這種方法法似乎最最牢靠，只不過過是使用用的ASS誘導(dǎo)劑劑太多了了。（3）誘誘導(dǎo)物使使用的ppH值pH值對對virr區(qū)的活活化有著著明顯的的影響，從理論論上講含含AS的培培養(yǎng)基ppH值為為

46、5056時， Virr區(qū)基因因的誘導(dǎo)導(dǎo)達(dá)到最最高水平平。 pH值值改變 03，即對對多種植植物的轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化率有有明顯影影響。章魚堿型型和農(nóng)桿桿堿型菌菌系比胭胭脂堿型型和琥珀珀堿型需需要更低低的pHH值。通常農(nóng)桿桿菌培養(yǎng)養(yǎng)時pHH值為72。這種種生長旺旺盛的菌菌株的vvir基基因均處處于不活活化狀態(tài)態(tài)。而組組織培養(yǎng)養(yǎng)基中的的pH值常常為58，有利利于viir基因因的活化化。在vvir基基因活化化誘導(dǎo)中中應(yīng)調(diào)整整培養(yǎng)基基的pHH值。4、外植植體的選選擇Mayeer等指指出，轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化只發(fā)發(fā)生在細(xì)細(xì)胞分裂裂的一個個較短的的時期內(nèi)內(nèi)，可能能只有處處于細(xì)胞胞分裂周周期的SS期才具具有外源源基因的的轉(zhuǎn)化能能力，因

47、因為核基基因組DDNA正正在復(fù)制制時才能能使外源源DNAA整合。因此細(xì)細(xì)胞具有有分裂能能力是轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化的基基本條件件。（1）外外植體的的種類葉片、葉葉柄、子子葉、子子葉柄、下胚軸軸、莖、花莖、匍匐莖莖、塊；莖尖分分生組織織、芽、根、合合子胚或或體細(xì)胞胞胚，以以至成熟熟的種子子等都可可作為外外植體轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化。但但各種外外植體材材料的轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化率有有明顯差差異。賈士榮等等（19992）對不同同外植體體轉(zhuǎn)化成成功的例例進(jìn)行分分析統(tǒng)計計結(jié)果表表明，葉葉片（葉葉柄）、子葉（子葉柄柄）、胚胚軸、莖莖等外值值體轉(zhuǎn)化化成功的的事例最最多，它它們分別別占 35、 9。 110和和 117。但是，不同植植物的最最佳外植植體種

48、類類不同，要根據(jù)據(jù)具體植植物進(jìn)行行選擇。（2）轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化外植植體的選選擇原則則以葉片、子葉、胚軸為為首選外外植體材材料。選擇幼年年的外植植體，同同時要考考慮其最最佳感受受態(tài)。轉(zhuǎn)化外植植體易于于組織培培養(yǎng)，并并有較強(qiáng)強(qiáng)的再生生能力。應(yīng)考慮感感受態(tài)細(xì)細(xì)胞在外外植體的的部位。一些復(fù)復(fù)雜器官官的外植植體如胚胚軸、莖莖段、子子葉、幼幼葉等，其性質(zhì)質(zhì)未定細(xì)細(xì)胞的部部位及數(shù)數(shù)量分布布是不同同的，如如葉尖部部分生細(xì)細(xì)胞少，葉基分分生細(xì)胞胞多，子子葉基部部有大量量的分生生細(xì)胞，胚軸的的極端也也有大量量的分生生細(xì)胞，有的外外植體的的分生細(xì)細(xì)胞埋藏藏于深層層，盡管管這些細(xì)細(xì)胞具有有強(qiáng)的再再生能力力，但是是農(nóng)桿菌菌難以深

49、深入到附附著于這這些細(xì)胞胞壁上實實現(xiàn)轉(zhuǎn)化化。5、外植植體的預(yù)預(yù)培養(yǎng)、接種及及與農(nóng)桿桿菌的共共培養(yǎng)（1）外外植體的的預(yù)培養(yǎng)養(yǎng)預(yù)培養(yǎng)的的作用：（1）促進(jìn)進(jìn)細(xì)胞分分裂，分分裂狀態(tài)態(tài)的細(xì)胞胞更容易易整合外外源DNNA因而而提高外外源基因因的瞬時時表達(dá)和和轉(zhuǎn)化率率。（22）田間間取材的的外植體體通過預(yù)預(yù)培養(yǎng)起起到馴化化作用，使外植植體適應(yīng)應(yīng)于試管管離體培培養(yǎng)條件件，并保保持活躍躍的生長長代謝狀狀態(tài)。（3）減少少外植體體轉(zhuǎn)化過過程中的的雜菌污污染率；如果外外植體上上帶污染染源時，在預(yù)培培養(yǎng)被篩篩選掉。（4）有利利于侵染染接種的的外植體體能與培培養(yǎng)基平平整接觸觸。因為為外植體體在開始始培養(yǎng)過過程中，由于其其

