目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞醫(yī)學(xué)知識培訓(xùn)課件

1、目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞醫(yī)學(xué)知識目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞醫(yī)學(xué)知識5.1 受體細(xì)胞受體細(xì)胞(receptor cell)又稱為宿主細(xì)胞或寄主細(xì)胞(host cell)等，從實驗技術(shù)上講是能攝取外源DNA并使其穩(wěn)定維持的細(xì)胞；從實驗?zāi)康纳现v是有應(yīng)用價值和理論研究價值的細(xì)胞。2目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞醫(yī)學(xué)知識5.1 受體細(xì)胞受體細(xì)胞(receptor cell)2目作為基因工程的宿主細(xì)胞必須具備以下特性：便于重組DNA分子的導(dǎo)入；能使重組DNA分子穩(wěn)定存在于細(xì)胞中；便于重組體的篩選；遺傳性穩(wěn)定高，易于擴(kuò)大培養(yǎng)或發(fā)酵生長；安全性高，無致病性，不會對外界環(huán)境造成生物污染；有利于外源基因蛋白表達(dá)產(chǎn)物在細(xì)胞內(nèi)的積累，或

2、促進(jìn)外源基因的高效分泌表達(dá)。在遺傳密碼的應(yīng)用上無明顯偏倚性；具有較好的翻譯后加工機(jī)制，便于真核目的基因的高效表達(dá)；在理論研究和生產(chǎn)實踐上有較高的應(yīng)用價值。3目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞醫(yī)學(xué)知識作為基因工程的宿主細(xì)胞必須具備以下特性：3目的基因?qū)胧荏w細(xì)基因工程中常用的受體細(xì)胞類型：原核生物細(xì)胞真核生物細(xì)胞真菌細(xì)胞植物細(xì)胞動物細(xì)胞4目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞醫(yī)學(xué)知識基因工程中常用的受體細(xì)胞類型：4目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞醫(yī)學(xué)知識原核生物細(xì)胞優(yōu)點：大部分原核生物細(xì)胞無纖維素組成的堅硬細(xì)胞壁，便于外源DNA的進(jìn)入。沒有核膜，染色體DNA沒有固定結(jié)合的蛋白質(zhì)，為外源DNA與裸露的染色體DNA重組減少了麻煩。原核生物多為

3、單細(xì)胞生物，容易獲得一致性的實驗材料，并且培養(yǎng)簡單，繁殖迅速，實驗周期短，重復(fù)實驗快?；蚪M小，遺傳背景簡單，并且不含線粒體和葉綠體基因組，便于對引入的外源基因進(jìn)行遺傳分析。5目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞醫(yī)學(xué)知識原核生物細(xì)胞優(yōu)點：5目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞醫(yī)學(xué)知識缺點：原核生物細(xì)胞不具備真核生物的蛋白質(zhì)折疊復(fù)性系統(tǒng)，即使真核生物基因能得到表達(dá)，得到的多是無特異性空間結(jié)構(gòu)的多肽鏈。原核生物細(xì)胞缺乏真核生物的蛋白質(zhì)加工系統(tǒng)，而許多真核生物蛋白質(zhì)的生物活性正是依賴于其側(cè)鏈的糖基化或磷酸化等修飾作用。原核細(xì)胞內(nèi)源性蛋白酶易降解異源蛋白，造成表達(dá)產(chǎn)物不穩(wěn)定。6目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞醫(yī)學(xué)知識缺點：6目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞

4、醫(yī)學(xué)知識至今被用作受體菌的原核生物有大腸桿菌、枯草桿菌、藍(lán)細(xì)菌等。一、大腸桿菌受體細(xì)胞大腸桿菌屬革蘭氏陰性菌，它是目前為止研究得最為詳盡、應(yīng)用最為廣泛的原核生物種類之一，也是基因工程研究和應(yīng)用中發(fā)展最為完善和成熟的載體受體系統(tǒng)。優(yōu)點：繁殖迅速、培養(yǎng)簡便，代謝易于控制。缺點：大腸桿菌細(xì)胞間隙中含有大量的內(nèi)毒素，可導(dǎo)致人體熱原反應(yīng)。7目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞醫(yī)學(xué)知識至今被用作受體菌的原核生物有大腸桿菌、枯草桿菌、藍(lán)細(xì)菌等。7二、枯草桿菌受體細(xì)胞枯草桿菌又稱枯草芽孢桿菌，是一類革蘭氏陽性菌。優(yōu)點：枯草桿菌具有胞外酶分泌調(diào)節(jié)基因，能將具有表達(dá)的產(chǎn)物高效分泌到培養(yǎng)基中，大大簡化了蛋白表達(dá)產(chǎn)物的提取和加工處理

5、等，而且在大多數(shù)情況下，真核生物的異源重組蛋白經(jīng)枯草桿菌分泌后便具有天然的構(gòu)象和生物活性。枯草桿菌不產(chǎn)生內(nèi)毒素，無致病性，是一種安全的基因工程菌?？莶輻U菌具有芽孢形成的能力，易于保存和培養(yǎng)?？莶輻U菌也具有大腸桿菌生長迅速、代謝易于調(diào)控、分子遺傳學(xué)背景清楚等優(yōu)點。應(yīng)用：已成功的用于表達(dá)人的干擾素、白細(xì)胞介素、乙型肝炎病毒核心抗原和動物口蹄疫病毒VPI抗原等。8目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞醫(yī)學(xué)知識二、枯草桿菌受體細(xì)胞8目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞醫(yī)學(xué)知識三、藍(lán)細(xì)菌（藍(lán)藻）藍(lán)藻又稱藍(lán)綠藻或藍(lán)細(xì)菌，它含有葉綠素a(缺乏葉綠素b)和藻膽素，具有光合系統(tǒng) (PS ) 和光合系統(tǒng) (PS )、能進(jìn)行光合作用，但它又具有細(xì)菌

6、的特征，無細(xì)胞核及雙層膜結(jié)構(gòu)的細(xì)胞器，染色體裸露，是一種典型的原核生物。藍(lán)藻作為表達(dá)外源基因的受體菌兼具微生物和植物的優(yōu)點，具體表現(xiàn)在：基因組為原核型，除了裸露的染色體DNA外，不含葉綠體DNA和線粒體DNA，遺傳背景簡單，便于基因操作和外源DNA的檢測。細(xì)胞壁屬G，主要由肽聚糖組成，便于外源DNA的轉(zhuǎn)化。營光合自養(yǎng)生長，培養(yǎng)條件簡單，只需光、CO2、無機(jī)鹽、水和適宜的溫度就能滿足生長需要。多種藍(lán)藻含內(nèi)源質(zhì)粒，為構(gòu)建藍(lán)藻質(zhì)粒載體提供了極好的條件。藍(lán)藻富含蛋白質(zhì)，并且多數(shù)藍(lán)藻無毒，早已用作食物或保健品，在此基礎(chǔ)上采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，把一些重要藥物的基因轉(zhuǎn)入無毒藍(lán)藻，就可達(dá)到錦上添花的效果。9目的基因

7、導(dǎo)入受體細(xì)胞醫(yī)學(xué)知識三、藍(lán)細(xì)菌（藍(lán)藻）9目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞醫(yī)學(xué)知識真核生物細(xì)胞一、真菌受體細(xì)胞真菌是低等的真核生物，其基因結(jié)構(gòu)、表達(dá)調(diào)控機(jī)制以及蛋白質(zhì)的加工與分泌都具有真核生物的特征，因此利用真菌細(xì)胞表達(dá)高等動植物基因具有原核生物細(xì)胞無法比擬的優(yōu)點。酵母菌細(xì)胞是單細(xì)胞真核微生物，外源真核基因最理想的表達(dá)系統(tǒng)。優(yōu)點：酵母菌是結(jié)構(gòu)最為簡單的真核生物之一，其基因表達(dá)調(diào)控機(jī)理比較清楚，遺傳操作相對比較簡單。具有真核生物蛋白翻譯后修飾加工系統(tǒng)。不含有特異性病毒，不產(chǎn)生毒素。培養(yǎng)簡單，利于大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)，成本低廉。能使外源基因表達(dá)產(chǎn)物分泌至培養(yǎng)基中，便于產(chǎn)物的提取和加工。10目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞醫(yī)學(xué)知識

