免疫組化技術(shù)在病理診斷和研究中的應(yīng)用培訓課件

1、免疫組化技術(shù)在病理診斷和研究中的應(yīng)用免疫組化技術(shù)在病理診斷和研究中的應(yīng)用引言： 1842年BeNNeftt首先提出了“組織學”，同時virchow作了大量正常和病理組織顯微鏡研究，于1856年發(fā)表了“細胞病理學”。百余年來組織病理學進展很快，但在應(yīng)用和解釋形態(tài)學標準時仍有困難，單靠組織切片檢查有時并不能作出全面的診斷，隨之發(fā)展了特殊染色和各種組化技術(shù)，為病理診斷提供了新的參考依據(jù)。1941年由cooN等建立的熒光抗體在組織切片中檢測細胞抗原的技術(shù)，首次提供了一種根據(jù)細胞抗原及細胞產(chǎn)物來識別細胞的手段，這種手段在病理的某些領(lǐng)域，尤其是腎臟病、皮膚病的研究中取得了非常大的成功。免疫組化技術(shù)在病理診

2、斷和研究中的應(yīng)用2引言：免疫組化技術(shù)在病理診斷和研究中的應(yīng)用2 但在外科病理學中并未得到推廣，主要是由于該方法需要新鮮組織作冰凍切片，并只能獲得較少的形態(tài)學特征，這對于傳統(tǒng)的根據(jù)細胞形態(tài)學的特征，有時甚至是極細微的表現(xiàn)來識別細胞和診斷腫瘤的外科病理學家來說無疑是一大障礙。盡管熒光抗體技術(shù)并未在腫瘤研究中得到廣泛應(yīng)用，但由于其簡便而快速的特點，在腎小球腎炎、皮膚病的研究中仍發(fā)揮著重要的作用。免疫組化技術(shù)在病理診斷和研究中的應(yīng)用3 但在外科病理學中并未得到推廣，主要是由于該方法 1966年NakaNe和Averameas等建立了免疫酶標技術(shù)，1970年seerNberger等人發(fā)展了一種過氧化物酶

3、抗過氧化物酶(PAP)技術(shù)，1975年Kohler和MilsteiN建立了雜交瘤制備單克隆抗體技術(shù)，這些對于外科病理的發(fā)展是一個重大的技術(shù)里程碑。隨著辣根過氧化物酶代替熒光素異硫氰酸鹽，作為初級抗體的標記物，一種全新的信號分子得到了應(yīng)用，在辣根過氧化物酶中加入顯色的底物進行染色，產(chǎn)生一種能被普遍光鏡所觀察的穩(wěn)定顯色反應(yīng)。酶免疫組化法對于病理學家診斷腫瘤、對其分類、判斷預(yù)后產(chǎn)生了巨大的影響，同時也擴展了人們對于各種疾病與腫瘤形成過程的認識，提高了病理診斷與研究水平。 免疫組化技術(shù)在病理診斷和研究中的應(yīng)用4 1966年NakaNe和Averameas等一、 免疫組化技術(shù) 利用能與特異性抗體結(jié)合的酶

4、，在酶-抗體-抗原反應(yīng)的位點上誘導(dǎo)通過底物或顯色劑而完成的變色反應(yīng)。辣根過氧化物酶是免疫酶學的原型，其它酶系統(tǒng)如葡萄糖氧化酶，堿性磷酸酶也被成功應(yīng)用。 免疫組化技術(shù)在病理診斷和研究中的應(yīng)用5一、 免疫組化技術(shù) 免疫組化技術(shù)在病理診斷和研究中的應(yīng)用5酶橋法： 利用酶聯(lián)抗體將酶與組織切片中抗原相結(jié)合，通過與適當?shù)孜锓磻?yīng)（通常是H2O2）以及二氨基聯(lián)苯胺(diamiNobeNzidiNe DAB)的顯色劑，產(chǎn)生一種不溶性棕色反應(yīng)產(chǎn)物。該法已被進一步改進發(fā)展為更敏感的多級橋聯(lián)法，后者利于增加在抗原部位反應(yīng)產(chǎn)物的沉積。 免疫組化技術(shù)在病理診斷和研究中的應(yīng)用6酶橋法：免疫組化技術(shù)在病理診斷和研究中的應(yīng)用6

