細(xì)胞周期醫(yī)學(xué)知識(shí)課件

1、Chen（Chen, 2009）提出聯(lián)合使用黃芩素和水飛薊素，對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞顯示良好的殺傷作用，對(duì)正常肝細(xì)胞（Chang liver）活性沒(méi)有影響，兩種藥物聯(lián)合應(yīng)用增加了G0/G1期細(xì)胞的百分率，減少了S期細(xì)胞的百分率，上調(diào)了Rb、p53、Cip1/p21和Kip1/p27蛋白，下調(diào)了Cyclin D1、Cyclin E、CDK4和phospho-Rb。 Chen L, Willis S N, Wei A, et al. Differential targeting of prosurvival Bcl-2 proteins by their BH3-only ligands allow

2、s complementary apoptotic function. Mol Cell, 2005, 17(3): 393-403Varghese（Varghese, 2005）采用肝癌HepG2和 Hep3B細(xì)胞研究水飛薊賓的抗腫瘤作用，發(fā)現(xiàn)水飛薊賓強(qiáng)烈抑制HepG2和Hep3B細(xì)胞增殖，且對(duì)Hep3B細(xì)胞的增殖抑制效果更強(qiáng)。對(duì)于HepG2細(xì)胞，水飛薊賓導(dǎo)致G1期阻滯；對(duì)于Hep3B 細(xì)胞，導(dǎo)致G1 和G2-M 阻滯。對(duì)于這2種細(xì)胞，水飛薊賓誘導(dǎo)Kip1/p27表達(dá)，減少cyclin D1、cyclin D3、cyclin E、CDK2和CDK4表達(dá)水平。 Varghese L, Agar

3、wal C, yagi A, Singh RP, Agarwal R. Silibinin efficacy against human hepatocellular carcinoma. Clin Cancer Res, 2005,23(11):8441-8448. Chen（Chen, 2009）提出聯(lián)合使用黃芩素和水飛薊素PI單染流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期百分比（n=3）組別 G0/G1期 S期 G2/M期ControlRODN(1.0mol/L)ASODN(0.75mol/L)ASODN(1.0mol/L)47.400.5048.300.3040.100.36*33.270.47*49.5

4、00.3048.600.3658.900.30*63.830.38*3.100.203.070.250.970.062.900.10注：*與RODN組相比，P 0.01 PI單染流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期百分比（n=3） G0第一部分：細(xì)胞周期概況： 間期：G0，G1，S，G2 分裂期：M2. 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)一些蛋白和激酶調(diào)控細(xì)胞周期第一部分：細(xì)胞周期是指連續(xù)分裂細(xì)胞從一次有絲分裂結(jié)束到下一次有絲分裂結(jié)束所經(jīng)歷的整個(gè)過(guò)程。G0細(xì)胞周期是指連續(xù)分裂細(xì)胞從一次有絲分裂結(jié)束到下一次有絲分裂結(jié)細(xì)胞周期與DNA合成正常的細(xì)胞周期分為間期（interphase）和有絲分裂期(M phase)。其中間期 以DNA合成

5、為標(biāo)志。分為：G0期（即靜止?fàn)顟B(tài)），G1期（DNA合成前期），S期（DNA合成期）G2期（合成其它必需的物質(zhì)）細(xì)胞周期與DNA合成正常的細(xì)胞周期分為間期（interphaG1SG2MG1周期性運(yùn)轉(zhuǎn)，在間期細(xì)胞體積增大(生長(zhǎng))，M 期細(xì)胞 先核分裂，接著胞質(zhì)分裂，G1SG2MG1周期性運(yùn)轉(zhuǎn)， 在間期細(xì)胞體積增大(生長(zhǎng))， S期 DNA 復(fù)制， M 期細(xì)胞 先核分裂，接著胞質(zhì)分裂， 完成一個(gè)細(xì)胞周期。G1SG2MG1周期性運(yùn)轉(zhuǎn)，G1期時(shí)期:從有絲分裂結(jié)束到DNA合成開(kāi)始之間。 First Gap 有絲分裂后期，子細(xì)胞繼續(xù)生長(zhǎng)時(shí)期。時(shí)間:變化大,幾小時(shí)-幾天 人體 200 多種細(xì)胞，周期時(shí)間不同,主

6、要在 G1。 如：胚胎早期卵裂細(xì)胞 幾乎測(cè)不到G1期 淋巴細(xì)胞 數(shù)小時(shí) 神經(jīng)元細(xì)胞 終生停在G1期G1期時(shí)期:從有絲分裂結(jié)束到DNA合成開(kāi)始之間。特點(diǎn)：能對(duì)各種環(huán)境信號(hào),進(jìn)行綜合協(xié)調(diào)，并作出反應(yīng)，以確定是否進(jìn)入S期。事件：細(xì)胞生長(zhǎng)主要階段。合成組蛋白、非組蛋白、一些酶類(lèi)、一定量的RNA，還有微管蛋白和抑素。 這些蛋白即觸發(fā)蛋白，積累到一定程度，可通過(guò)G1期檢查點(diǎn)，進(jìn)入S期。 抑素：與細(xì)胞停止在G1期有關(guān)。特點(diǎn)：能對(duì)各種環(huán)境信號(hào),進(jìn)行綜合協(xié)調(diào)，并作出反應(yīng)，以確定是否S期DNA合成期基本特點(diǎn)：（1）復(fù)制DNA，為分裂作準(zhǔn)備 （2） 合成組蛋白和非組蛋白。時(shí)間：約10 h左右形態(tài)：細(xì)胞增大S期末，D

7、NA加倍。 完成DNA復(fù)制，才能入M期。S期DNA合成期特點(diǎn)： (1) 主要為DNA合成： 開(kāi)始時(shí)，急劇形成DNA聚合酶及 4 種脫氧核苷酸以后，合成DNA等。 Bao和Johnson，采用Hela細(xì)胞。把G1期細(xì)胞與S期細(xì)胞融合，引起G1期細(xì)胞核合成DNA。融合的S期細(xì)胞越多，G1期細(xì)胞合成DNA的速度越快。 S期細(xì)胞中有一種誘導(dǎo)物質(zhì)，能促進(jìn)DNA的合成。 (2) S期的蛋白質(zhì)合成：合成組蛋白和非組蛋白。 DNA復(fù)制過(guò)程中需不斷合成蛋白質(zhì)，組蛋白的合成和DNA的復(fù)制密切配合。Gurlez和Hardin： （1）用藥物阻斷蛋白質(zhì)合成（如加入環(huán)己酰胺），幾秒鐘后DNA合成停止。（2）用藥物抑制D

8、NA合成（如加入阿霉素），組蛋白合成立即停止，非組蛋白合成不受影響。特點(diǎn)：G2期 時(shí)期:分裂之前 時(shí)間：較短，約2 - 3 h 多數(shù)細(xì)胞休止于G1期，也有細(xì)胞休止于G2期，如少數(shù)休眠的種子細(xì)胞。特點(diǎn)：主要合成分裂有關(guān)的蛋白質(zhì)，尤以細(xì)胞骨架蛋白。 如阻止蛋白質(zhì)合成，細(xì)胞不進(jìn)入分裂。G2期 時(shí)期:分裂之前M期 時(shí)期：最終階段基本特點(diǎn)：形態(tài)、結(jié)構(gòu)變化最大，細(xì)胞增殖標(biāo)志時(shí)間：短，較恒定分期：前期、中期、后期，末期 M期 時(shí)期：最終階段前期prophase染色質(zhì)凝集，核膜崩解，紡綞體形成特點(diǎn)： 1.染色體組裝：染色質(zhì)疑集，M期開(kāi)始。分裂前染色質(zhì)逐漸變短，變粗，成染色體，每個(gè)復(fù)制的染色體形成一對(duì)姐妹染色體