8、真核生物細(xì)胞一、真菌受體細(xì)胞10目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞醫(yī)學(xué)知識二、植物受體細(xì)胞優(yōu)點：全能性，即一個分離的活細(xì)胞在合適的培養(yǎng)條件下，較容易再分化成植株，這意味著一個獲得外源基因的體細(xì)胞可以培養(yǎng)出能穩(wěn)定遺傳的植株或品系。 缺點：植物細(xì)胞有纖維素參與組成的堅硬細(xì)胞壁，不利于攝取重組DNA分子?，F(xiàn)在用作轉(zhuǎn)基因受體的植物有水稻、棉花、玉米、馬鈴薯、煙草等經(jīng)濟(jì)作物和擬南芥等模式植物。 11目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞醫(yī)學(xué)知識二、植物受體細(xì)胞11目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞醫(yī)學(xué)知識三、動物受體細(xì)胞：優(yōu)點：能識別和除去外源真核基因中的內(nèi)含子，剪切和加工成熟的mRNA。真核基因的表達(dá)蛋白在翻譯后能被正確加工或修飾，產(chǎn)物具有較好的

9、蛋白質(zhì)免疫原性，約為酵母細(xì)胞的1620倍。易被重組DNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，具有遺傳穩(wěn)定性和可重復(fù)性。經(jīng)轉(zhuǎn)化的動物細(xì)胞可將表達(dá)產(chǎn)物分泌到培養(yǎng)基中，便于提純和加工，成本低。缺點：組織培養(yǎng)技術(shù)要求高，難度較大。目前用作基因轉(zhuǎn)移的受體動物主要有豬，羊、牛、魚等經(jīng)濟(jì)動物和鼠、猴等實驗動物，主要用途在于大規(guī)模表達(dá)生產(chǎn)天然狀態(tài)的復(fù)雜蛋白質(zhì)或動物疫苗、動物品種的遺傳改良及人類疾病的基因治療等。常用的動物受體細(xì)胞有小鼠L細(xì)胞、Hele細(xì)胞、猴腎細(xì)胞和中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO)等。以動物細(xì)胞，尤其是哺乳動物細(xì)胞作為受體細(xì)胞的優(yōu)點。 12目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞醫(yī)學(xué)知識三、動物受體細(xì)胞：12目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞醫(yī)學(xué)知識5.2.

10、1 重組質(zhì)粒DNA分子轉(zhuǎn)化大腸桿菌轉(zhuǎn)化：重組質(zhì)粒DNA分子通過與膜蛋白結(jié)合進(jìn)入受體細(xì)胞，并在受體細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定維持和表達(dá)的過程稱之為轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化現(xiàn)象最早是由Griffith于1928年在肺炎雙球菌中發(fā)現(xiàn)的。 5.2 重組DNA分子轉(zhuǎn)入原核生物細(xì)胞13目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞醫(yī)學(xué)知識5.2.1 重組質(zhì)粒DNA分子轉(zhuǎn)化大腸桿菌5.2 重組D目 錄14目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞醫(yī)學(xué)知識目 錄14目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞醫(yī)學(xué)知識細(xì)菌轉(zhuǎn)化的本質(zhì)是受體菌直接吸收來自供體菌的游離DNA片段，即轉(zhuǎn)化因子，并在細(xì)胞中通過遺傳交換將之組合到自身的基因組中，從而獲得供體菌的相應(yīng)遺傳性狀的過程。15目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞醫(yī)學(xué)知識細(xì)菌轉(zhuǎn)化的

11、本質(zhì)是受體菌直接吸收來自供體菌的游離DNA片段，即以革蘭氏陽性細(xì)菌為例，細(xì)菌轉(zhuǎn)化的一種可能機(jī)制包括如下基本步驟：細(xì)菌感受態(tài)的形成。當(dāng)轉(zhuǎn)化因子接近細(xì)菌細(xì)胞時受體細(xì)胞分泌一種小分子質(zhì)量的激活蛋白，又稱為感受因子，能誘導(dǎo)使細(xì)菌胞壁部分溶解，局部暴露出細(xì)胞膜上的DNA結(jié)合蛋白和核酸酶等，此時細(xì)菌細(xì)胞處于感受態(tài)，極易接納周圍環(huán)境中轉(zhuǎn)化因子以實現(xiàn)轉(zhuǎn)化。 16目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞醫(yī)學(xué)知識以革蘭氏陽性細(xì)菌為例，細(xì)菌轉(zhuǎn)化的一種可能機(jī)制包括如下基本步驟轉(zhuǎn)化因子的吸收。受體菌細(xì)胞膜上的DNA結(jié)合蛋白可與轉(zhuǎn)化因子的雙鏈DNA結(jié)構(gòu)持異性結(jié)合，然后激活鄰近的核酸酶，將雙鏈DNA分子中的一條鏈逐步降解，同時將另一條鏈逐步轉(zhuǎn)

12、移到受體菌內(nèi)。 17目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞醫(yī)學(xué)知識轉(zhuǎn)化因子的吸收。受體菌細(xì)胞膜上的DNA結(jié)合蛋白可與轉(zhuǎn)化因子整合復(fù)合物前體的形成。進(jìn)入受體細(xì)胞的單鏈DNA與另一種游離的蛋白因子結(jié)合，形成整合復(fù)合物前體，它能有效地保護(hù)單鏈DNA免受各種胞內(nèi)核酸酶的降解，并將其引導(dǎo)至受體菌染色體DNA處。 18目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞醫(yī)學(xué)知識整合復(fù)合物前體的形成。進(jìn)入受體細(xì)胞的單鏈DNA與另一種游離 單鏈DNA轉(zhuǎn)化因子的整合。整合復(fù)合物前體中的單鏈DNA片段可以通過同源重組，置換受體細(xì)胞染色體DNA的同源區(qū)域形成異源雜合雙鏈DNA結(jié)構(gòu)。 19目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞醫(yī)學(xué)知識 單鏈DNA轉(zhuǎn)化因子的整合。整合復(fù)合物前體中的單鏈

13、DNA片轉(zhuǎn)化子的形成。受體菌染色體組進(jìn)行復(fù)制，雜合區(qū)段亦隨之進(jìn)行半保留復(fù)制，當(dāng)細(xì)胞分裂后，該染色體發(fā)生分離，形成一個新的轉(zhuǎn)化子。20目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞醫(yī)學(xué)知識轉(zhuǎn)化子的形成。受體菌染色體組進(jìn)行復(fù)制，雜合區(qū)段亦隨之進(jìn)行半大腸桿菌是一種革蘭氏陰性菌，自然條件下很難進(jìn)行轉(zhuǎn)化，其主要原因是轉(zhuǎn)化因子的吸收較為困難。在基因工程研究和應(yīng)用中，轉(zhuǎn)化受體菌細(xì)胞的正是根據(jù)人們需要構(gòu)建的外源重組質(zhì)粒DNA分子，而非來自供體菌的游離DNA片段(轉(zhuǎn)化因子)。因此在大腸桿菌的轉(zhuǎn)化實驗中，很少采取自然轉(zhuǎn)化的方法，通常的做法是首先采用人工的方法制備感受態(tài)細(xì)胞，然后進(jìn)行轉(zhuǎn)化處理，其中代表性的方法之一是Ca2+誘導(dǎo)的大腸桿菌轉(zhuǎn)化

14、法。21目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞醫(yī)學(xué)知識大腸桿菌是一種革蘭氏陰性菌，自然條件下很難進(jìn)行轉(zhuǎn)化，其主要原（1） Ca2+誘導(dǎo)的大腸桿菌轉(zhuǎn)化法Ca2+誘導(dǎo)DNA對大腸桿菌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化的可能原因：在0的Cacl2低滲溶液中，細(xì)菌細(xì)胞發(fā)生膨脹，同時Cacl2使細(xì)胞膜磷脂層形成液晶結(jié)構(gòu)，促使細(xì)胞外膜與內(nèi)膜間隙中的部分核酸酶解離開來，誘導(dǎo)大腸桿菌形成感受態(tài)。Ca2+能與加入的DNA分子結(jié)合，形成抗DNA酶(DNase)的羥基-磷酸鈣復(fù)合物，并黏附在細(xì)菌細(xì)胞膜的外表面上。當(dāng)42熱刺激短暫處理細(xì)菌細(xì)胞時，細(xì)胞膜的液晶結(jié)構(gòu)發(fā)生劇烈擾動，并隨之出現(xiàn)許多間隙，為DNA分子提供了進(jìn)入細(xì)胞的通道。 22目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞醫(yī)學(xué)

15、知識（1） Ca2+誘導(dǎo)的大腸桿菌轉(zhuǎn)化法Ca2+誘導(dǎo)DNA對大腸23目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞醫(yī)學(xué)知識23目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞醫(yī)學(xué)知識該法重復(fù)性好。操作簡便快捷，適用于成批制備感受態(tài)細(xì)胞。對這種感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化，每g質(zhì)粒DNA可以獲得51062l07個轉(zhuǎn)化茵落，完全可以滿足質(zhì)粒的常規(guī)克隆的需要。 24目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞醫(yī)學(xué)知識該法重復(fù)性好。操作簡便快捷，適用于成批制備感受態(tài)細(xì)胞。對這種Mg2+對DNA分子有很大的穩(wěn)定性作用，因此利用Mgcl2與Cacl2共同處理大腸桿菌細(xì)胞，可以提高DNA的轉(zhuǎn)化效率。如利用二甲基亞砜(DMSO)和二硫蘇糖醇(DDT)等進(jìn)一步處理細(xì)胞，能誘導(dǎo)高頻感受態(tài)細(xì)胞的形成，

