專題篇基因診斷與基因治療課件

1、基因變異致病類型內(nèi)源基因的變異基因結(jié)構(gòu)突變基因表達(dá)異常外源基因的入侵基因變異致病類型內(nèi)源基因的變異外源基因的入侵第 一 節(jié)基因診斷Gene Diagnosis第 一 節(jié)基因診斷 （二）、分類 DNA診斷以DNA為檢測對象的診斷方法。 RNA診斷以mRNA為檢測對象的診斷方法。一、基因診斷的概念和特點 （一）、定義利用現(xiàn)代分子生物學(xué)和分子遺傳學(xué)的技術(shù)和方法，直接檢測基因結(jié)構(gòu)及其表達(dá)水平是否正常，從而對疾病作出診斷的方法。 （二）、分類一、（三）、特點針對性強 特異性高靈敏度高 適用性強，診斷范圍廣（三）、特點二、 基因診斷常用技術(shù)方法 （一）、核酸分子雜交技術(shù)（二）、聚合酶鏈反應(yīng)（三）、基因測序

2、（四）、基因芯片（五）、DNA指紋二、 基因診斷常用技術(shù)方法 （一）、核酸分子雜交(molecular hybridization)技術(shù) 核酸分子雜交可用以檢測樣本中是否存在與探針序列互補的同源核酸序列。 核酸探針 是一類具有放射性標(biāo)記或化學(xué)標(biāo)記的并與目的目的DNA或RNA分子序列互補的寡核苷酸片段。 （一）、核酸分子雜交(molecular hybridiza 探針是能夠同某種待研究的核酸序列或蛋白多肽鏈特異結(jié)合的任何分子，經(jīng)標(biāo)記之后可用來檢測目的DNA/RNA 或蛋白質(zhì)分子。 實驗流程：提取DNA(限制酶切)凝膠電泳膜轉(zhuǎn)移雜交放射自顯影分析 探針是能夠同某種待研究的核酸序列或蛋白建立在核酸

3、雜交技術(shù)基礎(chǔ)上的常用基因診斷方法1、限制性內(nèi)切酶(restriction endonuclease)酶譜分析法2、DNA限制性片段長度多態(tài)性(restriction fragment length polymorphism, RFLP)分析法 3、等位基因特異寡核苷酸 (allele specific oligonucleotide, ASO)探針雜交法建立在核酸雜交技術(shù)基礎(chǔ)上的常用基因診斷方法1、限制性內(nèi)切酶(1、限制性內(nèi)切酶酶譜分析法 是利用限制性內(nèi)切酶和特異性DNA探針來檢測是否存在基因變異的一種方法。1、限制性內(nèi)切酶酶譜分析法 是利用限制性內(nèi)切Mst酶切位點(CCTNAGG)53正常基

4、因53突變基因1.15kb1.35kb鐮狀紅細(xì)胞貧血患者基因組的限制性酶切分析AT Mst酶切位點(CCTNAGG)53正常基因53+0.2kb1.15kb1.35kb正常人突變攜帶著患者鐮狀紅細(xì)胞貧血患者基因組的限制性酶切分析+0.2kb1.15kb1.35kb正常人突變攜帶著患者鐮2、DNA-RFLP分析法 中性突變是指在人基因組中，平均每200對堿基可發(fā)生一對變異的現(xiàn)象。 DNA多態(tài)性是指中性突變導(dǎo)致個體間核苷酸序列的差異。 限制性片段長度多態(tài)性是指DNA多態(tài)性若發(fā)生在限制性內(nèi)切酶識別位點上，酶切水解該DNA片段就會產(chǎn)生長度不同的片段。2、DNA-RFLP分析法 中性突變是指在RFLP分

5、析法RFLP分析法3、ASO雜交法 根據(jù)已知基因突變位點的核苷酸序列，人工合成相應(yīng)于正常和突變基因堿基序列的兩種寡核苷酸探針，用它們分別與受檢者DNA進行分子雜交來檢測是否存在等位基因突變。 3、ASO雜交法 根據(jù)已知基因突變位點的核苷ASO雜交法探針：M N M N M N M N 正常基因 純合突變 雜合突變 基因缺陷 （新的突變類型？） +ASO雜交法探針：M N M N （二）、聚合酶鏈反應(yīng) (polymerase chain reaction, PCR) 是利用特異的引物，特異地擴增目的DNA的方法。 實驗流程：提取DNAPCR凝膠電泳顯色分析（二）、聚合酶鏈反應(yīng) (polymera