9、（sister chromatics）。2.紡綞體形成：中心粒:2套中心粒分離,向兩極移動(dòng)成為紡綞體的兩個(gè)極，是微管組織中心(MTOC)。3.核膜崩解，前期結(jié)束。前期prophaseM期-中期要點(diǎn): 紡綞體及赤道板形成 特點(diǎn): 紡綞體：已形成，穩(wěn)定 染色體：高度濃縮，形成中期板(赤道板)細(xì)胞形狀：圓形、易脫落M期-中期M期后期要點(diǎn): 后期開(kāi)始染色單體分離，分別移動(dòng)到相反的紡錘體極。 細(xì)胞形狀：略變長(zhǎng)。 M期后期M期末期要點(diǎn):細(xì)胞質(zhì)分裂，形成2個(gè)子細(xì)胞 特點(diǎn)胞質(zhì)中重新出現(xiàn)正常結(jié)構(gòu)，紡綞體消失。新的核膜形成，染色體解螺旋化形成染色質(zhì)。胞質(zhì)分裂cytokinesis：形成特殊臨時(shí)性結(jié)構(gòu)：收縮環(huán)， 細(xì)

10、胞膜內(nèi)陷， 生成2個(gè)子細(xì)胞 。每個(gè)子細(xì)胞含有一套完整的染色體，細(xì)胞則完成一個(gè)周期，進(jìn)入下一個(gè)間期。 M期末期M期細(xì)胞的有絲分裂M期細(xì)胞的有絲分裂典型的真核生物細(xì)胞周期都有2個(gè)特征：生長(zhǎng)和細(xì)胞分裂。人迅速分裂的細(xì)胞經(jīng)整個(gè)細(xì)胞周期要24 h： G1:7 h; S :10 h; G2:4.5 h; M:0.5 h一些細(xì)胞可以暫時(shí)離開(kāi)細(xì)胞周期，進(jìn)入G0期，處于G0期的細(xì)胞不分裂，也不生長(zhǎng)。典型的真核生物細(xì)胞周期都有2個(gè)特征：生長(zhǎng)和細(xì)胞分裂。0h 4h12h 20h0h 4h細(xì)胞周期醫(yī)學(xué)知識(shí)課件第一部分：細(xì)胞周期概況： 間期：G0，G1，S，G2 分裂期：M2. 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)一些蛋白和激酶調(diào)控細(xì)胞周期 MP

11、F的發(fā)現(xiàn)：PCC：prematurely condensed chromosome 染色體超前凝集MFP：mitosis-promoting factors 細(xì)胞促分裂因子APC：anaphage promoting complex 細(xì)胞分裂后期促進(jìn)復(fù)合物第一部分：MPF的發(fā)現(xiàn)及其作用:MPF,即卵細(xì)胞促成熟因子(maturation-promoting factor),或促細(xì)胞分裂因子(mitosis-promoting factor),或M期促進(jìn)因子(M phase-promoting factor).背景一: Rao和Johnson(1970、1972、1974)將Hela細(xì)胞同步于不同

12、階段，然后與M期細(xì)胞在滅活仙臺(tái)病毒介導(dǎo)下誘導(dǎo)細(xì)胞融合，發(fā)現(xiàn)與M期細(xì)胞融合的間期細(xì)胞產(chǎn)生了形態(tài)各異的染色體凝集，稱(chēng)之為染色體超前凝集(prematurely condensed chromosome，PCC)。如圖所示:MPF的發(fā)現(xiàn)及其作用:MPF,即卵細(xì)胞促成熟因子(maturG1期PCC為單線狀，因DNA未復(fù)制;S期PCC為粉末狀，因DNA由多個(gè)部位開(kāi)始復(fù)制G2期PCC為雙線染色體DNA復(fù)制已完成PCC：染色體超前凝集這就意味著M期細(xì)胞具有某種促進(jìn)間期細(xì)胞進(jìn)行分裂的因子，稱(chēng)為細(xì)胞促分裂因子mitosis-promoting factor 。G1期PCC為單線狀，因DNA未復(fù)制;S期PCC為粉

13、末狀，G人M期細(xì)胞與袋鼠的G1、S、G2期細(xì)胞融合誘導(dǎo)PCC：同類(lèi)M期細(xì)胞可以誘導(dǎo)PCC，不同類(lèi)的M期細(xì)胞也可以誘導(dǎo)PCC產(chǎn)生:PCC：染色體超前凝集人M期細(xì)胞與袋鼠的G1、S、G2期細(xì)胞融合誘導(dǎo)PCC：同類(lèi)MPF,即卵細(xì)胞 促成熟因子(maturation-promoting factor), 或促細(xì)胞分裂因子(mitosis-promoting factor),背景二：1971年,Masui和Markert用非洲爪蟾做實(shí)驗(yàn)，明確提出了MPF這一概念。非洲爪蟾卵母細(xì)胞在其卵巢里發(fā)育，它們復(fù)制DNA，然后在G2期停滯8個(gè)月。受到雄性刺激后，卵巢細(xì)胞分泌孕酮，刺激G2期細(xì)胞進(jìn)行第一次減數(shù)分裂和第

14、二次減數(shù)分裂，停滯在第二次減數(shù)分裂中期，稱(chēng)為卵子（egg）。 實(shí)驗(yàn)：（1）取一個(gè)G2期的卵母細(xì)胞，孕酮處理，誘導(dǎo)它成熟為卵細(xì)胞。 （2）利用一微針頭將停滯在第二次減數(shù)分裂中期的卵細(xì)胞（M期）的胞漿5%轉(zhuǎn)移到另一個(gè)處于G2停滯期的卵母細(xì)胞，促進(jìn)這個(gè)卵母細(xì)胞(G2期)發(fā)育成熟。MPF,即卵細(xì)胞 促成熟因子(maturation-pro因此，在成熟卵細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中必然有一種物質(zhì)，可以誘導(dǎo)卵母細(xì)胞成熟，稱(chēng)之為促成熟因子，MPF。MPF: 卵細(xì)胞促成熟因子(maturation-promoting factor), 因此，在成熟卵細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中必然有一種物質(zhì)，可以誘導(dǎo)卵母細(xì)胞分離純化出MPF：直到198

15、8年，Maller實(shí)驗(yàn)室的Lohka等人才以非洲爪蟾為材料，分離得到了微克級(jí)的純化的MPF。證明其含有p32和p45兩種蛋白。二者結(jié)合后表現(xiàn)出蛋白激酶活性，可以使多種蛋白質(zhì)底物磷酸化。證明，MPF是一種蛋白激酶。分離純化出MPF：直到1988年，Maller實(shí)驗(yàn)室的Loh p34cdc2激酶的發(fā)現(xiàn)及其與MPF的關(guān)系：另一批生物學(xué)家以酵母為材料，從另一個(gè)側(cè)面對(duì)細(xì)胞周期調(diào)控進(jìn)行著深入研究.如：L.Hartwell以芽殖酵母為實(shí)驗(yàn)材料；如：P.Nurse 以裂殖酵母為實(shí)驗(yàn)材料。 p34cdc2激酶的發(fā)現(xiàn)及其與MPF的關(guān)系：另一批生物學(xué)P.Nurse在裂殖酵母中發(fā)現(xiàn)的cdc2基因就是第一個(gè)被分離出來(lái)的