16、轉(zhuǎn)化效率可提高1001000倍，且對大小質(zhì)粒分子均可進(jìn)行有效的轉(zhuǎn)化。但該法要求條件高，對外界污染物極為敏感，通常很少采用。 25目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞醫(yī)學(xué)知識Mg2+對DNA分子有很大的穩(wěn)定性作用，因此利用Mgcl2與DNA分子進(jìn)入大腸桿菌受體細(xì)胞的機(jī)制 一般認(rèn)為只有雙鏈閉環(huán)或開環(huán)的質(zhì)粒DNA分子才能轉(zhuǎn)化，而線形DNA分子不能獲得轉(zhuǎn)化子。因此，環(huán)狀DNA分子中混雜線形DNA分子，會影響環(huán)狀DNA分子的轉(zhuǎn)化效率。也有人認(rèn)為吸附在受體細(xì)胞表面上的是雙鏈DNA，但卻以單鏈DNA進(jìn)入細(xì)胞，這與革蘭氏陽性菌的轉(zhuǎn)化過程相似。26目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞醫(yī)學(xué)知識DNA分子進(jìn)入大腸桿菌受體細(xì)胞的機(jī)制 一般認(rèn)為只有雙

17、鏈閉環(huán)或轉(zhuǎn)化處理過程中，可能感染雜菌，導(dǎo)致假陽性轉(zhuǎn)化子的出現(xiàn)，因此須設(shè)以下幾種對照處理： DNA對照處理。轉(zhuǎn)化處理液中用0.2ml無菌水代替0.2m1感受態(tài)細(xì)胞，檢驗DNA溶液是否染菌。 感受態(tài)細(xì)胞對照處理。轉(zhuǎn)化處理液中用0.1mlNTE緩沖液代替0.1m1DNA溶液，檢驗感受態(tài)細(xì)胞是否染菌。 感受態(tài)細(xì)胞有效性對照處理。在0.2ml感受態(tài)細(xì)胞中加入0.1ml已知容易轉(zhuǎn)化這種感受態(tài)細(xì)胞的質(zhì)粒DNA。 27目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞醫(yī)學(xué)知識轉(zhuǎn)化處理過程中，可能感染雜菌，導(dǎo)致假陽性轉(zhuǎn)化子的出現(xiàn)，因此須（2）電穿孔轉(zhuǎn)化法基本原理：利用高壓電脈沖作用，在大腸桿菌細(xì)胞膜上進(jìn)行電穿孔(electro porati

18、on)形成可逆的瞬間通道，從而促進(jìn)外源DNA的有效吸收。 電穿孔轉(zhuǎn)化法的效率受電場強(qiáng)度、電脈沖時間和外源DNA濃度等參數(shù)的影響，通過優(yōu)化這些參數(shù)，每ugDNA可以得到1091010轉(zhuǎn)化子。研究表明，當(dāng)電場強(qiáng)度和脈沖時間的組合方式導(dǎo)致5070細(xì)菌死亡時，轉(zhuǎn)化水平達(dá)到最高。 28目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞醫(yī)學(xué)知識（2）電穿孔轉(zhuǎn)化法基本原理：利用高壓電脈沖作用，在大腸桿菌細(xì)用于電穿孔轉(zhuǎn)化法的細(xì)胞處理要比感受態(tài)細(xì)胞的制備容易得多當(dāng)細(xì)菌生長到對數(shù)中期后予以冷卻、離心，然后用低鹽緩沖液充分清洗降低細(xì)胞懸浮液的離子強(qiáng)度，并用10甘油重懸細(xì)胞，使其細(xì)胞濃度為3l010個m1。分裝，在干冰上速凍后置于70貯存。這樣，

19、每小份細(xì)胞融解后即可用于轉(zhuǎn)化，有效期達(dá)6個月以上。 電穿孔轉(zhuǎn)化須在低溫下(04)進(jìn)行，轉(zhuǎn)化效率要比在室溫下操作提高約100倍。 29目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞醫(yī)學(xué)知識用于電穿孔轉(zhuǎn)化法的細(xì)胞處理要比感受態(tài)細(xì)胞的制備容易得多當(dāng)細(xì)（3）三親本雜交接合轉(zhuǎn)化大腸桿菌簡稱為三親本雜交轉(zhuǎn)移法，是基于非接合型質(zhì)粒的遷移作用而建立的一種DNA轉(zhuǎn)化方式適用于那些難以采用Ca2+誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化法或電穿孔法轉(zhuǎn)化的受體菌。 非接合型質(zhì)粒分子較小，缺少編碼質(zhì)粒轉(zhuǎn)移體系所須的全部基因，不能象接合型質(zhì)粒那樣在宿主細(xì)胞間自我轉(zhuǎn)移。但如果在宿主細(xì)胞中存在另外一種溶合性的接合型質(zhì)粒（即輔助質(zhì)粒），非接合型質(zhì)粒通常也會被轉(zhuǎn)移，這種由共存的接合型

20、質(zhì)粒引發(fā)的非接合型質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移過程稱為遷移作用。 30目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞醫(yī)學(xué)知識（3）三親本雜交接合轉(zhuǎn)化大腸桿菌簡稱為三親本雜交轉(zhuǎn)移法，是基接合型質(zhì)粒分子較大，自我轉(zhuǎn)移的隨意性強(qiáng)，轉(zhuǎn)移過程中經(jīng)常伴隨著宿主細(xì)胞染色體的高頻轉(zhuǎn)移，因此難以作為基因工程載體使用。目前常用的質(zhì)粒載體多是在非接合型質(zhì)?；蛉笔Я私雍限D(zhuǎn)移基因的接合型質(zhì)粒的基礎(chǔ)上構(gòu)建的，故重組質(zhì)粒DNA分子也不能直接接進(jìn)行接合轉(zhuǎn)化而只能通過其遷移作用來完成。31目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞醫(yī)學(xué)知識接合型質(zhì)粒分子較大，自我轉(zhuǎn)移的隨意性強(qiáng)，轉(zhuǎn)移過程中經(jīng)常伴隨著首先將具有接合轉(zhuǎn)化功能的輔助質(zhì)粒轉(zhuǎn)移至含有重組質(zhì)粒的供體細(xì)胞中，然后將這種供體細(xì)胞與受體細(xì)胞進(jìn)行

21、混合，促使兩者發(fā)生接合轉(zhuǎn)化作用，將重組質(zhì)粒導(dǎo)入受體細(xì)胞。整個接合轉(zhuǎn)化過程涉及到3種有關(guān)的細(xì)菌菌株，即待轉(zhuǎn)化的受體菌、含有要轉(zhuǎn)化的重組質(zhì)粒DNA的供體菌和含有廣泛宿主的輔助質(zhì)粒的輔助菌，因此稱為三親本雜交接合轉(zhuǎn)化法。32目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞醫(yī)學(xué)知識首先將具有接合轉(zhuǎn)化功能的輔助質(zhì)粒轉(zhuǎn)移至含有重組質(zhì)粒的供體細(xì)胞33目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞醫(yī)學(xué)知識33目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞醫(yī)學(xué)知識（4）轉(zhuǎn)化率的計算及其影響因素 轉(zhuǎn)化率是指DNA分子轉(zhuǎn)化受體菌獲得轉(zhuǎn)化子的效率，有兩種表示方式：一是以轉(zhuǎn)化子數(shù)與用于轉(zhuǎn)化處理的DNA分子數(shù)或質(zhì)量的比率表示；二是以轉(zhuǎn)化子數(shù)與用于轉(zhuǎn)化處理的受體細(xì)胞數(shù)的比率表示。 用每單位質(zhì)量的DNA