6、se chain r5Primer 15Primer 2Cycle 2Cycle 155 55 5 5Template DNA55 555 5 551、基本工作原理5Primer 15Primer 2Cycle 2CycCycle 355 555 5 555 5 55 555 52530 次循環(huán)后，模板DNA的含量可以擴大100萬倍以上。Cycle 355 555 5 555 52、常用的PCR方法： 常規(guī)PCR、巢式PCR、多重PCR、多種PCR、不對稱PCR、反轉(zhuǎn)錄PCR、定量反轉(zhuǎn)錄PCR、mRNA差異顯示PCR、原位PCR、實時PCR等等。2、常用的PCR方法：3、在PCR技術(shù)基礎(chǔ)上的常

7、用基因診斷方法PCR-SSCP法*PCR-ASO法PCR-RFLP法PCR-限制酶譜法PCR-STR（短串聯(lián)重復(fù)序列，short tandem repeat）3、在PCR技術(shù)基礎(chǔ)上的常用基因診斷方法PCR-SSCP法* SSCP是指相同長度的單鏈DNA因其堿基序列不同，甚至單個堿基不同，都可能形成不同的空間構(gòu)象，從而在中性聚丙烯酰胺凝膠電泳時泳動速率不同的現(xiàn)象。 單鏈構(gòu)象多態(tài)性 (single strand conformation polymorphism, SSCP) SSCP是指相同長度的單鏈DNA因其堿基序PCR-SSCP分析 是指PCR產(chǎn)物變性后，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳，正常基因和變異

8、基因的遷移位置不同，借此可分析確定致病基因的存在。PCR-SSCP分析 是指PCR產(chǎn)物變性后正常人純合突變雜合突變Leber 遺傳性神經(jīng)病患者 PCR/SSCP分析 （線粒體DNA第11778位GA所致）+正常人純合突變雜合突變Leber 遺傳性神經(jīng)病患者 PCR/（三）、基因測序(gene sequencing) 即測定某一基因的堿基序列。 實驗流程：提取DNA分離出有關(guān)基因測序分析診斷 基因測序的方法：化學(xué)裂解法DNA鏈末端合成終止法DNA自動測序（三）、基因測序(gene sequencing) （四）、基因芯片（gene chip) 基因芯片，又稱DNA芯片、DNA陣列、寡核苷酸微芯片

9、（DNA chip、DNA arrays、oligonucleotide micro-chip）是指將許多特定的寡核苷酸片段或基因片段作為探針，有規(guī)律地排列固定于支持物上，然后與待測的標(biāo)記樣品的基因按堿基配對原理進行雜交，再通過激光聚焦熒光檢測系統(tǒng)等對芯片進行掃描，并配以計算機系統(tǒng)對每一探針上的熒光信號作出比較和檢測，從而迅速得出定性和定量的結(jié)果。（四）、基因芯片（gene chip) 基因?qū)ｎ}篇基因診斷與基因治療課件基因芯片的應(yīng)用1、在診斷中的應(yīng)用 核酸序列分析、基因表達(dá)分析、尋找新基因、突變基因和基因多態(tài)性檢測等2、在藥學(xué)研究中的應(yīng)用 藥物篩選、藥物作用機制研究、耐藥菌株、藥敏檢測、毒理學(xué)

10、研究、環(huán)境化學(xué)毒物的篩選、基因掃描等基因芯片的應(yīng)用1、在診斷中的應(yīng)用（五）、DNA指紋(DNA fingerprint) 在人基因組DNA中有高度可變的“小衛(wèi)星”區(qū)域，采用“小衛(wèi)星”基因探針，在同一限制酶切產(chǎn)物的DNA雜交圖譜上，同一個體不同組織來源的DNA的譜帶完全一致，而不同個體之間（同卵雙生除外）譜帶都不相同，如同人的指紋具有高度個體特異性一樣，因此這種雜交圖譜被稱為DNA指紋或遺傳指紋（genetic fingerprint）。（五）、DNA指紋(DNA fingerprint) 簡言之：DNA指紋或遺傳指紋是指采用“小衛(wèi)星”基因探針進行DNA分子雜交（ Southern 印跡，Sou