50、迅速生生長而出出現(xiàn)上翹翹或卷曲曲，使農(nóng)農(nóng)桿菌的的接種切切面離開開培養(yǎng)基基致使農(nóng)農(nóng)桿菌不不能生長長實現(xiàn)轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化。外植體的的預(yù)培養(yǎng)養(yǎng)時間：每一種種外植體體均有其其最佳預(yù)預(yù)培養(yǎng)時時間。預(yù)預(yù)培養(yǎng)時時間太長長降低外外植體的的轉(zhuǎn)化率率，甚至至農(nóng)桿菌菌侵染后后外植體體死亡。一般以以23 dd為直，例如矮矮牽牛、番茄、擬南芥芥菜葉片片轉(zhuǎn)化均均需2dd預(yù)培養(yǎng)養(yǎng)。否需要預(yù)預(yù)培養(yǎng)，預(yù)培養(yǎng)養(yǎng)多長時時間，要要根據(jù)不不同植物物、不同同外植體體而確定定。（2）外外植體的的農(nóng)桿菌菌接種外植體接接種就是是把工程程菌接種種到外植植體的損損傷切面面。方法是將將切割成成小塊的的外植體體浸泡在在制備好好的工程程菌液中中，浸泡泡一定時時間

51、后，尚需用用無激素素植物培培養(yǎng)基或或無菌水水漂洗，再用無無菌吸水水紙吸干干。但目目前外值值體用菌菌液浸泡泡后常不不經(jīng)漂洗洗，直接接放在無無菌吸水水紙上吸吸干外植植體非傷傷口面的的菌液，即可進(jìn)進(jìn)行共培培養(yǎng)。在接種過過程中應(yīng)應(yīng)注意以以下幾點點：掌握外植植體在菌菌液中浸浸泡的時時間：有有助于減減少后繼繼培養(yǎng)中中可能造造成的污污染，并并可減輕輕細(xì)菌對對植物細(xì)細(xì)胞的毒毒害作用用，一般般控制在在數(shù)秒鐘鐘至數(shù)分分鐘內(nèi)，以葉盤盤邊緣充充分濕潤潤為度。浸泡時時間太短短農(nóng)桿菌菌尚未接接種到傷傷口面，在其培培養(yǎng)時無無農(nóng)桿菌菌生長，不能轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化。如如果外植植體在菌菌液中浸浸泡時間間太長，常因農(nóng)農(nóng)桿菌毒毒害缺氧氧而軟腐腐

52、，一般般不要超超過300mlnn。菌液濃度度：對不不同植物物的外植植體而言言有一定定差異，一般濃濃度范圍圍是 OOD6000=000507之間。對農(nóng)桿桿菌敏感感的植物物，因其其易產(chǎn)生生過敏反反應(yīng)而導(dǎo)導(dǎo)致外植植體切口口處褐化化，故常常采用較較低的OOD值和和較短的的浸泡時時間。浸泡后的的外植體體在濾紙紙上吸干干要適度度，如果果暴露時時間太長長造成外外植體失失水萎回回；吸得得太干在在共培養(yǎng)養(yǎng)時切口口面無農(nóng)農(nóng)桿菌生生長。因因此要明明確濾紙紙吸干的的原則是是除去過過量的菌菌體。（3）農(nóng)農(nóng)桿菌與與外植體體共培養(yǎng)養(yǎng)接種菌體體后的外外植體培培養(yǎng)在誘誘導(dǎo)愈傷傷組織或或不定芽芽分化的的固體培培養(yǎng)基上上，在外外植