22、分子獲得的轉(zhuǎn)化子數(shù)來表示，難以反映分子大小與轉(zhuǎn)化率之間的關(guān)系。 34目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞醫(yī)學(xué)知識（4）轉(zhuǎn)化率的計算及其影響因素 轉(zhuǎn)化率是指DNA分子轉(zhuǎn)化受體以用于轉(zhuǎn)化處理的受體細(xì)胞數(shù)為基數(shù)來計算轉(zhuǎn)化率，首先必須通過菌液OD值測定或細(xì)菌計數(shù)，計算出用于制備感受態(tài)細(xì)胞的受體菌總數(shù)。然后計算轉(zhuǎn)化子與受體菌的比率。 35目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞醫(yī)學(xué)知識以用于轉(zhuǎn)化處理的受體細(xì)胞數(shù)為基數(shù)來計算轉(zhuǎn)化率，首先必須通過菌影響轉(zhuǎn)化率的因素分子質(zhì)量較小的重組質(zhì)粒DNA分子轉(zhuǎn)化率較高，分子質(zhì)量較大的重組質(zhì)粒DNA分子轉(zhuǎn)化率較低，對于大于30kb的重組質(zhì)粒則很難進(jìn)行轉(zhuǎn)化。 組成重組DNA分子的載體類型及其構(gòu)型。與受體細(xì)胞親

23、和性較強(qiáng)的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化率要高于親和性較弱的質(zhì)粒載體，而處于自然雙螺旋閉環(huán)結(jié)構(gòu)的質(zhì)粒載體比開環(huán)結(jié)構(gòu)成線性結(jié)構(gòu)的質(zhì)粒載體有更高的轉(zhuǎn)化率。經(jīng)體外酶切、酶連操作后的載體DNA或重組DNA分子由于空間構(gòu)象難以恢復(fù)，轉(zhuǎn)化率一般要比具有超螺旋結(jié)構(gòu)的質(zhì)粒低兩個數(shù)量級。重組DNA分子的濃度和純度。在10ng100u1以下的DNA濃度范圍內(nèi)，轉(zhuǎn)化效率與DNA分子數(shù)成正比關(guān)系。 36目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞醫(yī)學(xué)知識影響轉(zhuǎn)化率的因素分子質(zhì)量較小的重組質(zhì)粒DNA分子轉(zhuǎn)化率較高，同一重組質(zhì)粒DNA分子轉(zhuǎn)化不同的受體菌細(xì)胞，轉(zhuǎn)化率不同受體細(xì)胞的選擇對于重組DNA分子的轉(zhuǎn)化也是極為重要。 前述三種轉(zhuǎn)化方法中，最佳轉(zhuǎn)化率以電穿孔法

24、最高（1081010）；Ca2+誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化法居中（107108）；而三親本雜交轉(zhuǎn)移法最低（104105），但它適于前兩種方法難以轉(zhuǎn)化的受體菌。 37目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞醫(yī)學(xué)知識同一重組質(zhì)粒DNA分子轉(zhuǎn)化不同的受體菌細(xì)胞，轉(zhuǎn)化率不同受在轉(zhuǎn)化操作方而，受體細(xì)胞的預(yù)處理或感受態(tài)細(xì)胞的制備對轉(zhuǎn)化率影響最大。如Ca2+誘導(dǎo)大腸桿菌轉(zhuǎn)化法，菌齡、Cacl2處理時間、感受態(tài)細(xì)胞的保存期以及熱激時間均是重要的影響因素。電穿孔轉(zhuǎn)化法中，對受體細(xì)胞進(jìn)行冰凍甘油預(yù)處理后的轉(zhuǎn)化率，要比不經(jīng)此預(yù)處理的轉(zhuǎn)化率高10100倍。 38目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞醫(yī)學(xué)知識在轉(zhuǎn)化操作方而，受體細(xì)胞的預(yù)處理或感受態(tài)細(xì)胞的制備對轉(zhuǎn)化率影5.2

25、.2 重組噬菌體DNA分子轉(zhuǎn)導(dǎo)大腸桿菌 將重組噬菌體DNA分子直接導(dǎo)入受體細(xì)胞中的過程，稱為轉(zhuǎn)染。 將重組噬菌體DNA分子導(dǎo)入大腸桿菌受體細(xì)胞的常規(guī)方法是轉(zhuǎn)導(dǎo)操作。轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduction)是指通過噬菌體(病毒)顆粒感染宿主細(xì)胞的途徑把外源DNA分子轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞內(nèi)的過程。 39目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞醫(yī)學(xué)知識5.2.2 重組噬菌體DNA分子轉(zhuǎn)導(dǎo)大腸桿菌 將重組噬具有感染能力的噬菌體顆粒除含有噬菌體DNA分子外，還包括外被蛋白。以噬菌體顆粒感染受體細(xì)胞，首先必須對重組A噬菌體DNA分子進(jìn)行體外包裝 。體外包裝，是指在體外模擬噬菌體DNA分子在受體細(xì)胞內(nèi)發(fā)生的一系列特殊的包裝反應(yīng)過程，將重組噬

26、菌體DNA分子包裝為成熟的具有感染能力的噬菌體顆粒的技術(shù)。 40目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞醫(yī)學(xué)知識具有感染能力的噬菌體顆粒除含有噬菌體DNA分子外，還包括基本原理，根據(jù)噬菌體DNA體內(nèi)包裝的途徑，分別獲得缺失D包裝蛋白的噬菌體突變株和缺失E包裝蛋白的噬菌體突變株。這兩種突變株均不能單獨地包裝噬菌體DNA，但將它們分別感染大腸桿菌，從中提取缺失D蛋白的包裝物（含E蛋白)和缺失E蛋白的包裝物(含D蛋白)，兩者混合后就能包裝噬菌體DNA。 41目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞醫(yī)學(xué)知識基本原理，根據(jù)噬菌體DNA體內(nèi)包裝的途徑，分別獲得缺失D包噬菌體DNA體外包裝的主要過程制備包裝物。 首先，須培養(yǎng)兩種溶原菌 第二，誘導(dǎo)

27、溶菌生長 第三，收集和貯存包裝物。體外包裝。制備噬菌體DNA混合液。第一次包裝。包裝物剛?cè)诨瘯r，細(xì)胞發(fā)生破裂，釋放出包裝物可立即用于包裝。 第二次包裝。進(jìn)行第二次包裝，可提高包裝效率25倍，加入蛋白酶可降低包裝反應(yīng)液的黏度，便于包裝反應(yīng)的進(jìn)行。去除細(xì)胞屑。第二次包裝后，在反應(yīng)液中加入SM溶液和氯仿，混勻后離心去除碎屑。上清液中含活的噬菌體顆粒。42目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞醫(yī)學(xué)知識噬菌體DNA體外包裝的主要過程制備包裝物。 42目的基因經(jīng)過體外包裝的噬菌體顆?？梢愿腥具m當(dāng)?shù)氖荏w菌細(xì)胞，并將重組噬菌體DNA分子高效導(dǎo)入細(xì)胞中。在良好的體外包裝反應(yīng)條件下，每g野生型的噬菌體DNA可形成108109的pf

28、u。對于重組的噬菌體DNA，包裝后的成斑率要比野生型的有所下降，但仍可達(dá)到106107pfu，完全可以滿足構(gòu)建真核基因組基因文庫的要求。43目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞醫(yī)學(xué)知識經(jīng)過體外包裝的噬菌體顆粒可以感染適當(dāng)?shù)氖荏w菌細(xì)胞，并將重組5.2.3 受體細(xì)胞的選擇 野生型的大腸桿菌不是理想的受體細(xì)胞，因為自身具有的限制和修飾系統(tǒng)，另外還可能存在潛在的致病性。因此必須通過適當(dāng)?shù)恼T變手段對野生型大腸桿菌進(jìn)行遺傳性狀改造，以獲得適宜作為受體細(xì)胞的突變菌株。通常應(yīng)從以下幾個方面加以考慮：44目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞醫(yī)學(xué)知識5.2.3 受體細(xì)胞的選擇 野生型的大腸桿菌不是理想的受體限制與修飾系統(tǒng)這是導(dǎo)致外源重組DNA轉(zhuǎn)

29、化或轉(zhuǎn)導(dǎo)效率低下的主要原因之一。應(yīng)選用限制系統(tǒng)缺陷型的突變菌株作為受體細(xì)胞，以提高外源DNA分子的轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。進(jìn)一步使修飾系統(tǒng)也發(fā)生缺陷，則受體菌細(xì)胞既不能修飾，也不能限制外源DNA分子，更便于重組DNA分子的多種基因操作。 45目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞醫(yī)學(xué)知識限制與修飾系統(tǒng)這是導(dǎo)致外源重組DNA轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)效率低下的主重組系統(tǒng) 進(jìn)入野生型細(xì)胞的外源DNA分子能自發(fā)地與染色體DNA發(fā)生的體內(nèi)同源重組反應(yīng)由rec基因家族的編碼產(chǎn)物所控制。RecA蛋白能促進(jìn)DNA分子之間的同源聯(lián)會和DNA單鏈交換，recA基因的突變使大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)的遺傳重組頻率降低至10-6。recB、recC和recD基因的突變