16、cdc基因。其表達(dá)產(chǎn)物是一種相對(duì)分子量為34103的蛋白，被稱(chēng)為p34cdc2。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，p34cdc2具有激酶活性，可使多種蛋白底物磷酸化，在裂殖酵母周期調(diào)控中起關(guān)鍵性調(diào)節(jié)作用。 L.Hartwell在芽殖酵母中發(fā)現(xiàn)的cdc28基因是第二個(gè)被分離出的cdc基因，其表達(dá)產(chǎn)物也是一種相對(duì)分子量為34103的蛋白，被稱(chēng)為p34cdc28。它也是一種蛋白激酶，在G2/M轉(zhuǎn)換過(guò)程中起中心調(diào)節(jié)作用。這些與細(xì)胞分裂和周期調(diào)控有關(guān)的基因被稱(chēng)為 (cell division cycle) cdc基因，根據(jù)被發(fā)現(xiàn)的先后順序被命名。P.Nurse在裂殖酵母中發(fā)現(xiàn)的cdc2基因就是第一個(gè)被分離很快Maller

17、Nurse證明：MPF中的p34cdc28 可以被p34cdc2特異抗體所識(shí)別，并且p34cdc2可以加速M(fèi)PF活性，表明二者是同源物。p34cdc2與p34cdc28是同源物。（脊椎動(dòng)物MPF的催化亞單位是CDK1，在裂殖酵母為CDC2，芽生酵母為CDC28。）進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)： p34cdc2或p34cdc28本身并不具有激酶活性，只有當(dāng)其與有關(guān)蛋白結(jié)合后，其激酶活性才能夠表現(xiàn)出來(lái)。例如： p34cdc2必須與另一種蛋白p56cdc13結(jié)合后才具有激酶活性。很快MallerNurse證明：MPF中的p34cdc28在研究酵母的同時(shí)，以Tim Hunt為代表的另一批科學(xué)家正在以海膽卵為材料，對(duì)

18、細(xì)胞周期調(diào)控進(jìn)行著深入研究。他們發(fā)現(xiàn)：有兩種蛋白質(zhì)的含量隨細(xì)胞周期進(jìn)程的變化而變化，一般在細(xì)胞間期內(nèi)積累，在細(xì)胞分裂期內(nèi)消失，在下一個(gè)周期中又重復(fù)這一消長(zhǎng)現(xiàn)象。因此稱(chēng)這兩種蛋白為細(xì)胞周期蛋白(cyclin)。并很快被分離和克隆出來(lái)，證明其廣泛存在于從酵母到人類(lèi)等各種真核生物中，而且在功能上存在互補(bǔ)性。MallerHunt合作證明：MPF中的另一種成分是周期蛋白B。序列分析證明，周期蛋白B與酵母的p56cdc13是同源物。周期蛋白B: Cyclin B在研究酵母的同時(shí)，以Tim Hunt為代表的另一批科學(xué)家正在Cyclin B的性質(zhì)P468實(shí)驗(yàn)：卵（M期）提取物影響精子染色質(zhì)（間期）的周期改變。

19、（1）加入未經(jīng)處理的蟾蜍卵提取物，使精子染色質(zhì)存在細(xì)胞周期事件；（2）加入RNA酶水解的卵提取物，使精子染色質(zhì)未見(jiàn)細(xì)胞周期事件。（3）當(dāng)RNA酶處理卵提取物 + 野生型cyclinB mRNA，精子染色質(zhì)的周期重現(xiàn)。（4）當(dāng)加入RNA酶處理卵提取物加不能降解的cyclinB mRNA，精子染色質(zhì)致密化，核膜溶解。但有絲分裂晚期事件染色體去致密化和核膜形成都不發(fā)生。說(shuō)明： 卵提取物中Cyclin B對(duì)細(xì)胞周期必需。 且：cyclin B降解 對(duì)精子染色質(zhì)的細(xì)胞周期結(jié)束是必需的。Cyclin B的性質(zhì)P468實(shí)驗(yàn)：卵（M期）提取物影響精子Cyclin B的降解：Cyclin B的N端含有destr

20、uction box，破壞框后面有Lys殘基，結(jié)合泛素。細(xì)胞分裂后期促進(jìn)復(fù)合物（anaphase promoting complex, APC）MPF (CDC2+ cyclinB ) 活性在分裂中期達(dá)到高峰。激活A(yù)PC，cyclin B多泛素化，導(dǎo)致cyclin B降解，使MPF失活，進(jìn)入下一個(gè)周期。Cyclin B在細(xì)胞周期中連續(xù)合成，但是在有絲分裂的間期活性升高，在有絲分裂晚期突然下降。Cyclin B的降解：Cyclin B的N端含有destr由此MPF的生化成分得到確定： （催化亞單位）（調(diào)節(jié)亞單位）酵母的p56cdc13p34cdc28CDK1MPF = p34cdc2 + cyc

21、linB由此MPF的生化成分得到確定： （催化亞單位）（調(diào)節(jié)亞2001年10月8日美國(guó)人LelandHartwell、英國(guó)人Paul Nurse、TimothyHunt因?qū)?xì)胞周期調(diào)控機(jī)理的研究而榮獲諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)2001年10月8日美國(guó)人LelandHartwell、英MPF = p34cdc2 + cyclinBMPF = p34cdc2 + cyclinB細(xì)胞周期調(diào)控的主要分子機(jī)制細(xì)胞周期的內(nèi)源性調(diào)控主要是通過(guò)“Cyclins-CDKs-CKIs”這一調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。細(xì)胞周期內(nèi)源性調(diào)控Cyclins CDKs -CKIs正性調(diào)控核心負(fù)性調(diào)控CDKs（cyclin-dependent kina

22、se）CKIs（CDK inhibitor）細(xì)胞周期調(diào)控的主要分子機(jī)制細(xì)胞周期的內(nèi)源性調(diào)控主要是通過(guò)“C 第二部分3. Cyclins-CDKs-CKIs調(diào)控網(wǎng)絡(luò) Cyclins-CDKs 相互配合 Cyclins 不同時(shí)相而出現(xiàn) CDKs 不同時(shí)相 (而出現(xiàn))4. G1S期轉(zhuǎn)折5. G2M期轉(zhuǎn)折6. CKIs 第二部分3. Cyclins-CDKs-CKIs調(diào)控網(wǎng)絡(luò)Cyclins（細(xì)胞周期蛋白）對(duì)CDKs具有正性調(diào)控作用CDKs（cyclin-dependent kinase，細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶）是調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的核心CKIs（CDK inhibitor，細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶抑制因子）具有負(fù)