11、thern blotting）所得的圖譜。 實驗流程：提取DNA限制酶切凝膠電泳膜轉(zhuǎn)移雜交放射自顯影分析 簡言之：DNA指紋或遺傳指紋是指采用“小三、基因診斷的應(yīng)用遺傳疾病腫瘤感染性疾病傳染性流行病判斷個體疾病易感性器官移植組織配型法醫(yī)學(xué)中個體識別、親子鑒定三、基因診斷的應(yīng)用遺傳疾病總結(jié) 基因診斷的概念、特點、常用的技術(shù)方法及應(yīng)用。總結(jié) 基因診斷的概念、特點、常用的技術(shù)方法及復(fù)習(xí)題1、名詞解釋： 基因診斷、DNA診斷、RNA診斷、RFLP分析、SSCP、基因芯片、DNA指紋2、簡述基因診斷的特點、常用技術(shù)方法及可用于診斷的疾病。簡述基因變異致病的類型及內(nèi)源性基因變異的類型。簡述限制性內(nèi)切酶譜分

12、析法、ASO探針雜交法、PCR-SSCP分析、基因芯片、DNA指紋等的實驗流程。復(fù)習(xí)題1、名詞解釋：第 二 節(jié)基因治療Gene Therapy第 二 節(jié)基因治療（一）、基因治療的概念早期是指用正常的基因整合入細(xì)胞基因組，以校正和置換致病基因的一種治療方法。 目前廣義上來講是指將某種遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移到患者細(xì)胞內(nèi)，使其在體內(nèi)發(fā)揮作用，以達(dá)到治療疾病目的的方法。一、基因治療的概念（一）、基因治療的概念目前廣義上來講是指將某種遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移到（二）、基因治療的基本方法1、基因矯正 (gene correction)2、基因置換 (gene replacement)3、基因增補 (gene augmentat

13、ion)4、基因失活 (gene inactivation) （二）、基因治療的基本方法 1、基因矯正 (gene correction) 指將致病基因的異常堿基進行糾正，而正常部分予以保留。 納米鉗 1、基因矯正 (gene correction)A G C T G T G A A G T C G T GT C G A C A C T T C A G C A CabnormalgeneGene correctionnormalgeneTACGA G C T G T G A A G T C G T 2、基因置換 (gene replacement) 指用正常的基因通過體內(nèi)基因同源重組，原位替換

14、致病基因，使細(xì)胞內(nèi)的DNA完全恢復(fù)正常狀態(tài)。2、基因置換 (gene replacement)A G C T G T G C A A G T C G T GT C G A C A C G T T C A G C A CnormalgeneA G C T G T G C A A G T C G T GT C G A C A C G T T C A G C A CnormalgeneA G C T G T G T A A G T C G T GT C G A C A C A T T C A G C A CabnormalgeneGene replacementA G C T G T G C A A

15、 G T C G T 3、基因增補 (gene augmentation) 將目的基因?qū)氩∽兗?xì)胞或其他細(xì)胞，不去除異常基因，而是通過目的基因的非定點整合，使其表達(dá)產(chǎn)物彌補缺陷基因的功能或使原有基因表達(dá)增強。3、基因增補 (gene augmentation)A G C T G T G C A A G T C G T GT C G A C A C G T T C A G C A CnormalgeneA G C T G T G T A A G T C G T GT C G A C A C A T T C A G C A CabnormalgeneGene augmentationA G C T

16、 G T G C A A G T C G T 4、基因失活 (gene inactivation) 指將特定的序列導(dǎo)入細(xì)胞后，在轉(zhuǎn)錄或翻譯水平阻斷某些基因的異常表達(dá)，已達(dá)到治療疾病的目的。4、基因失活 (gene inactivation)幾種常見的基因失活技術(shù)反義核酸技術(shù)核酶技術(shù)三鏈技術(shù)干擾RNA技術(shù)肽核酸基因敲除幾種常見的基因失活技術(shù)反義核酸技術(shù)反義(antisence)核酸技術(shù) 是指用人工合成的RNA或DNA來阻斷基因的轉(zhuǎn)錄或復(fù)制，使編碼基因不能轉(zhuǎn)錄為mRNA，因而不能翻譯成相應(yīng)的蛋白質(zhì)。反義(antisence)核酸技術(shù) 是反義RNA技術(shù) 反義RNA是指與mRNA互補，且能抑制與疾病發(fā)

17、生直接相關(guān)基因表達(dá)的RNA。 反義RNA技術(shù)是指利用反義RNA在mRNA水平上封閉基因表達(dá)，最終可通過調(diào)節(jié)劑量，來治療由基因突變或過度表達(dá)所致的疾病或嚴(yán)重感染性疾病。 反義RNA技術(shù) 反義RNA是指與mRNA互T C G A C A C A T T C A G C A CA G C T G T G T A A G T C G T GabnormalgeneGene inactivationabnormalmRNA U C G A C A C A U U C A G C A C反義RNA A G C U G U G U A A G U C G U GAbnormal proteinAbnorma