5、 PAP法是過氧化物酶-抗過氧化物酶(PAP)復(fù)合物，包括辣根過氧化物酶抗體，及辣根過氧化物酶抗原組成的可溶性復(fù)合物為五環(huán)狀結(jié)構(gòu)，3個分子辣根過氧化物酶和二個抗體分子組成，極為穩(wěn)定，比免疫熒光法敏感100-1000倍，比酶橋法敏感20倍，其原理是特異性初級抗體（一抗）的Fab段與組織抗原結(jié)合，二抗（橋抗）在一抗與PAP復(fù)合物之間形成分子橋聯(lián)，此時一抗與PAP中的免疫球蛋必須是同一種屬，以使得衍生自其它種屬的二抗，對一抗分子PAP中的FC段及穩(wěn)定成份都具有特異性。免疫組化技術(shù)在病理診斷和研究中的應(yīng)用7 PAP法是過氧化物酶-抗過氧化物酶(PAP) 由于免疫酶學技術(shù)普遍使用辣根過氧化物酶，因此組織

6、切片中內(nèi)源性過氧化物酶一開始就必須用H2O2或H2O2和甲醇組成的混合物加以滅活，并通過與橋抗同一種屬來源的非免疫稀釋血清阻斷非特異性結(jié)合，足夠的橋抗使所有游離抗原結(jié)合位點都能與PAP復(fù)合物連接，并在加入PAP可溶性復(fù)合物到組織切片中反應(yīng)之前洗去未結(jié)合的橋抗，最后使PAP復(fù)合物與底物及顯色劑反應(yīng)， 以產(chǎn)生能被普通光鏡所見到的不溶性棕色產(chǎn)物，以此識別組織切片中抗原所在的位置。免疫組化技術(shù)在病理診斷和研究中的應(yīng)用8 由于免疫酶學技術(shù)普遍使用辣根過氧化物酶，因免疫組化技術(shù)在病理診斷和研究中的應(yīng)用9免疫組化技術(shù)在病理診斷和研究中的應(yīng)用9 免疫酶學技術(shù)還包括堿性磷酸酶-抗堿性磷酸酶(APA-AP)系統(tǒng)2

7、 及葡萄糖氧化酶抗葡萄糖氧化酶（GAG)系統(tǒng)等，這些技術(shù)與PAP技術(shù)相似，只不過是將堿性磷酸酶或葡萄糖氧化酶代替辣根過氧化物酶而已，據(jù)稱這兩種技術(shù)可以減少背景染色的干擾，因為相應(yīng)的內(nèi)源性酶在組織中分布有限，尤其是APA -AP技術(shù)更適用于血液標本染色。免疫組化技術(shù)在病理診斷和研究中的應(yīng)用10 免疫酶學技術(shù)還包括堿性磷酸酶-抗堿性磷酸酶 生物素是一種低分子量的維生素，可以與一抗共價結(jié)合。親合素是一種從卵白素中提取的具有4 個生物素結(jié)合位點的糖蛋白，這一特性能使之成為多級免疫酶學系統(tǒng)各成分之間的橋接物。1981年Hsu 等人建立了卵白素-生物素-過氧化物酶(AvidiN BiotiN-peroxi