53、體細(xì)細(xì)胞分裂裂、生長長的同時時，農(nóng)桿桿菌在外外植體切切口面也也增殖生生長，該該兩者共共同培養(yǎng)養(yǎng)過程稱稱之共培培養(yǎng)。最佳共培培養(yǎng)的時時間：農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化時，并不“侵入”到植物物細(xì)胞中中去，而而是把TTDNAA轉(zhuǎn)移到到植物細(xì)細(xì)胞。農(nóng)農(nóng)桿菌附附著后不不能立即即轉(zhuǎn)化，只有在在創(chuàng)傷部部位生存存16hh之后的的菌株才才能誘發(fā)發(fā)腫瘤，這一段段時間稱稱為“細(xì)胞調(diào)調(diào)節(jié)期”。因此此，共培培養(yǎng)時間間必須長長于 116h。共培養(yǎng)養(yǎng)時間太太長，由由于農(nóng)桿桿菌的過過度生長長，植物物細(xì)胞因因受到毒毒害而死死亡。共共培養(yǎng)時時間對轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化率有有著很大大影響，而且不不同物種種、外植植體種類類、農(nóng)桿桿菌菌株株的最佳佳共培養(yǎng)養(yǎng)時間不不同

54、。確定最佳佳共培養(yǎng)養(yǎng)時間的的方法主主要采用用guss基因瞬瞬時表達(dá)達(dá)測定法法，即共共培養(yǎng)后后定時測測定外植植體的ggus基基因顏色色反應(yīng)，統(tǒng)計瞬瞬時表達(dá)達(dá)率及表表達(dá)面積積，以表表達(dá)率高高，表達(dá)達(dá)面積大大為優(yōu)。同時還還要考慮慮外植體體的受損損害程度度，以保保證外植植體的旺旺盛生長長為直。最后還還要以獲獲得的轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化愈傷傷組織頻頻率或轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化不定定芽頻率率為最終終依據(jù)。農(nóng)桿菌的的增殖適適度在共培養(yǎng)養(yǎng)時農(nóng)桿桿菌增殖殖生長不不良，外外植體切切口邊緣緣只有很很少的農(nóng)農(nóng)桿菌生生長，則則轉(zhuǎn)化的的機(jī)率很很小。反反之，農(nóng)農(nóng)桿菌在在外值體體四周過過度增殖殖，可引引起對外外植體的的毒害，致使其其褐化死死亡?？刂妻r(nóng)桿桿菌

55、增殖殖適度的的原則是是既要使使菌株在在外植體體邊緣特特別是切切口面旺旺盛增殖殖生長，又不應(yīng)應(yīng)過度，一般以以覆蓋切切口面為為適度。控制農(nóng)桿桿菌增殖殖的方法法有以下下幾種： 1）調(diào)整工工程菌液液的濃度度，生長長太快則則應(yīng)降低低菌液濃濃度。 2）控制共共培養(yǎng)時時間，農(nóng)農(nóng)桿菌的的增殖生生長適度度也是確確定共培培養(yǎng)最佳佳時間的的指標(biāo)，共培養(yǎng)養(yǎng)時間太太長可造造成農(nóng)桿桿菌過度度生長。 3）使用抗抗生素調(diào)調(diào)控農(nóng)桿桿菌的增增殖生長長。一種種方法是是在共培培養(yǎng)基中中加入適適量的抗抗生素如如羧芐青青霉素或或頭孢霉霉素。另另一種方方法是共共培養(yǎng)223d后的的外植體體需用含含抗生素素的液體體共培養(yǎng)養(yǎng)基充分分洗滌，以除去

56、去過量的的農(nóng)桿菌菌，然后后轉(zhuǎn)到新新鮮的共共培養(yǎng)基基上繼續(xù)續(xù)共培養(yǎng)養(yǎng)。共培培養(yǎng)結(jié)束束時若仍仍存在農(nóng)農(nóng)桿菌過過度增殖殖，則可可再用上上述洗滌滌培養(yǎng)基基充分洗洗滌后進(jìn)進(jìn)行愈傷傷組織誘誘導(dǎo)或不不定芽分分化培養(yǎng)養(yǎng)。共培養(yǎng)中中激素的的影響共培養(yǎng)時時培養(yǎng)基基中是否否加激素素，文獻(xiàn)獻(xiàn)報道不不一，有有的不加加激素，有的則則認(rèn)為加加激素后后促進(jìn)外外植體細(xì)細(xì)胞分裂裂，保持持細(xì)胞活活力，也也有利于于轉(zhuǎn)化后后細(xì)胞的的生長，從而提提高轉(zhuǎn)化化率。如 Maansuur等（19993）用用 A2281菌菌株與花花生葉片片外植體體共培養(yǎng)養(yǎng)時，加加激素比比不加激激素的腫腫瘤誘導(dǎo)導(dǎo)率提高高約 30。目前大多多數(shù)研究究者采用用加激素素