23、性調(diào)控作用。3. Cyclins-CDKs-CKIs調(diào)控網(wǎng)絡(luò)周期蛋白 cyclins：自1983年首次發(fā)現(xiàn)周期蛋白后，許多科學(xué)家紛紛開(kāi)展周期蛋白研究，短短10年就從各種生物中克隆分離了數(shù)十種周期蛋白，如酵母的Cln1、Cln2、Cln3、Clb1-Clb6，高等動(dòng)物的周期蛋白A1-2、B1-3、C、D1-3、E1-2、F、G、H 等等。各種周期蛋白均含有100個(gè)左右的保守氨基酸序列，稱(chēng)為周期蛋白框，它可介導(dǎo)周期蛋白cyclins與CDK結(jié)合。 周期蛋白 cyclins：自1983年首次發(fā)現(xiàn)周期蛋白后，許部分周期蛋白分子結(jié)構(gòu)特征 圖中除Cln3外，均為人的周期蛋白分子。所有這些分子均含有一個(gè)周期

24、蛋白框，結(jié)合CDK 。部分周期蛋白分子結(jié)構(gòu)特征 圖中除Cln3外，均為人的周期蛋白周期蛋白(A, B)分子的N端含有破壞框。Destruction box 的下游含lys殘基，可結(jié)合多個(gè)泛素。周期蛋白(A, B)分子的N端含有破壞框。Destructi細(xì)胞周期蛋白的破壞框與降解途徑細(xì)胞周期蛋白的破壞框與降解途徑Cyclin D，C，E等含有：PEST序列 (一個(gè)富含脯氨酸（P）、谷氨酸（E）、天冬氨酸（D）、絲氨酸(S)和蘇氨酸（T）殘基的PEST序列，與泛素結(jié)合而降解。Cyclin D，C，E等含有：PEST序列 (一個(gè)富含脯氨各種細(xì)胞周期蛋白隨特定細(xì)胞時(shí)相而出現(xiàn)。 G1早期，cyclin

25、D表達(dá)并與CDK4或CDK6結(jié)合，成為始動(dòng)細(xì)胞周期的啟動(dòng)子； G1晚期、進(jìn)入S早期后cyclin E表達(dá)，并與CDK2結(jié)合，推動(dòng)細(xì)胞進(jìn)入S期； 進(jìn)入S期后，cyclin A表達(dá)，并與CDK2結(jié)合，cyclin D、cyclin E降解； S晚期、G2早期，cyclin A表達(dá)，cyclin B表達(dá)，并與cdc2結(jié)合，促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入M期。各種細(xì)胞周期蛋白隨特定細(xì)胞時(shí)相而出現(xiàn)。細(xì)胞周期醫(yī)學(xué)知識(shí)課件Cyclins（細(xì)胞周期蛋白）對(duì)CDKs具有正性調(diào)控作用。CDKs（cyclin-dependent kinase，細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶）是調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的核心。CKIs（CDK inhibitor，細(xì)胞周期蛋

26、白依賴(lài)性激酶抑制因子）具有負(fù)性調(diào)控作用。Cyclins（細(xì)胞周期蛋白）對(duì)CDKs具有正性調(diào)控作用。CDK人們對(duì)CDK的認(rèn)識(shí)，最初是通過(guò)研究培養(yǎng)細(xì)胞和酵母細(xì)胞而得到的。目前已經(jīng)確定的CDK有：裂殖酵母中CdC2；釀酒酵母中的CdC28、PHO85、KIN28以及人類(lèi)細(xì)胞中CDK110 。是一類(lèi)重要的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，主要生物學(xué)作用是促進(jìn)細(xì)胞周期時(shí)相轉(zhuǎn)變、推進(jìn)細(xì)胞周期運(yùn)行，CDK和其調(diào)節(jié)因子又被稱(chēng)作細(xì)胞周期引擎。異?？赡軐?dǎo)致腫瘤的發(fā)生。CDK人們對(duì)CDK的認(rèn)識(shí)，最初是通過(guò)研究培養(yǎng)細(xì)胞和酵母細(xì)胞而CDK的分子量一般為3540kD，不同CDK的氨基酸組成有40%以上的同源性。典型的CDK催化亞基

27、的活性中心約由300個(gè)氨基酸殘基組成，當(dāng)處于單體或非磷酸化狀態(tài)時(shí)，CDK沒(méi)有催化活性。 CDK含有一段保守氨基酸序列-PSTAIRE，與周期蛋白cyclins的結(jié)合有關(guān)。CDK的分子量一般為3540kD，不同CDK的氨基酸組成有細(xì)胞周期醫(yī)學(xué)知識(shí)課件CDK的催化活性受到激活因素與抑制因素兩方面的調(diào)節(jié)。在激活因素中，目前認(rèn)為CDK與周期素的結(jié)合以及保守的蘇氨酸殘基的磷酸化是較為重要的兩種調(diào)節(jié)因素而在抑制因素中，CDK的 N-端氨基酸殘基的抑制性磷酸化以及抑制蛋白的結(jié)合是主要的調(diào)節(jié)因素。Regulation of CDK ActivityCDK的催化活性受到激活因素與抑制因素兩方面的調(diào)節(jié)。Regu

28、周期素的激活作用：周期素中的“周期素盒”結(jié)構(gòu)域直接和CDK的結(jié)合，并與CDK的激活相關(guān)，周期素是CDK的正性調(diào)節(jié)劑。周期素的結(jié)合與激活作用主要通過(guò)周期素在細(xì)胞周期中的濃度波動(dòng)來(lái)調(diào)控。磷酸化修飾的激活作用：CDK的激活還必須依賴(lài)于其保守的蘇氨酸殘基的磷酸化，如在人CDK1（p34cdc2）中的Thr161和CDK2中的Thr160的磷酸化，就與這兩個(gè)酶的激活相關(guān)。催化CDK1和CDK2磷酸化的酶是CAK，該酶是一種寡聚體，其催化亞基為CDK7，調(diào)節(jié)亞基為周期素H。Activation of CDK 周期素的激活作用：Activation of CDK 磷酸化修飾的抑制作用：在人的CDK1和CDK

29、2中，Thr14和Tyr15殘基的磷酸化可抑制CDK的催化活性。催化Thr14磷酸化的為蛋白激酶Wee1，使Tyr15磷酸化的是蛋白激酶Myt1。催化Thr14和Tyr15脫磷酸化的是蛋白磷酸酶CDC25。因此，蛋白激酶Wee1和Myt1及蛋白磷酸酶CDC25的相對(duì)活性，決定CDK1和CDK2的活性高低。Inhibition of CDK 磷酸化修飾的抑制作用：Inhibition of CDK細(xì)胞周期醫(yī)學(xué)知識(shí)課件Regulation of CDK ActivityCDK7Regulation of CDK ActivityCDK7抑制蛋白的抑制作用：近年來(lái)，已分離并鑒定了若干能夠與周期素-C

30、DK復(fù)合物特異性結(jié)合并抑制其活性的蛋白因子，這些蛋白因子被稱(chēng)為周期素依賴(lài)性蛋白激酶抑制蛋白（CKI）。大部分CKI都是抑癌基因的編碼產(chǎn)物。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，目前已經(jīng)確定的CKI主要有： P16INK4、P15INK4B 、P21WAF1/CIP1、P27KIP1 。P16INK4和P15INK4B 抑制CDK4,CDK6的活性。P21WAF1/CIP1、P27KIP1抑制CDK2的活性，P21WAF1/CIP1抑制CDK1的活性。抑制蛋白的抑制作用：cdc2cdc2小結(jié)：Cyclins與CDKG1期Cyclin D表達(dá)，并與CDK 4、CDK6結(jié)合，使下游的蛋白質(zhì)如Rb磷酸化，然后釋放出轉(zhuǎn)錄因