8、dase Complex ABC)系統(tǒng)。該方法是通過生物素相關(guān)的次級抗體將一抗連接到卵白素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物上，結(jié)果產(chǎn)生的復(fù)合物是一種點陣樣、三維構(gòu)造的復(fù)合物，有助于將多個辣根過氧化物酶分子結(jié)合于切片中的一個抗原所在的位點上，因此比PAP法更靈敏，約比PAP法敏感8-40倍，特異性強、非特異性背景著色低、方法簡便、應(yīng)用廣。 免疫組化技術(shù)在病理診斷和研究中的應(yīng)用11 生物素是一種低分子量的維生素，可以與一抗共 ABC系統(tǒng)通過將鏈球菌抗生物素蛋白代替抗生物素蛋白而得到進一步改進，稱為鏈球菌抗生物素蛋白-生物素系統(tǒng)(StreptavidiN biotiN system SAB)。鏈球菌抗生物

9、素蛋白在生理PH環(huán)境中為電中性，而不產(chǎn)生非特異性結(jié)合，而抗生物素蛋白在生理PH環(huán)境中帶正電荷。應(yīng)用抗生物素蛋白-生物素法時，內(nèi)源性生物素能與抗生物素蛋白-過氧化物酶復(fù)合物直接結(jié)合而產(chǎn)生非特異性或稱假陽性染色，避免的方法可先通過切片與游離抗生物素蛋白反應(yīng)以去除游離生物素。 免疫組化技術(shù)在病理診斷和研究中的應(yīng)用12 ABC系統(tǒng)通過將鏈球菌抗生物素蛋白代替抗生物免疫組化技術(shù)在病理診斷和研究中的應(yīng)用13免疫組化技術(shù)在病理診斷和研究中的應(yīng)用13免疫組化技術(shù)在病理診斷和研究中的應(yīng)用14免疫組化技術(shù)在病理診斷和研究中的應(yīng)用14 葡萄球菌A蛋白(Staphylococcal proteiN A SPA)是金黃

10、色葡萄球菌細胞壁上的一種蛋白成分， 單鏈多肽，分子量為42000，SPA最大的特點是能與不同種屬血清中免疫球蛋白分子穩(wěn)定FC段結(jié)合，此外還能與其它物質(zhì)如熒光素、過氧化物酶、鐵蛋白、膠體金等結(jié)合，并不影響其生物活性，因此被用來發(fā)展為一種簡便而迅速的免疫過氧化物酶法，即用SPA代替PAP技術(shù)中的次級抗體，因SPA可與多種動物的抗血清反應(yīng)，而不需因不同種動物而制備相應(yīng)的第二抗體。SPA可以結(jié)合大多數(shù)IgG分子，可以充當?shù)谝豢贵w和衍生自不同種屬的抗過氧化物酶抗體的橋接物即SPA-過氧化物酶聯(lián)法。同時由于SPA與FC段的高親和力可以減少非特異性背景染色。 免疫組化技術(shù)在病理診斷和研究中的應(yīng)用15 葡萄球

11、菌A蛋白(Staphylococca 金屬離子和金屬蛋白復(fù)合物如鐵蛋白、金和汞可作為免疫組化反應(yīng)中的標記物，如免疫金銀法 (ImmuNogold silver techNique IGST)。其基本原理是用特異性抗體與抗原反應(yīng)，隨后用金標記的間接抗體或SPA蛋白，再與特異性抗體結(jié)合，用乳酸銀處理，使銀顆粒沉積在金顆粒上，還原銀反應(yīng)而顯示出黑褐色。適用于石蠟切片，冰凍切片，培養(yǎng)細胞，細胞涂片和樹脂包埋的電鏡切片，該法敏感性高，可檢測組織中微量抗原，定位準確，無擴散現(xiàn)象，背景清晰，對比度好，方法簡便。 免疫組化技術(shù)在病理診斷和研究中的應(yīng)用16 金屬離子和金屬蛋白復(fù)合物如鐵蛋白、金和汞可免疫組化技術(shù)