18、l proteinT C G A C A C A T T C A G C A 核酶(ribozyme)技術(shù) 通過核酶分子結(jié)合到靶RNA分子中適當(dāng)?shù)牟课唬纬慑N頭核酶結(jié)構(gòu)，催化對靶RNA分子的剪切，從而破壞靶RNA分子達(dá)到治療疾病的目的。核酶(ribozyme)技術(shù) 通過核酶分5353靶RNA核酶分子核酶技術(shù)5353靶RNA核酶分子核酶技術(shù)三鏈技術(shù)(triplex approach) 又稱為反基因策略(antigene stragegy)，是利用脫氧寡核苷酸能與雙螺旋雙鏈DNA專一性序列結(jié)合，形成三鏈DNA，從而在轉(zhuǎn)錄水平或復(fù)制水平阻止基因轉(zhuǎn)錄或復(fù)制的技術(shù)。 能形成三鏈DNA的脫氧寡核苷酸稱為三

19、鏈DNA形成脫氧寡核苷酸（triplex-forming oligonucleotide,TFO)。三鏈技術(shù)(triplex approach) 復(fù)制、轉(zhuǎn)錄三鏈DNA技術(shù)復(fù)制、轉(zhuǎn)錄三鏈DNA技術(shù)干擾RNA(interference RNA,RNAi)技術(shù) RNAi是指在特定因子作用下，有導(dǎo)入胞內(nèi)的雙鏈RNA降解生成的約22nt左右的SiRNAs(single strand RNAi)。 RNAi技術(shù)是指利用堿基互補配對原則，使RNAi和靶DNA結(jié)合，同時誘導(dǎo)激活體內(nèi)的基因沉默因子，從而使靶DNA降解。干擾RNA(interference RNA,RNAi)技dsRNARNAi-DNARNA、D

20、NA降解干擾RNA技術(shù)RNAidsRNARNAi-DNARNA、DNA降解干擾RNA技術(shù)RRNAi技術(shù)的特點特異性強效率性高作用時間長可通過細(xì)胞屏障而發(fā)揮作用RNAi技術(shù)的特點特異性強肽核酸(peptide nucleic acid,PNA)技術(shù) PNA是指DNA-肽復(fù)合物。 PNA技術(shù)是利用多肽與DNA的特異性結(jié)合，專一地抑制某一基因的表達(dá)。肽核酸(peptide nucleic acid,PNA)肽肽核酸技術(shù)肽肽核酸技術(shù)基因敲除(gene knock-out)技術(shù) 指有目的的去除動物體內(nèi)某種基因的技術(shù)。基因敲除(gene knock-out)技術(shù) （三）、基因治療的其他方法1、“自殺基因”

21、的應(yīng)用 某些病毒或細(xì)菌的基因所表達(dá)的酶能將對人體無毒或低毒的藥物前體在人體細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)變?yōu)榧?xì)胞毒性產(chǎn)物，從而導(dǎo)致攜帶該基因的受體細(xì)胞也被殺死，故稱這類基因為自殺基因。 自殺基因 無毒、低毒的藥物前體 細(xì)胞毒性產(chǎn)物細(xì)胞死亡（三）、基因治療的其他方法1、“自殺基因”的應(yīng)用2、基因疫苗的應(yīng)用 將編碼外源性抗原的基因插入到含真核表達(dá)系統(tǒng)的質(zhì)粒上，然后將質(zhì)粒直接導(dǎo)入人或動物體內(nèi)，讓其在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)抗原蛋白，誘導(dǎo)機體產(chǎn)生免疫應(yīng)答。2、基因疫苗的應(yīng)用重組表達(dá)質(zhì)粒外源性抗原基因基因疫苗重組表達(dá)質(zhì)粒外源性抗原基因基因疫苗二、基因治療的基本程序一、治療性基因的選擇 目的基因的選擇二、基因載體的選擇三、靶細(xì)胞的選擇四、基因轉(zhuǎn)移五、外源基因表達(dá)的篩選 利用載體中的標(biāo)記基因 有neor標(biāo)記基因時，用 418進行篩選六、回輸體內(nèi) 靜脈回輸 自體骨髓移植 埋入皮下組織病毒載體*非病毒載體體細(xì)胞生殖細(xì)胞間接體內(nèi)療