31、子E2F，促進(jìn)其他Cyclin和CDK的轉(zhuǎn)錄；在G1/S期， Cyclin E與CDK2結(jié)合，促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入S期。進(jìn)入S期后，Cyclin E降解，CDK2轉(zhuǎn)而與Cyclin A結(jié)合，推進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入G2期；在G2/M期，Cyclin B合成并與CDK1結(jié)合，導(dǎo)致染色體凝縮，核膜解體等, 促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入M期。在M期，激活后期促進(jìn)復(fù)合物APC（anaphase promoting complex），將泛素連接在Cyclin B上，導(dǎo)致Cyclin B被蛋白酶體降解、失活，結(jié)束M 期。DEAB小結(jié)：Cyclins與CDKG1期Cyclin D表達(dá)，并與 第二部分3. Cyclins-CDKs-CKIs調(diào)控

32、網(wǎng)絡(luò) Cyclins-CDKs 相互配合 Cyclins 不同時(shí)相而出現(xiàn) CDKs 不同時(shí)相而出現(xiàn)4. G1S期轉(zhuǎn)折5. G2M期轉(zhuǎn)折6. CKIs 第二部分4. G1期到S期的轉(zhuǎn)折，DNA的復(fù)制。14-3-34. G1期到S期的轉(zhuǎn)折，DNA的復(fù)制。14-3-3（一） G1期胞周期蛋白（ G1-cyclin）作用在G1期或G1/S交界期，啟動(dòng)細(xì)胞周期和促進(jìn)DNA合成的cyclin，G1期是增殖細(xì)胞唯一能接受從外界傳入的增殖或抑制增殖信號(hào)的時(shí)期。cyclin D ： cyclin D1 ，cyclinD2 ，cyclin D3 cyclin C cyclin E ：cyclin E 1，cycl

33、in E 2 Cyclin A（一） G1期胞周期蛋白（ G1-cyclin）cyclin D首先在酵母菌中被發(fā)現(xiàn)，它能激活CDK6，它有3個(gè)亞型，包括D1、D2、D3，具組織特異性。周期素D的C-端存在一個(gè)PEST序列。 N-端含有一個(gè)共同順序Leu-X-Cys-X-Glu ，是周期素D與p110Rb等蛋白結(jié)合所必需。 cyclin D1在G1中期合成達(dá)到高峰。 cyclin D1的功能主要是促進(jìn)細(xì)胞增殖。Cyclin D2峰值在G1晚期，給G1期細(xì)胞微量注射cyclin D2抗體，可使表達(dá)cyclin D2的淋巴細(xì)胞停滯在G1期。說(shuō)明： cyclin D2是細(xì)胞從G1期向S期轉(zhuǎn)移所必須的。

34、cyclin D首先在酵母菌中被發(fā)現(xiàn)，它能激活CDK6，它有不同亞型周期素D在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)模式不同，但主要是在G1期處于較高的表達(dá)水平。不同亞型周期素D在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)模式不同，但主要是在G1期處于cyclin E在cyclin D之后出現(xiàn)。 cyclin E基因及其產(chǎn)物的表達(dá)在細(xì)胞周期的G1中期上升，至G1晚期或S早期達(dá)高峰，在G1晚期發(fā)揮正調(diào)控細(xì)胞周期的作用。cyclin A：cyclin A在cyclin E之后很快表達(dá)。cyclin A是G1期向S期轉(zhuǎn)移的限速因素。cyclin E在cyclin D之后出現(xiàn)。Rb蛋白與E2F轉(zhuǎn)錄因子Rb蛋白與E2F轉(zhuǎn)錄因子Rb基因 Rb是CDK 4/6-

35、Cyclin D， CDK2-Cyclin E的底物。Rb基因位于人類(lèi)染色體13q14，其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物Rb蛋白在細(xì)胞周期中起制動(dòng)器功能。它能與轉(zhuǎn)錄因子E2F結(jié)合并阻止相應(yīng)基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)，從而抑制細(xì)胞生長(zhǎng)。 Rb (p110), Rb相關(guān)蛋白p107，p130抑制E2F的轉(zhuǎn)錄活性。Rb基因細(xì)胞周期醫(yī)學(xué)知識(shí)課件細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子（E2F ）在許多DNA合成基因和細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)控基因的啟動(dòng)子中均含有E2F的位點(diǎn)，E2F可以直接活化這些基因，啟動(dòng)DNA合成使細(xì)胞進(jìn)入S期。在E2F基因活化轉(zhuǎn)錄功能區(qū)內(nèi)有一段18個(gè)氨基酸的序列可與Rb結(jié)合，Rb通過(guò)與E2F功能區(qū)的結(jié)合遮蓋E2F功能區(qū)，抑制E2F轉(zhuǎn)錄功能，抑制DNA合成。

36、細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子（E2F ）有絲分裂原刺激G0期細(xì)胞，促進(jìn)CDK 4/6, Cyclin D, E2F 的轉(zhuǎn)錄。Cyclin D表達(dá)，并與CDK 4/6結(jié)合，使下游的蛋白質(zhì)如Rb磷酸化，然后釋放出轉(zhuǎn)錄因子E2F。E2F促進(jìn)E2F、CDK2，Cyclin E，A表達(dá)。G1晚期， CDK2，Cyclin E進(jìn)一步磷酸化更多的Rb，釋放更多的E2F，促進(jìn)更多的E2F、CDK2，Cyclin E，A表達(dá)，形成正反饋。 CDK2-Cyclin E和E2F相互正性調(diào)節(jié)。E2F的活化有絲分裂原刺激G0期細(xì)胞，促進(jìn)CDK 4/6, CyclinG1期Cyclin D表達(dá)，并與CDK 4、CDK6結(jié)合，使下游的蛋白

37、質(zhì)如Rb磷酸化，然后釋放出轉(zhuǎn)錄因子E2F，促進(jìn)其他Cyclin和CDK的轉(zhuǎn)錄；在G1/S期， cyclinE與CDK2結(jié)合，促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入S期。進(jìn)入S期后，Cyclin E降解，CDK2轉(zhuǎn)而與CyclinA結(jié)合，推進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入G2期；小結(jié)：G1期Cyclin D表達(dá)，并與CDK 4、CDK6結(jié)合，使 第二部分3. Cyclins-CDKs-CKIs調(diào)控網(wǎng)絡(luò) Cyclins-CDKs 相互配合 Cyclins 不同時(shí)相而出現(xiàn) CDKs 不同時(shí)相而出現(xiàn)4. G1S期轉(zhuǎn)折5. G2M期轉(zhuǎn)折6. CKIs 第二部分5. G2/M轉(zhuǎn)折和有絲分裂的調(diào)控5. G2/M轉(zhuǎn)折和有絲分裂的調(diào)控 G2 M期細(xì)胞周期蛋白