12、在病理診斷和研究中的應(yīng)用17免疫組化技術(shù)在病理診斷和研究中的應(yīng)用17 美國抗體公司新近又推出“二步法”系統(tǒng)，清除了與內(nèi)源性生物素的非特異性結(jié)合，具有靈敏度高，無背景，步驟少，節(jié)省時間等諸多優(yōu)點，其原理是通過一個葡聚糖分子，將多個抗小鼠或抗兔的二抗同多個辣根過氧化物酶(HRP)或堿性磷酸酶(AP)聚合在一起。由于葡聚糖分子較大，其每個骨架可以結(jié)合多達100個酶分子和 20 個抗體分子，因此大大提高了檢測的靈敏度， 又由于二抗和酶合二為一，其測定過程至少比SBA/ABC法少一個步驟。另外無需阻斷內(nèi)源性生物素，所以血清封閉這一步可以省去。 免疫組化技術(shù)在病理診斷和研究中的應(yīng)用18 美國抗體公司新近又

13、推出“二步法”系統(tǒng)，清除免疫組化技術(shù)在病理診斷和研究中的應(yīng)用19免疫組化技術(shù)在病理診斷和研究中的應(yīng)用19免疫組化技術(shù)在病理診斷和研究中的應(yīng)用20免疫組化技術(shù)在病理診斷和研究中的應(yīng)用20 原位雜交也稱為“雜交組織化學”(HydridizatioN Histochmistry) 是在單個細胞水平上提供了形態(tài)學定位特異性DNA或RNA順序，DNA二條鏈之間以堿基的氫鍵相連，而四種堿基均按嚴格的互補規(guī)律結(jié)合成對(T或U-A,C-G)，DNA經(jīng)變性處理堿基間氫鍵發(fā)生斷裂，雙鏈DNA 可解離成單鏈，終止變性處理后，DNA可恢復(fù)雙鏈結(jié)構(gòu)，因而利用標記已知核苷酸序列DNA片斷作為探針，按堿基配對的互補原則去檢

14、測組織切片中的DNA或RNA。 免疫組化技術(shù)在病理診斷和研究中的應(yīng)用21 原位雜交也稱為“雜交組織化學”(Hydrid免疫組化技術(shù)在病理診斷和研究中的應(yīng)用22免疫組化技術(shù)在病理診斷和研究中的應(yīng)用22 二、 顯色劑 在各種免疫組化顯色劑中，3.3-二氨基聯(lián)苯胺(DAB)是目前用得最多的，它的棕色反應(yīng)產(chǎn)物清晰可見，且不溶于酒精，因此適用于多種抗體染色及固定介質(zhì)中，但DAB具有致癌性。3-氨基-9-乙基卡巴唑(AEC)為紅色終產(chǎn)物，溶于酒精，使用該顯色劑時需要一種特殊的含水固定介質(zhì)，其反應(yīng)產(chǎn)物不穩(wěn)定，在貯存過程中密度逐漸降低。與DAB一樣AEC也具有致癌性8，因此沒有足夠的理由將其作為DAB的替代物

15、。免疫組化技術(shù)在病理診斷和研究中的應(yīng)用23 二、 顯色劑 免疫組化技術(shù)在病理診斷和 其它的顯色劑如4-氯-1-萘酚為蘭色的終產(chǎn)物，溶于酒精、鹽酸對苯二胺/焦性兒萘酚，形成蘭黑色終末產(chǎn)物，不溶于酒精。四甲基聯(lián)苯胺、-萘酚和同香草醛酸，它們的作用是在有H2O2存在的情況下，由氫化物酶介導(dǎo)其產(chǎn)生氧化誘導(dǎo)反應(yīng)，產(chǎn)生一種沉積于組織中抗體-酶復(fù)合物位置上可見的氧化產(chǎn)物。免疫組化技術(shù)在病理診斷和研究中的應(yīng)用24 其它的顯色劑如4-氯-1-萘酚為蘭色的終產(chǎn)物，免疫組化技術(shù)在病理診斷和研究中的應(yīng)用25免疫組化技術(shù)在病理診斷和研究中的應(yīng)用25三、試劑 免疫組化質(zhì)量好壞的重要因素之一是所應(yīng)用的第一抗體的質(zhì)量，單克隆