30、也可以降低遺傳重組的發(fā)生頻率。因此受體細(xì)胞必須選擇體內(nèi)同源重組缺陷型的遺傳表型，基因型為recA-、recB-或recC-等，有些大腸桿菌突變體菌株則將三個基因同時失活。 46目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞醫(yī)學(xué)知識重組系統(tǒng) 進(jìn)入野生型細(xì)胞的外源DNA分子能自發(fā)地與染色體D易于轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)可以利用遺傳誘變技術(shù)改變受體菌細(xì)胞壁的通透性及細(xì)胞膜的特異吸附性，從而提高其轉(zhuǎn)化效率。還可以選擇能夠誘導(dǎo)形成感受態(tài)細(xì)胞的菌株作為受體菌細(xì)胞47目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞醫(yī)學(xué)知識易于轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)可以利用遺傳誘變技術(shù)改變受體菌細(xì)胞壁的通透性有明顯的選擇性差異遺傳表型差異大，可便于重組子的檢測。通常是使受體細(xì)胞呈現(xiàn)與載體所攜帶的選擇標(biāo)記

31、互補(bǔ)的遺傳性狀。如在大腸桿菌系統(tǒng)中，重組質(zhì)粒載體上多含有AMP抗性標(biāo)記基因，則所選用的受體細(xì)胞應(yīng)對這種抗生素敏感。當(dāng)重組DNA分子轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞后，載體上的標(biāo)記基因賦予受體細(xì)胞抗生素的抗性特征，據(jù)此可以區(qū)分轉(zhuǎn)化子與非轉(zhuǎn)化子。如果受體細(xì)胞具有與外源基因表達(dá)產(chǎn)物活性互補(bǔ)的遺傳特征可以直接篩選到外源基因表達(dá)的轉(zhuǎn)化細(xì)胞。 48目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞醫(yī)學(xué)知識有明顯的選擇性差異遺傳表型差異大，可便于重組子的檢測。通常感染寄生缺陷型從安全的角度上考慮，受體細(xì)胞不能具有感染寄生性。 49目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞醫(yī)學(xué)知識感染寄生缺陷型從安全的角度上考慮，受體細(xì)胞不能具有感染寄生5.2.4 重組DNA分子轉(zhuǎn)入真核細(xì)胞 5

32、.2.4.1重組DNA分子導(dǎo)入植物細(xì)胞（1）農(nóng)桿菌介導(dǎo)的Ti質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化法 農(nóng)桿菌是一類土壤習(xí)居菌，革蘭氏染色呈陰性，能感染雙子葉植物和裸子植物，對絕大多數(shù)單子葉植物無侵染能力。 具有趨化性的農(nóng)桿菌移向這類植物受傷細(xì)胞，并將其Ti質(zhì)粒上的T-DNA的轉(zhuǎn)移至細(xì)胞內(nèi)部。根據(jù)這一性質(zhì)，將待轉(zhuǎn)移的目的基因組入Ti質(zhì)粒載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)進(jìn)入植物細(xì)胞，與染色體DNA整合，得以穩(wěn)定維持或表達(dá)。 50目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞醫(yī)學(xué)知識5.2.4 重組DNA分子轉(zhuǎn)入真核細(xì)胞 5.2.4.1重組用于植物基因轉(zhuǎn)化操作的受體通常稱為外植體。選擇適宜的外植體是成功進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化的首要條件，而外植體的選擇主要是依據(jù)受體細(xì)胞的轉(zhuǎn)

33、化能力來決定的。目前作為基因轉(zhuǎn)化的外植體材料非常廣泛，涉及到植物的各個組織、器官和部位。 51目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞醫(yī)學(xué)知識用于植物基因轉(zhuǎn)化操作的受體通常稱為外植體。選擇適宜的外植體是選擇合適的轉(zhuǎn)化外植體優(yōu)先考慮葉片、子葉、胚軸等作為外植體材料。要注意外植體的年齡，應(yīng)選擇轉(zhuǎn)化能力較強(qiáng)的幼期外植體，同時還要考慮其最佳感受態(tài)時期。轉(zhuǎn)化外植體易于組織培養(yǎng)，并有較強(qiáng)的再生能力。應(yīng)考慮外植體中易被轉(zhuǎn)化的分生組織感受態(tài)細(xì)胞所在的部位及其數(shù)量。切割外植體時應(yīng)盡可能地暴露分生組織細(xì)胞，增加農(nóng)桿茵與分生組織的接種面積。 52目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞醫(yī)學(xué)知識選擇合適的轉(zhuǎn)化外植體優(yōu)先考慮葉片、子葉、胚軸等作為外植體材農(nóng)桿

34、菌接種操作 外植體的農(nóng)桿菌接種就是把農(nóng)桿菌接種到外植體的損傷切面。通常采用較低的菌液OD值和較短的浸泡時間來進(jìn)行外植體的接種。 將接種農(nóng)桿菌后的外植體培養(yǎng)在誘導(dǎo)愈傷組織或不定芽固體分化培養(yǎng)基上，隨著外植體的細(xì)胞分裂和生長，農(nóng)桿菌在外植體切口面也進(jìn)行著增殖生長，故該培養(yǎng)過程稱之為農(nóng)桿菌與外植體的共培養(yǎng)。由于農(nóng)桿菌的附著侵染、T-DNA的轉(zhuǎn)移及整合都是在共培養(yǎng)時期內(nèi)完成，因此共培養(yǎng)技術(shù)條件的掌握是整個轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。其中共培養(yǎng)時間對轉(zhuǎn)化率有著很大影響， 53目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞醫(yī)學(xué)知識農(nóng)桿菌接種操作 外植體的農(nóng)桿菌接種就是把農(nóng)桿菌接種到外植體的與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)后的外植體表面及淺層組織中常常共生有大量

35、農(nóng)桿菌，對外植體的正常生長會產(chǎn)生不利影響，必須進(jìn)行脫菌培養(yǎng)以殺死和抑制農(nóng)桿菌的生長。脫菌培養(yǎng)是指把共培養(yǎng)后的外植體轉(zhuǎn)移到含有抗生素的培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)生長的過程。目前使用最多的是頭孢霉素。最后，還須將外植體轉(zhuǎn)移至篩選培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，篩選出被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，經(jīng)再分化培養(yǎng)成再生植株。 54目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞醫(yī)學(xué)知識與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)后的外植體表面及淺層組織中常常共生有大量農(nóng)桿菌針對不同的外植體以及不同的轉(zhuǎn)化目的而建立多種轉(zhuǎn)化方法，主要包括葉盤轉(zhuǎn)化法、植株接種共轉(zhuǎn)化法、植物愈傷組織共培養(yǎng)轉(zhuǎn)化法、植物懸浮細(xì)胞共培養(yǎng)轉(zhuǎn)化法和原生質(zhì)體共培養(yǎng)轉(zhuǎn)化法等。55目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞醫(yī)學(xué)知識針對不同的外植體以及不同的轉(zhuǎn)化

36、目的而建立多種轉(zhuǎn)化方法，主要包整體植株接種轉(zhuǎn)化法：人為地在整體植株上造成創(chuàng)傷部位，然后把農(nóng)桿菌接種在創(chuàng)傷表面，或用針頭把農(nóng)桿菌注射到植株體內(nèi)、使農(nóng)桿菌按照天然的感染過程在植株體內(nèi)進(jìn)行侵染，獲得轉(zhuǎn)化的植物愈傷組織或轉(zhuǎn)基因植株。56目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞醫(yī)學(xué)知識整體植株接種轉(zhuǎn)化法：人為地在整體植株上造成創(chuàng)傷部位，然后把原生質(zhì)體共培養(yǎng)轉(zhuǎn)化法即取含重組Ti質(zhì)粒的農(nóng)桿菌同剛剛再生出新細(xì)胞壁的原生質(zhì)體作短暫的共培養(yǎng)，促使農(nóng)桿菌與植物細(xì)胞之間發(fā)生遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)化。用此方法已成功地實現(xiàn)了植物細(xì)胞的體外轉(zhuǎn)化。 懸浮細(xì)胞共培養(yǎng)轉(zhuǎn)化法。此方法類似于原生質(zhì)體共培養(yǎng)轉(zhuǎn)化法，主要差別是首先建立懸浮細(xì)胞系。 57目的基因?qū)胧?/p>