38、 在G2M交界期誘導(dǎo)細(xì)胞分裂的cyclin。即在G2M期轉(zhuǎn)換處發(fā)揮作用，誘導(dǎo)細(xì)胞分裂的周期素，包括周期素A、B兩種。這類(lèi)蛋白在其N(xiāo)-端含有一個(gè)降解盒，在M期通過(guò)泛素（ubiquitin）途徑降解。 cyclin A、cyclin B在M期通過(guò)泛素途徑降解，這是細(xì)胞脫離有絲分裂所必須。 G2 M期細(xì)胞周期蛋白1、cyclin A：cyclin A在cyclin E之后很快表達(dá)。cyclin A是G1期向S期轉(zhuǎn)移的限速因素，也可促進(jìn)細(xì)胞從G2期向M期的轉(zhuǎn)化。2、cyclin B：哺乳動(dòng)物cyclin B在S晚期合成，在G2期濃度升高，在M早期達(dá)到最高。能促進(jìn)G2期向M期的過(guò)渡。 1、cyclin

39、A：cyclin A在cyclin E之后cyclin A含量在S期及G2期初最高，cyclin B在G2期末含量最高；cyclin A與CDK2，CDK1結(jié)合，cyclin B與CDK1結(jié)合；cyclin A在S期發(fā)揮作用，與DNA的復(fù)制完成有關(guān)cyclin B在G2M交界期發(fā)揮作用，誘發(fā)細(xì)胞分裂及細(xì)胞分裂進(jìn)展。cyclin A、cyclin B的區(qū)別：cyclin A、cyclin B的區(qū)別：CDK磷酸化修飾的激活作用：人CDK1（p34cdc2）中的Thr161和CDK2中的Thr160的磷酸化。催化CDK1和CDK2磷酸化的酶是CAK，該酶是一種寡聚體，其催化亞基為CDK7，調(diào)節(jié)亞基為

40、周期素H。磷酸化修飾的抑制作用：人的CDK1中，Thr14和Tyr15殘基的磷酸化可抑制CDK的催化活性。催化Thr14磷酸化的為蛋白激酶Wee1，使Tyr15磷酸化的是蛋白激酶Myt1。催化Thr14和Tyr15脫磷酸化的是蛋白磷酸酶CDC25。CDK磷酸化修飾的激活作用：在G2/M期，Cyclin B合成并與CDK1結(jié)合，作用于核纖層蛋白（lamins）、驅(qū)動(dòng)蛋白（kinesin），參與DNA致密化的蛋白，泛素依賴(lài)的蛋白降解系統(tǒng)等，導(dǎo)致染色體凝縮，核膜解體等，促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入M期。CDK1的活化：當(dāng)ATP結(jié)合部位14thr和15Tyr磷酸化，抑制。 但14thr和15tyr去磷酸化，活化。CD

41、C25活化CDK1-Cyclin B，CDK1-Cyclin B活化PLK1，PLK1活化CDC25，形成正反饋。Wee1、Myt1抑制CDK1-Cyclin B。CDK1-Cyclin B活化PLK1，PLK1抑制Weel， Wee1抑制CDK1-Cyclin B 。CDC25被chk1，chk2抑制，也可因結(jié)合14-3-3而失活。DNA損傷，chk1，chk2活化，抑制CDC25，阻礙CDK1-Cyclin B，抑制細(xì)胞進(jìn)入M期。在G2/M期，Cyclin B合成并與CDK1結(jié)合，作用于核細(xì)胞周期醫(yī)學(xué)知識(shí)課件 第二部分3. Cyclins-CDKs-CKIs調(diào)控網(wǎng)絡(luò) Cyclins-CDK

42、s 相互配合 Cyclins 不同時(shí)相而出現(xiàn) CDKs 不同時(shí)相而出現(xiàn)4. G1S期轉(zhuǎn)折5. G2M期轉(zhuǎn)折6. CKIs 第二部分6. CKIs可阻止細(xì)胞通過(guò)檢驗(yàn)點(diǎn)，其作用方式是直接與CDK或cyclin-CDK復(fù)合物結(jié)合，已發(fā)現(xiàn)的CKI有p16家族和 p21家族p16家族又稱(chēng)INK4家族（inhibitors of kinase 4） P16, P15, P18, P19 特異性抑制 CDK4, CDK6。特異性抑制cdk4cyclin D1、cdk6cyclin D1復(fù)合物。P21家族又稱(chēng)CIP（CDK inhibitory protein）/KIP家族 P21, P27, P57 抑制大

43、多數(shù) CDK 活性。P21cip/waf1還能與DNA聚合酶的輔助因子PCNA結(jié)合，直接抑制DNA的合成。14-3-36. CKIs可阻止細(xì)胞通過(guò)檢驗(yàn)點(diǎn)，其作用方式是直接與CDKINK4家族的CKIINK家族的CKI包括p16(INK4a), p15(INK4b), p18(INK4c), P19(INK4d)INK4家族的蛋白識(shí)別CDK4和CDK6，但不識(shí)別CDK2，通過(guò) 與Cyclin D競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合CDK4而引起G1期停滯。1、 p16(INK4a) p16 INK4是CDK4的特異性抑制物，可與CDK4或CDK6的結(jié)合，抑制cyclin D- CDK4/6復(fù)合物的作用，競(jìng)爭(zhēng)抑制CDK4對(duì)細(xì)

44、胞生長(zhǎng)分裂的正向作用，參與抑制細(xì)胞周期G1S的轉(zhuǎn)化。 p16啟動(dòng)子甲基化是該基因沉默的主要機(jī)制。INK4家族的CKI2、p15 INKb p15位于9號(hào)染色體緊鄰p16的區(qū)域，它與p16一樣屬抑癌基因。高甲基化引起p15滅活常見(jiàn)于白血病和淋巴瘤。P15抑制CDK4/6.調(diào)節(jié)：Miz1（myc interacting zinc finger protein 1）能結(jié)合p15啟動(dòng)子的起始成分，增加p15的表達(dá)，引起細(xì)胞G1期阻滯，抑制Cyclin D的激酶活性。 c-Myc 拮抗這一作用。TGF-激活p15的表達(dá)，減少c-Myc的表達(dá)，解除c-Myc對(duì)Miz1的抑制作用，增加p15的轉(zhuǎn)錄。c-My

45、c和Max、Miz1在p15啟動(dòng)子的起始部位形成復(fù)合物，抑制p15表達(dá)。 2、p15 INKb 復(fù)制衰老復(fù)制衰老CIP/ KIPs家族的CKIs： p21、P27、p57等，CIP/ KIPs家族的CKIs： p21、P27、p57等P27/KIP1是由抑癌基因KIP1編碼合成的蛋白質(zhì)，P27抑制CDK2-Cyclin E活性，阻滯細(xì)胞與G1期。激活p27：PTEN增加p27的表達(dá)，抑制p27的泛素化，提高其穩(wěn)定性。Forkhead轉(zhuǎn)錄因子（Afx，F(xiàn)khr (FOXO1)）激活p27的轉(zhuǎn)錄。FKHR (FoxO1), a member of the FoxO subfamily of for