57、的方法法，而且且共培養(yǎng)養(yǎng)基與愈愈傷組織織誘導(dǎo)或或不定芽芽誘導(dǎo)培培養(yǎng)基相相同。（4）外外植體脫脫菌及選選擇培養(yǎng)養(yǎng)外植體的的脫菌培培養(yǎng)脫菌培養(yǎng)養(yǎng)，即把把共培養(yǎng)養(yǎng)外植體體轉(zhuǎn)移到到含有抗抗生素的的培養(yǎng)基基上。常常用的脫脫菌抗生生素有羧羧芐青霉霉素（CCarbb）、頭孢孢霉素（Ceff）等。這這些抗生生素不僅僅對農(nóng)桿桿菌有殺殺傷或抑抑菌作用用，而且且對植物物細(xì)胞同同樣有一一定的生生物效但但對不同同植物的的不同外外植體產(chǎn)產(chǎn)生的影影響不同同。Holffordd 等（1 9992 ）指出出，Caarb 的分解解物為生生長素及及苯乙酸酸，因此此 CCarbb 可刺刺激愈傷傷組織的的增殖。Howwe 等等（ 11

58、9944 ）觀觀察到對對楊樹的的愈傷組組織誘導(dǎo)導(dǎo)有抑制制作用。在甘藍(lán)藍(lán)研究中中發(fā)現(xiàn)，Carrb 抑抑制根分分化，CCef 抑制芽芽分化，因此芽芽分化階階段需用用Carrb，生根階階段則用用Ceff?？股氐牡氖褂脻鉂舛纫话惆銥?000mggL 左右右。其使使用原則則是在達(dá)達(dá)到抑制制農(nóng)桿菌菌生長的的目的后后，盡量量降低其其濃度。脫菌培養(yǎng)養(yǎng)的時間間：脫菌菌培養(yǎng)的的時間，一般需需56次繼代代培養(yǎng)，但仍然然不能把把殘留的的農(nóng)桿菌菌殺死，特別是是共生在在維管束束和細(xì)胞胞間隙中中的農(nóng)桿桿菌。如如果停止止使用抗抗生素后后的外植植體又有有農(nóng)桿菌菌可再使使用抗生生素脫菌菌。也有有的植物物一直使使用抗生生素，直直

59、到試管管苗形成成。（5）轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化體的的選擇培培養(yǎng)選擇壓：選擇抗抗生素如如 Kmm，加入入選擇培培養(yǎng)基后后，對細(xì)細(xì)胞的生生長產(chǎn)生生一種選選擇作用用，稱之之為選擇擇壓。加加入的抗抗生素濃濃度愈大大，選擇擇壓也愈愈大。選選擇培養(yǎng)養(yǎng)基中抗抗生素的的濃度，即選擇擇壓的強(qiáng)強(qiáng)度，也也要根據(jù)據(jù)植物的的特性而而定，較較敏感的的植物要要用較低低的 KKm濃度度。一般般濃度范范圍是 Km 50 1000mggL， hppt 110220mggL， pppt 5520mmgL。選擇的方方法：前前期選擇擇、延遲遲選擇和和后期選選擇。前期選擇擇：就是是外植體體共培養(yǎng)養(yǎng)后，在在轉(zhuǎn)入愈愈傷組織織或不定定芽誘導(dǎo)導(dǎo)的一開開始就加加

60、入選擇擇壓，相相當(dāng)于前前面講到到的先選選擇后再再生。延遲選擇擇：當(dāng)愈愈傷組織織和不定定芽誘導(dǎo)導(dǎo)培養(yǎng)時時開始不不加選擇擇壓，過過一周或或一定時時間后再再加入選選擇壓，這樣既既有利于于轉(zhuǎn)化細(xì)細(xì)胞生長長又不會會產(chǎn)生更更多的嵌嵌合體后期選擇擇：即相相當(dāng)于前前面說的的先再生生后選擇擇，有利利于提高高轉(zhuǎn)化率率。選擇培養(yǎng)養(yǎng)過程中中轉(zhuǎn)化和和再生細(xì)細(xì)胞的一一致性在選擇培培養(yǎng)條件件下再生生細(xì)胞和和轉(zhuǎn)化細(xì)細(xì)胞是否否一致，關(guān)系到到能否得得到真正正的轉(zhuǎn)化化，只有有同時具具有再生生和轉(zhuǎn)化化潛力的的細(xì)胞才才有可能能分化成成轉(zhuǎn)基因因植株。因此再再生部位位和可被被轉(zhuǎn)化的的細(xì)胞部部位應(yīng)該該發(fā)源一一致，反反之得到到的可能能是假轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)