37、體細(xì)胞醫(yī)學(xué)知識原生質(zhì)體共培養(yǎng)轉(zhuǎn)化法即取含重組Ti質(zhì)粒的農(nóng)桿菌同剛剛再生出 (2)DNA的直接轉(zhuǎn)移 DNA的直接轉(zhuǎn)移是指利用植物細(xì)胞的生物學(xué)特件、通過物理化學(xué)的方法將外源基因轉(zhuǎn)入受體植物細(xì)胞的技術(shù)。為克服農(nóng)桿菌介導(dǎo)法的宿主局限性，巳發(fā)展了電擊法(電穿孔法)、基因槍法(微彈轟擊法)、激光微束穿孔法、顯微注射法、脂質(zhì)體介導(dǎo)法，多聚物介導(dǎo)法、花粉管通導(dǎo)法等DNA直接轉(zhuǎn)移技術(shù)。 58目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞醫(yī)學(xué)知識 (2)DNA的直接轉(zhuǎn)移 DNA的直接轉(zhuǎn)移是指利用植物細(xì)胞的多聚物介導(dǎo)法聚乙二醇(PEG)、多聚賴氨酸、多聚鳥氨酸等是常用的協(xié)助基因轉(zhuǎn)移的多聚物，尤以PEG應(yīng)用最廣。這些多聚物和二價陽離子(如Mg

38、2+、Ca2+、Mn2+)與DNA混合，能在原生質(zhì)體表面形成沉淀顆粒，通過原生質(zhì)體的內(nèi)否噬作用而被吸收進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。 59目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞醫(yī)學(xué)知識多聚物介導(dǎo)法聚乙二醇(PEG)、多聚賴氨酸、多聚鳥氨酸等是聚乙二醇(PEG)、多聚賴氨酸、多聚鳥氨酸等都是細(xì)胞融合劑。它們可以使細(xì)胞膜之間或使DNA與膜形成分子橋，促使相互間的接觸和粘連。還可以引起膜表面電荷的紊亂，干擾細(xì)胞間的識別，從而有利于細(xì)胞膜間的融合和外源DNA進(jìn)入原生質(zhì)體。本法中線性DNA比環(huán)形DNA有更高的轉(zhuǎn)化效率，而單鏈DNA又比雙鏈DNA更為有效。這與質(zhì)粒DNA分子對大腸桿菌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化完全相反。 60目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞醫(yī)學(xué)知識聚乙

39、二醇(PEG)、多聚賴氨酸、多聚鳥氨酸等都是細(xì)胞融合劑。電穿孔轉(zhuǎn)化法細(xì)胞膜的基本成分是磷脂雙分子層，在適當(dāng)?shù)耐饧与妷鹤饔孟拢?xì)胞膜有可能被擊穿，但不會導(dǎo)致細(xì)胞致命的傷害，當(dāng)移去外加電壓后，被擊穿的膜孔可被修復(fù)。 61目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞醫(yī)學(xué)知識電穿孔轉(zhuǎn)化法細(xì)胞膜的基本成分是磷脂雙分子層，在適當(dāng)?shù)耐饧与娂す馕⑹┛邹D(zhuǎn)化法此方法是利用直徑很小，能量很高的激光微束能引起細(xì)胞膜可逆性穿孔的原理，在熒光顯微鏡下找出合適的細(xì)胞，然后用激光光源替代熒光光源，聚焦后發(fā)出激光微束脈沖，造成膜穿孔，處于細(xì)胞周圍的外源DNA分子隨之進(jìn)入細(xì)胞。這種利用激光微束照射受體細(xì)胞實現(xiàn)外源DNA直接導(dǎo)入、整合和表達(dá)的技術(shù)稱之為

40、激光微束穿孔轉(zhuǎn)化法。激光微束穿孔轉(zhuǎn)化法的優(yōu)點：操作簡便快捷；基因轉(zhuǎn)移效率高；無宿主限制，可適用于各種動植物細(xì)胞、組織、器官的轉(zhuǎn)化操作，并且由于激光微束直徑小于細(xì)胞器，可對線粒體和葉綠體等細(xì)胞器進(jìn)行基因操作。但該法需要昂貴的儀器設(shè)備；技術(shù)條件要求高；穩(wěn)定性和安全性等都不如電穿孔法和基因槍法。 62目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞醫(yī)學(xué)知識激光微束穿孔轉(zhuǎn)化法此方法是利用直徑很小，能量很高的激光微束顯微注射法利用顯微注射儀，通過機(jī)械方法把外源DNA直接注入細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核的基因轉(zhuǎn)化方法。 這一技術(shù)的關(guān)鍵是原生質(zhì)體或具壁細(xì)胞或細(xì)胞團(tuán)的固定。由于動物細(xì)胞具有獨特的貼壁生長待性，因此不存在固定細(xì)胞的問題，這為動物細(xì)胞的顯

41、微注射創(chuàng)造了十分有利條件，也是動物細(xì)胞能廣泛使用該技術(shù)的原因之一。但是，對植物細(xì)胞而言，首先必須建立固定細(xì)胞技術(shù)，然后才能進(jìn)行定位顯微注射操作。 63目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞醫(yī)學(xué)知識顯微注射法利用顯微注射儀，通過機(jī)械方法把外源DNA直接注入超聲波介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法利用低音強(qiáng)脈沖超聲波的物理作用，可逆性地?fù)舸┘?xì)胞膜并形成過膜通道，使外源DNA進(jìn)入細(xì)胞。利用超聲波處理可以避免脈沖高電壓對細(xì)胞的損傷作用，有利于原生質(zhì)體存話，是一種有潛力的轉(zhuǎn)化途徑。 64目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞醫(yī)學(xué)知識超聲波介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法利用低音強(qiáng)脈沖超聲波的物理作用，可逆性地?fù)艋驑尫ㄓ址Q微彈轟擊法，是利用高速運行的金屬顆粒轟擊細(xì)胞時能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的現(xiàn)

42、象，將包裹在金屬顆粒（鎢或金顆粒）表面的外源DNA分子隨之帶入細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)的基因轉(zhuǎn)化方法。 65目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞醫(yī)學(xué)知識基因槍法又稱微彈轟擊法，是利用高速運行的金屬顆粒轟擊細(xì)胞時脂質(zhì)體介導(dǎo)法脂質(zhì)體是由人工構(gòu)建的磷脂雙分子層組成的膜狀結(jié)構(gòu)，可以將DNA包在其內(nèi)，并通過脂質(zhì)體與原生質(zhì)體的融合或由于原生質(zhì)體的吞噬過程，把外源DNA轉(zhuǎn)運到細(xì)胞內(nèi)。優(yōu)點是包在脂質(zhì)體內(nèi)的DNA可免受細(xì)胞DNA酶降解。 66目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞醫(yī)學(xué)知識脂質(zhì)體介導(dǎo)法脂質(zhì)體是由人工構(gòu)建的磷脂雙分子層組成的膜狀結(jié)構(gòu)花粉管通道法將外源DNA涂于授粉的枝頭上，使DNA沿花粉管通道或傳遞組織通過珠心進(jìn)入胚囊，轉(zhuǎn)化還不具正常細(xì)胞壁的卵

43、、合子及早期的胚胎細(xì)胞。這一方法技術(shù)簡單，一般易于掌握，且能避免體細(xì)胞變異等問題，故有一定的應(yīng)用前景。67目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞醫(yī)學(xué)知識花粉管通道法將外源DNA涂于授粉的枝頭上，使DNA沿花粉管5.2.4.2 重組DNA分子導(dǎo)入哺乳動物細(xì)胞 68目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞醫(yī)學(xué)知識5.2.4.2 重組DNA分子導(dǎo)入哺乳動物細(xì)胞 68目的基因病毒種類多樣及病毒DNA或RNA構(gòu)建的載體性質(zhì)的各異，所以轉(zhuǎn)導(dǎo)的過程各不相同，主要有三種類型：一，帶有目的基因的病毒顆粒直接感染受體細(xì)胞，目的基因隨同病毒DNA分子整合到受體細(xì)胞染色體DNA上，這樣以后不需要再包裝成病毒顆粒。二，帶有目的基因的毒病是缺陷性的，須同另一

44、輔助病毒一起感染受體細(xì)胞在受體細(xì)胞內(nèi)包裝成新的病毒顆粒。三，雖然帶目的基因的SV40病毒是早期轉(zhuǎn)錄缺陷型的，但被感染的COS細(xì)胞系的基因組中整合有SV40早期轉(zhuǎn)錄區(qū)段DNA，所以沒有必要用輔助病毒作混合感染。 病毒顆粒轉(zhuǎn)導(dǎo)法69目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞醫(yī)學(xué)知識病毒種類多樣及病毒DNA或RNA構(gòu)建的載體性質(zhì)的各異，所以轉(zhuǎn)磷酸鈣轉(zhuǎn)染法其依據(jù)是哺乳動物細(xì)胞能捕獲黏附在細(xì)胞表面的DNA-磷酸鈣沉淀物，使DNA轉(zhuǎn)入細(xì)胞。 DNA磷酸鈣共沉淀復(fù)合物中DNA的數(shù)量、共沉淀物與細(xì)胞接觸的保溫時間、以及DMSO和甘油等促進(jìn)因子作用的持續(xù)時間均會影響DNA的轉(zhuǎn)染效率。 70目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞醫(yī)學(xué)知識磷酸鈣轉(zhuǎn)染法其依