46、khead transcription factors, is an important target for insulin and growth factor signaling in the regulation of metabolism, cell cycle and proliferation, and survival in peripheral tissues抑制p27 ：p27啟動(dòng)子甲基化c-Myc阻礙p27與CDK2-Cyclin E的結(jié)合，間接抑制p27。Her2激活A(yù)kt，Akt結(jié)合和磷酸化p27，阻滯p27向核內(nèi)轉(zhuǎn)位。 Her2激活A(yù)kt，Akt抑制FoxO1/3，F(xiàn)

47、oxO1/3轉(zhuǎn)錄激活p21，p27。Her2間接抑制p21，p27。P27/KIP1P21/CIP1是由抑癌基因WAF1/CIP1編碼合成的蛋白質(zhì)，幾乎能與所有的周期素-CDK復(fù)合物結(jié)合，抑制其蛋白激酶活性，啟動(dòng)子上有p53結(jié)合位點(diǎn)。P21表達(dá)導(dǎo)致G1期阻滯和G2/M期阻滯。激活p21：P53轉(zhuǎn)錄激活p21.鈣調(diào)蛋白促進(jìn)p21核轉(zhuǎn)移。抑制p21 ： C-Myc抑制p21Her2激活A(yù)kt，Akt結(jié)合和磷酸化p21，阻滯p21向核內(nèi)轉(zhuǎn)位。 Her2激活A(yù)kt， Akt抑制Foxo1/3，F(xiàn)oxo1/3轉(zhuǎn)錄激活p21，p27。Her2間接抑制p21，p27。P21/CIP1細(xì)胞周期醫(yī)學(xué)知識(shí)課件14

48、-3-3P53誘導(dǎo)14-3-3表達(dá)，14-3-3可以直接提高P53的轉(zhuǎn)錄活性，形成正反饋環(huán)。14-3-3可結(jié)合cdc25，并將之輸出胞核，抑制CDK1-cyclinB的作用。14-3-3結(jié)合CDK1，并將之輸出胞核，抑制CDK1與cyclinB的結(jié)合。抑制細(xì)胞進(jìn)入M期，使細(xì)胞有更多的時(shí)間進(jìn)行DNA修復(fù)。 P57 主要抑制cyclinD2/ CDK2, cyclinE2/CDK2, cyclinA2/CDK2, 阻止細(xì)胞通過(guò)G1/ S 轉(zhuǎn)變.14-3-3P57 主要抑制cyclinD2/ CDK2,哺乳動(dòng)物至少有3 種Cdc25 同源物，分別為Cdc25A、Cdc25B 和Cdc25C。Cdc2

49、5A 主要在G1/S 期轉(zhuǎn)變中起作用，Cdc25B 在S 期被激活，進(jìn)而在細(xì)胞質(zhì)中激活CDK1/ cyclinB，活化的CDK1/ cyclinB 激活Cdc25C，通過(guò)正反饋機(jī)制調(diào)控有絲分裂。哺乳動(dòng)物至少有3 種Cdc25 同源物，分別為Cdc25A、細(xì)胞周期醫(yī)學(xué)知識(shí)課件第三部分 7.細(xì)胞周期調(diào)節(jié)的關(guān)卡checkpoint （1）G1和G2期阻滯 G1期關(guān)卡： G1期關(guān)卡反應(yīng)的二重波模型 G2期關(guān)卡： G2期關(guān)卡反應(yīng)的二重波模型 （2） S期關(guān)卡 （3）有絲分裂紡錘體關(guān)卡(spindle assembly checkpoint，SAC) 8. 細(xì)胞周期調(diào)控異常與腫瘤 9. 細(xì)胞周期調(diào)控的抗腫

50、瘤藥物第三部分7.細(xì)胞周期調(diào)節(jié)的關(guān)卡checkpoint細(xì)胞受到損害或細(xì)胞周期的前一步驟尚未完成時(shí)，細(xì)胞周期會(huì)停滯并修正這些事件；然后繼續(xù)細(xì)胞周期，這些調(diào)節(jié)機(jī)制稱(chēng)為關(guān)卡調(diào)控（check point control）。Cyclins-CDKs-CKIs”網(wǎng)絡(luò)調(diào)控細(xì)胞周期的運(yùn)行，還必須在一系列稱(chēng)為檢驗(yàn)點(diǎn)(checkpoint)的嚴(yán)格檢控下進(jìn)行的。細(xì)胞周期檢驗(yàn)點(diǎn)由感受異常事件的感受器、信號(hào)傳導(dǎo)通路和效應(yīng)器構(gòu)成。7.細(xì)胞周期調(diào)節(jié)的關(guān)卡checkpoint細(xì)胞受到損害或細(xì)胞主要檢驗(yàn)點(diǎn)包括:G1/S檢驗(yàn)點(diǎn)，S期檢驗(yàn)點(diǎn)，G2/M檢驗(yàn)點(diǎn)，紡錘體組裝檢驗(yàn)點(diǎn)(spindle assembly checkpoint

51、，SAC）。主要檢驗(yàn)點(diǎn)包括:細(xì)胞周期調(diào)控檢驗(yàn)點(diǎn)組成感受器、信號(hào)傳導(dǎo)通路、效應(yīng)器G1/SDNA是否損傷？細(xì)胞外環(huán)境是否適宜？細(xì)胞體積是否足夠大？SDNA復(fù)制是否完成？G2/MDNA是否損傷？細(xì)胞體積是否足夠大？SAC紡錘體組裝檢驗(yàn)點(diǎn)；中-后期檢驗(yàn)點(diǎn)主要檢驗(yàn)點(diǎn)細(xì)胞周期調(diào)控檢驗(yàn)點(diǎn)組成感受器、信號(hào)傳導(dǎo)通路、效應(yīng)器G1/SD一、G1和G2期阻滯當(dāng)紫外線、射線或化學(xué)修飾使DNA受到損傷，細(xì)胞停滯在G1和G2期，直到損傷得到修復(fù)。P53可使受損的DNA停滯在G1期或G2期。損傷的DNA使p53穩(wěn)定，濃度增加，激活p21，p21與CDK2-cyclinE、CDC2-cyclinB結(jié)合，使細(xì)胞停滯在G1或G2期

52、。p53促進(jìn)puma、Noxa，Bax的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。G1期關(guān)卡反應(yīng)的二重波模型（two wave model） 一開(kāi)始迅速短暫的p53非依賴(lài)的反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯，接著延緩的持續(xù)的p53-p21軸引起G1期停滯。一、G1和G2期阻滯當(dāng)紫外線、射線或化學(xué)修飾使DNA受到損 UV或IR-DNA損傷-ATM/ATR活化-Chk1，Chk2磷酸化活化-抑制CDC25活性（Cdc25磷酸化，結(jié)合泛素，而降解）毛細(xì)血管擴(kuò)張性共濟(jì)失調(diào)突變基因 ataxia-telangiectasia mutated gene, ATM). 毛細(xì)血管擴(kuò)張性共濟(jì)失調(diào)相關(guān)基因 (ataxia-telangiectas