45、據(jù)是哺乳動物細(xì)胞能捕獲黏附在細(xì)胞表面的DNDEAE-葡聚糖轉(zhuǎn)染法二乙胺乙基葡聚糖(DEAE)是一種高分子質(zhì)量的多聚陽離子試劑，能促進(jìn)哺乳動物細(xì)胞捕獲外源DNA，實現(xiàn)短時間的有效表達(dá)。 目前有關(guān)DEAE-葡聚糖的作用機(jī)制一般認(rèn)為DEAE-葡聚糖能與外源DNA形成復(fù)合物，保護(hù)DNA免受核酸酶的降解；其次是DEAE-葡聚糖可作用于受體細(xì)胞膜，增加其通透性，便于DNA進(jìn)入。 此方法簡單、重復(fù)性高，并且轉(zhuǎn)染效率高于磷酸鈣法。 71目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞醫(yī)學(xué)知識DEAE-葡聚糖轉(zhuǎn)染法二乙胺乙基葡聚糖(DEAE)是一種高聚陽離子-DMSO轉(zhuǎn)染法采用聚陽離子poly-brene處理哺乳動物細(xì)胞，增加細(xì)胞表面對D

46、NA的吸附能力、然后再用25-30DMSO短暫處理細(xì)胞，增加膜的通透性，提高對DNA的捕獲量。 72目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞醫(yī)學(xué)知識聚陽離子-DMSO轉(zhuǎn)染法采用聚陽離子poly-brene處顯微注射轉(zhuǎn)基因技術(shù)應(yīng)用顯微注射器可以把重組DNA直接注入哺乳動物細(xì)胞。用此方法轉(zhuǎn)基因的效率很高。獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)化子的數(shù)量取決于注射的DNA的性質(zhì)。 73目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞醫(yī)學(xué)知識顯微注射轉(zhuǎn)基因技術(shù)應(yīng)用顯微注射器可以把重組DNA直接注入哺電穿孔DNA轉(zhuǎn)移技術(shù)原理同植物的電穿孔轉(zhuǎn)移DNA法。在電脈沖處理之前，先用乙酰甲基秋水仙堿預(yù)處理細(xì)胞10h，可提高轉(zhuǎn)化效率3-10倍。這很可能是由于預(yù)處理導(dǎo)致中期停頓的細(xì)胞中，細(xì)胞

47、核處于無膜狀態(tài)，或者核膜具有較高的通透性所致。 74目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞醫(yī)學(xué)知識電穿孔DNA轉(zhuǎn)移技術(shù)原理同植物的電穿孔轉(zhuǎn)移DNA法。74目脂質(zhì)體介導(dǎo)法利用脂質(zhì)體介導(dǎo)法將外源DNA導(dǎo)入哺乳動物細(xì)胞具有實用潛力。由于脂質(zhì)體具有無毒、無免疫原性的特點，不僅可用于體外受體細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)化，而且可以在動物體內(nèi)將基因轉(zhuǎn)入肝細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等靶細(xì)胞或靶組織、靶器官位點，實現(xiàn)瞬間表達(dá)或穩(wěn)定表達(dá)，成為基因治療的一種有效工具。75目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞醫(yī)學(xué)知識脂質(zhì)體介導(dǎo)法利用脂質(zhì)體介導(dǎo)法將外源DNA導(dǎo)入哺乳動物細(xì)胞具5.3 重組子的篩選5.3 克隆子的篩選概念克隆子轉(zhuǎn)化子重組子76目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞醫(yī)學(xué)知識5.3

48、 重組子的篩選5.3 克隆子的篩選76目的基因?qū)胧軐z取外源DNA分子并能使該分子在其中穩(wěn)定維持的受體細(xì)胞統(tǒng)稱為克隆子。把采用各種轉(zhuǎn)化方法或轉(zhuǎn)導(dǎo)方法獲得的克隆子叫做轉(zhuǎn)化子（導(dǎo)入外源DNA分子后能穩(wěn)定存在的受體細(xì)胞稱為轉(zhuǎn)化子 ），現(xiàn)在這兩者有通用的趨向。含有重組DNA分子的克隆子被稱為重組子，如果重組子中含有外源目的基因則又稱為陽性克隆子或期望重組子 。在重組DNA分子的轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中，一般僅有少數(shù)受體細(xì)胞成為克隆子。必須采用合適的方法從大量的細(xì)胞背景中篩選出期待的克隆子。經(jīng)過各種方法將外源DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞后，獲得所需陽性克隆子的過程稱為克隆子的篩選。 77目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞醫(yī)

49、學(xué)知識將攝取外源DNA分子并能使該分子在其中穩(wěn)定維持的受體細(xì)胞統(tǒng)稱5.3.1遺傳表型直接篩選法5.3.1.1 根據(jù)載體選擇標(biāo)記初步篩選轉(zhuǎn)化子在構(gòu)建基因工程載體系統(tǒng)時，通常在載體DNA分子中組裝了一種或兩種選擇標(biāo)記基因，在受體細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行表達(dá)，呈現(xiàn)出特殊的表型或遺傳學(xué)特性，作為篩選轉(zhuǎn)化子的依據(jù)。78目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞醫(yī)學(xué)知識5.3.1遺傳表型直接篩選法5.3.1.1 根據(jù)載體選擇標(biāo)記一般的做法是將轉(zhuǎn)化處理后的受體細(xì)胞接種在合適量選擇藥物的培養(yǎng)基上，在最適生長溫度條件下培養(yǎng)一定時間，根據(jù)菌落生長情況挑選出轉(zhuǎn)化子。常用的選擇標(biāo)記基因主要是抗性基因以及表達(dá)產(chǎn)物可以發(fā)光或使反應(yīng)底物顯色的基因，相應(yīng)的選擇

50、條件是可以被抗性基因產(chǎn)物分解的抗生素和除草劑，可以使基因產(chǎn)物發(fā)光的光線，或者是可以使基因產(chǎn)物顯色的試劑。選擇培養(yǎng)基是根據(jù)宿主細(xì)胞類型配置的培養(yǎng)基，對于細(xì)菌受體細(xì)胞而言，通常用LB培養(yǎng)基，在LB培養(yǎng)基中加入適量的某種選擇物即為選擇培養(yǎng)基。選擇物是由載體DNA分子上攜帶的選擇標(biāo)記基因所決定。79目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞醫(yī)學(xué)知識79目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞醫(yī)學(xué)知識（1）抗藥性篩選80目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞醫(yī)學(xué)知識（1）抗藥性篩選80目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞醫(yī)學(xué)知識81目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞醫(yī)學(xué)知識81目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞醫(yī)學(xué)知識82目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞醫(yī)學(xué)知識82目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞醫(yī)學(xué)知識83目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞

51、醫(yī)學(xué)知識83目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞醫(yī)學(xué)知識（2）插入失活篩選法84目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞醫(yī)學(xué)知識（2）插入失活篩選法84目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞醫(yī)學(xué)知識85目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞醫(yī)學(xué)知識85目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞醫(yī)學(xué)知識86目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞醫(yī)學(xué)知識86目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞醫(yī)學(xué)知識（3）插入表達(dá)篩選法利用外源目的基因插入特定載體后能激活篩選標(biāo)記基因的表達(dá)，由此進(jìn)行轉(zhuǎn)化子的篩選。有些載體在設(shè)計時，在篩選標(biāo)記基因前面連接上一段負(fù)調(diào)控序列，當(dāng)插入失活該負(fù)調(diào)控序列時，其下游的篩選標(biāo)記基因才能表達(dá)。例如pTR262質(zhì)粒載體，它由pBR322衍生而來，其Tcr基因的上游含有一段噬菌體DNA的CI阻遏蛋白編碼基因及其

52、調(diào)控序列，CI基因表達(dá)的阻遏蛋白可以抑制Tcr基因的表達(dá)。當(dāng)外源DNA片段插入CI基因的Hin d或Bgl 位點上時，CI基因失活Tcr基因因阻礙解除而得以表達(dá)，故陽性重組子為Tcr表型而質(zhì)粒本身為Tcs表型，當(dāng)轉(zhuǎn)化細(xì)菌涂布在Tc平板上時，只有含有外源DNA插入片段的陽性重組子的轉(zhuǎn)化菌才能生長成菌落。 87目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞醫(yī)學(xué)知識（3）插入表達(dá)篩選法利用外源目的基因插入特定載體后能激活篩選（4）顯色互補(bǔ)篩選法88目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞醫(yī)學(xué)知識（4）顯色互補(bǔ)篩選法88目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞醫(yī)學(xué)知識89目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞醫(yī)學(xué)知識89目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞醫(yī)學(xué)知識lacZ 基因上缺失操縱基因區(qū)段的突

53、變體與帶有完整的近操縱基因區(qū)段的-半乳糖苷酶陰性突變體之間實現(xiàn)互補(bǔ)，這種互補(bǔ)現(xiàn)象稱為-互補(bǔ)。具有完整乳糖操縱子的菌體能轉(zhuǎn)譯-半乳糖苷酶(Z)、IPTG和X-gal時，產(chǎn)生蘭色沉淀物，使菌落成為藍(lán)色。如果在載體DNA上組入-半乳糖苷酶基因（lacZ)部分缺失的片段(lacZ)則重組DNA分子轉(zhuǎn)化lacZ互補(bǔ)型菌落，會在含有X-gal和IPTG的培養(yǎng)基中得到的轉(zhuǎn)化子是藍(lán)色菌落。90目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞醫(yī)學(xué)知識lacZ 基因上缺失操縱基因區(qū)段的突變體與帶有完整的近操縱基lac Z是-半乳糖苷酶基因部分缺失的DNA片段，含lac Z的重組載體轉(zhuǎn)化lac Z互補(bǔ)型菌株，可轉(zhuǎn)譯-半乳糖苷酶，在含有X-ga

54、l（5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷）和IPTG（異丙基-硫代半乳糖苷）的培養(yǎng)基上使轉(zhuǎn)化子成為藍(lán)色菌落，而lac Z互補(bǔ)型菌株本身為白色菌落。當(dāng)lac Z區(qū)插入外源基因后，再轉(zhuǎn)化lac Z互補(bǔ)型菌株，由于不能翻譯-半乳糖苷酶，轉(zhuǎn)化子即使在含有Xgal和IPTG的培養(yǎng)基上也只能長成白色菌落。這樣可以區(qū)分含外源基因和不含外源基因的轉(zhuǎn)化子。此方法主要用于原核生物。91目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞醫(yī)學(xué)知識lac Z是-半乳糖苷酶基因部分缺失的DNA片段，含la 互補(bǔ)的檢測92目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞醫(yī)學(xué)知識 互補(bǔ)的檢測92目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞醫(yī)學(xué)知識93目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞醫(yī)學(xué)知識93目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞醫(yī)

55、學(xué)知識以顯色劑x-gal作為選擇物時，DNA對照組不應(yīng)出現(xiàn)任何菌落，感受態(tài)細(xì)胞對照組長出的菌落應(yīng)全是藍(lán)色的，感受態(tài)細(xì)胞有效性對照組長出的菌落中應(yīng)有白色的，其中一項不符，就有可能挑出假的轉(zhuǎn)化子菌落。 94目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞醫(yī)學(xué)知識以顯色劑x-gal作為選擇物時，DNA對照組不應(yīng)出現(xiàn)任何菌落（5）利用報告基因篩選植物轉(zhuǎn)化細(xì)胞報告基因：系指其編碼產(chǎn)物能夠被快速地測定，常用來判斷外源基因是否已經(jīng)成功地導(dǎo)入寄主細(xì)胞（器官或組織）并檢測其表達(dá)活性的一類特殊用途的基因。在植物轉(zhuǎn)基因研究中，在有選擇壓力的情況下，可利用報告基因在受體細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)，從大量非轉(zhuǎn)化克隆中選擇出轉(zhuǎn)化細(xì)胞；同時，報告基因可以和某些目的

56、基因構(gòu)成嵌合基因，從報告基因的表達(dá)了解目的基因的表達(dá)情況及推測基因調(diào)控序列。常用的報告基因有抗生素抗性基因以及編碼某些酶類或其他持殊產(chǎn)物的基因等。 95目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞醫(yī)學(xué)知識（5）利用報告基因篩選植物轉(zhuǎn)化細(xì)胞報告基因：系指其編碼產(chǎn)物能新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因（npt）抗新霉素、卡那霉素、慶大霉素和G418等抗生素，成為篩選動植物轉(zhuǎn)化子的選擇標(biāo)記基因。潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因（hpt）賦予轉(zhuǎn)化子能抗潮霉素，作為選擇標(biāo)記基因主要用于篩選動植物轉(zhuǎn)化子。潮霉素是致癌物質(zhì)，操作時應(yīng)慎重。氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因（cat）也被用于篩選動植物轉(zhuǎn)化子的標(biāo)記基因。96目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞醫(yī)學(xué)知識新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因（

57、npt）抗新霉素、卡那霉素、慶大霉-葡萄糖酸酶基因（gus）gus的基因產(chǎn)物-葡萄糖酸酶（GUS）能夠催化4-甲基傘形花酮-D-葡萄糖苷酸，產(chǎn)生熒光物質(zhì)4-甲基傘形花酮，以此篩選含gus基因的轉(zhuǎn)化子。由于植物細(xì)胞GUS本底非常低，因此廣泛地應(yīng)用于篩選植物轉(zhuǎn)化子。尤其是gus基因的3端與其他結(jié)構(gòu)基因連接產(chǎn)生的嵌合基因仍能正常表達(dá)，產(chǎn)生的融合蛋白中仍有GUS活性，可用于外源基因在轉(zhuǎn)化生物體中的定位分析。97目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞醫(yī)學(xué)知識-葡萄糖酸酶基因（gus）gus的基因產(chǎn)物-葡萄糖酸酶螢火蟲熒光素酶基因（luc）luc表達(dá)產(chǎn)物螢火蟲熒光素酶（LUC）在Mg2+的作用下，可以與熒光素和ATP底物發(fā)

58、生反應(yīng)，形成與酶結(jié)合的腺苷酸熒光素?；瘡?fù)合物，經(jīng)過氧化脫羧作用后，該復(fù)合物轉(zhuǎn)變成為處于激活狀態(tài)的氧化熒光素，可以用熒光測定儀快速靈敏地檢測出產(chǎn)生的熒光，是目前研究動植物轉(zhuǎn)基因很好用的一種報告基因。Luc基因檢測十分迅速，靈敏度高，成本低，不存在放射性同位素檢測對人體健康和環(huán)境生態(tài)所造成的危害，也沒有內(nèi)源熒光產(chǎn)牛的背景干擾，因此，Luc是一種理想的報告基因。98目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞醫(yī)學(xué)知識螢火蟲熒光素酶基因（luc）luc表達(dá)產(chǎn)物螢火蟲熒光素酶（抗除草劑bar基因bar基因編碼磷化乙酰轉(zhuǎn)移酶（PAT），使轉(zhuǎn)化子對含有磷化麥黃酮（PPT）成分的除草劑具有抗性。99目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞醫(yī)學(xué)知識抗除草

59、劑bar基因bar基因編碼磷化乙酰轉(zhuǎn)移酶（PAT），冠癭堿合成酶基因主要包括胭脂堿合成酶基因和章魚堿合成基因兩類，存在于土壤農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒的T-DNA區(qū)段。冠癭堿合成酶基因在植物細(xì)胞中的表達(dá)產(chǎn)物可以催化一些特殊反應(yīng)，通過電泳分離及菲醌熒光染料染色，方便地觀察，據(jù)此作為報告基因用于轉(zhuǎn)植物基因細(xì)胞的篩選。冠癭堿合成酶基因在植物基因工程早期應(yīng)用較多，現(xiàn)已逐漸被其他更為理想的報告基因所取代。 100目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞醫(yī)學(xué)知識冠癭堿合成酶基因主要包括胭脂堿合成酶基因和章魚堿合成基因兩（6）利用遺傳選擇標(biāo)記篩選哺乳動物轉(zhuǎn)基因細(xì)胞 在植物轉(zhuǎn)基因研究中采用的氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(Cat)基因和新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(

60、Npt)基因也可用于哺乳動物轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的篩選。常用的標(biāo)記基因還有：- 胸腺核苷激酶基因（tk）、- 二氫葉酸還原酶基因（dhfr）- 次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶基因（hgprt）- 細(xì)菌的黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶基因(ecogpt)等。 101目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞醫(yī)學(xué)知識（6）利用遺傳選擇標(biāo)記篩選哺乳動物轉(zhuǎn)基因細(xì)胞 在植物轉(zhuǎn)基因研胸腺核苷激酶基因（tk）、二氫葉酸還原酶基因（dhfr）及次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶基因（hgprt）等的表達(dá)產(chǎn)物直接或間接參與核苷酸合成代謝。這些基因缺失的缺陷型細(xì)胞因核苷酸合成代謝失調(diào)而死亡，只有在添加某些核苷酸的培養(yǎng)基中才能生長。如果用這樣的缺陷型