53、ia related gene, ATR). ATM 和ATR 屬于三磷酸肌醇激酶家族的成員, 分別感應(yīng)不同形式的DNA 損傷, ATM 主要在雙鏈DNA 損傷時(shí)發(fā)揮“檢測(cè)點(diǎn)”的作用, ATR則負(fù)責(zé)感應(yīng)并傳導(dǎo)其他形式的DNA 損傷, 包括復(fù)制叉損傷、DNA 交聯(lián)等;這兩個(gè)激酶被DNA 損傷激活后, 分別磷酸化下游底物如CHK1、CHK2、p53 等,將損傷信號(hào)向下一級(jí)信號(hào)分子傳遞. UV或IR-DNA損傷-ATM/A細(xì)胞周期醫(yī)學(xué)知識(shí)課件ATM使CHK2（Thr68）磷酸化，CHk2活化促進(jìn)CDC25A的ser123, ser178,ser292磷酸化，導(dǎo)致cdc25A泛素化降解，使細(xì)胞周期停止

54、于G1期。ATM使CHK2（Thr68）磷酸化，CHk2活化促進(jìn)CDC25C的ser216磷酸化，導(dǎo)致cdc25C與14-3-3結(jié)合，運(yùn)輸至胞液。不能活化cdc2.ATM使CHK2（Thr68）磷酸化，CHk2活化促進(jìn)ATMP53在正常細(xì)胞中表達(dá)很少，且非常MDM2作為E3連接酶，介導(dǎo)p53降解。P53促進(jìn)MDM2轉(zhuǎn)錄。此負(fù)反饋回來(lái)使細(xì)胞內(nèi)MDM2/ p53比例保持恒定。MDM2（1）介導(dǎo)p53穿過(guò)核膜進(jìn)入胞漿降解，（2）抑制p53的轉(zhuǎn)錄活性。DNA損傷，ATM使MDM2（ser386,395,425,428，Thr419）磷酸化，ATR使MDM2（ser407）磷酸化，ATM磷酸化c-AB1

55、激酶，進(jìn)而磷酸化MDM2（Tyr276,394）。 MDM2磷酸化使其E3連接酶活性喪失。P53在正常細(xì)胞中表達(dá)很少，且非常MDM2作為E3連接酶，介DNA損傷，ATM使p53（ser15）磷酸化，CHk2使p53（ser20）磷酸化，ATR使p53（ser15，37）磷酸化活化。P53 （ser20， Thr18）的磷酸化可顯著降低p53-MDM2的相互作用，抑制MDM2介導(dǎo)的降解。 P53 （ser15，20， Thr18）的磷酸化可封閉p53核輸出信號(hào)區(qū)域，阻止p53被輸出核外。P300/CREB結(jié)合蛋白（CBP）使p53（lys373,382,305）乙?；?。PCAF使 p53（lys

56、320）乙?；?。 p53乙?；稍黾觩53的轉(zhuǎn)錄活性。DNA損傷，ATM使p53（ser15）磷酸化，CHk2使pG1期關(guān)卡反應(yīng)的二重波模型（two wave model） 一開(kāi)始：迅速短暫的p53非依賴(lài)的反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯： UV或IR-DNA損傷-ATM/ATR活化-Chk1，Chk2磷酸化活化-抑制CDC25A活性（Cdc25A磷酸化，結(jié)合泛素，而降解）-抑制CDK2/ cyclinE活性，抑制DNA復(fù)制前復(fù)合物，抑制DNA復(fù)制，細(xì)胞周期停滯于G1期。G1期關(guān)卡反應(yīng)的二重波模型（two wave model） 二重波模型 其次： 延緩持續(xù)的p53-p21軸引起G1期停滯。 DNA損傷

57、，ATM/ATR活化，促進(jìn)p53磷酸化活化； 或促進(jìn)Chk1磷酸化，進(jìn)而磷酸化p53 （ser15，37） 。 或促進(jìn)Chk2磷酸化，進(jìn)而磷酸化p53 （ser20） ； 并解除MDM4、MDM2對(duì)p53的抑制，使p53游離。 另外ATM磷酸化MDM2，磷酸化p53，抑制p53向胞外輸出，促進(jìn)p53在核內(nèi)發(fā)揮作用。 p53轉(zhuǎn)錄激活p21，p21結(jié)合cyclinE-CDK2，抑制其活性，促進(jìn)G1期停滯。另外，IR促進(jìn)cyclinD1的泛素化降解，使p21-cyclinD1-CDK4復(fù)合物解離，p21轉(zhuǎn)而結(jié)合cyclinE-CDK2，抑制其活性，細(xì)胞停滯于G1期。 細(xì)胞周期醫(yī)學(xué)知識(shí)課件P53與G2

58、期停滯：二重波理論同樣適用于G2期阻滯。首先：DNA損傷，ATM/ATR活化，Chk1，Chk2活化，抑制Cdc25活性（使CDC25C的ser216磷酸化，與14-3-3 結(jié)合而轉(zhuǎn)移到胞漿），抑制cyclinB-CDK1，細(xì)胞周期停滯。其次：ATM/ATR活化，促進(jìn)p53活化。P53下調(diào)CyclinB1的表達(dá)。P53促進(jìn)p21轉(zhuǎn)錄，p21抑制cyclin B-CDK1活性，使細(xì)胞停滯于G2期。P53促進(jìn) GADD45轉(zhuǎn)錄，抑制cyclin B-CDK1活性。P53誘導(dǎo)14-3-3表達(dá)，14-3-3結(jié)合CDK1并將之輸出胞核，抑制CDK1與cyclinB的結(jié)合。或結(jié)合CDC25C并將之輸出胞核

59、，抑制CDK1 活性。14-3-3蛋白可以直接提高P53的轉(zhuǎn)錄活性，形成一個(gè)正反饋環(huán)。P53與G2期停滯：細(xì)胞周期醫(yī)學(xué)知識(shí)課件二 、S期關(guān)卡 抑制DNA的合成，使 S期延長(zhǎng)，而不是永久的停滯。S期關(guān)卡是短暫現(xiàn)象。 IR-DNA斷裂-ATM活化-磷酸化Chk2-促進(jìn)Cdc25A磷酸化，并泛素化降解-抑制CDK2/Cyclin E，導(dǎo)致s期延遲。二 、S期關(guān)卡三、有絲分裂紡錘體組裝不完全導(dǎo)致細(xì)胞分裂后期停滯有絲分裂紡錘體關(guān)卡(spindle assembly checkpoint，SAC)，與MPF活性調(diào)節(jié)有關(guān)。監(jiān)測(cè)：微管與動(dòng)粒的附著、紡錘體兩極通過(guò)微管附著姐妹染色體產(chǎn)生的張力。當(dāng)關(guān)卡調(diào)控感知到有

60、絲分裂紡錘體組裝不完全時(shí)，就會(huì)防止APC多泛素化系統(tǒng)的激活。APC多泛素化系統(tǒng)激活受阻，導(dǎo)致MPF保持高活性，染色體保持致密化，核膜不能重新形成。細(xì)胞分裂后期促進(jìn)復(fù)合物（anaphase promoting complex, APC）三、有絲分裂紡錘體組裝不完全導(dǎo)致細(xì)胞分裂后期停滯細(xì)胞分裂后期第三部分 7.細(xì)胞周期調(diào)節(jié)的關(guān)卡checkpoint （1）G1和G2期阻滯 G1期關(guān)卡： G1期關(guān)卡反應(yīng)的二重波模型 G2期關(guān)卡： G2期關(guān)卡反應(yīng)的二重波模型 （2） S期關(guān)卡 （3）有絲分裂紡錘體關(guān)卡(spindle assembly checkpoint，SAC) 8. 細(xì)胞周期調(diào)控異常與腫瘤 9.