16、抗體有很強的特異性，不同的批號之間差異不大，由于它們主要是針對抗原表位，而不是整個抗原，所以單克隆抗體較常規(guī)多克隆抗體敏感性低。事實上有些單克隆抗體，尤其是作用于細胞表面抗原的，也許只與低溫，恒溫切片中的未固定細胞反應(yīng)，因此這種單抗的應(yīng)用受到限制。 免疫組化技術(shù)在病理診斷和研究中的應(yīng)用26三、試劑 免疫組化技術(shù)在病理診斷和研究中的應(yīng)用26 第一抗體有時與商標說明并不相同。因此每個實驗室須將新購的抗體進行測試，一般可在多組織塊(即由20-30種不同瘤組織組成的復(fù)合物）中進行測試。 試劑最佳濃度的確定受到固定方法、時間、組織處理過程的影響，最佳濃度在不同實驗室是不同的，最合適的稀釋度是以得到最大強

17、度的特異性染色和最弱的背景染色為標準。免疫組化技術(shù)在病理診斷和研究中的應(yīng)用27 第一抗體有時與商標說明并不相同。因此每個實驗室 在診斷性免疫組化中的質(zhì)量控制是個重要問題。美國生物染色委員會成立了一個專家小組，以負責檢測商品抗體的程序，這是質(zhì)量控制的保證手段，并使附屬商品以及商品試劑信息標準化，美國食品及藥品管理局（FDA)通過美國病理學會批準出臺一項政策，列出了61種在一些嚴重疾病的診斷和/ 或監(jiān)測中充分標準的單克隆抗體，并要求制造商自政策發(fā)表之日起的30個月內(nèi)向FDA提交合適的產(chǎn)品使用申請，在此期間產(chǎn)品雖被允許用于醫(yī)學目的在市場銷售，但制造商們必須在產(chǎn)品上標明“未經(jīng)法律批準，暫時供應(yīng)以滿足重

18、要的醫(yī)學目的”。 免疫組化技術(shù)在病理診斷和研究中的應(yīng)用28 在診斷性免疫組化中的質(zhì)量控制是個重要問題。美國 此外，制造商及進口商將負責保證通知所有實驗室中的醫(yī)生及相關(guān)人員。制造商們必須確保在30個月內(nèi)給出產(chǎn)品的安全性及效能的數(shù)據(jù),否則將從市場上消失。FDA的這些限制是針對外科病理學檢驗中所應(yīng)用的試劑，但其含意明顯延伸到免疫組化中應(yīng)用的試劑。關(guān)于是否有必要區(qū)別應(yīng)用于免疫組化，流式細胞儀，以及外科病理檢驗中的抗體，當同種抗體應(yīng)用于不同目的時其抗體的標準及范圍的討論仍在繼續(xù)，免疫組化方法的標準化，如組織準備，染色時段等，使各實驗室之間標準化與進行比較是十分困難的，自動化染色便能很好的解決這個問題，自

19、動化染色可使各實驗室間標準統(tǒng)一。但是免疫組化方法中重要的一點是組織固定與處理的方法在各實驗室間區(qū)別甚大，以致于即使實現(xiàn)自動化也很難達到標準統(tǒng)一，自動化將實現(xiàn)實驗室內(nèi)部標準化，使定量技術(shù)如密度分析得以實現(xiàn)。免疫組化技術(shù)在病理診斷和研究中的應(yīng)用29 此外，制造商及進口商將負責保證通知所有實驗室中 抗體保存在不吸附蛋白質(zhì)的材料中，如儲存抗體中蛋白濃度很低時（10-100mg/l），應(yīng)另加隔離蛋白，以減少容器對抗體蛋白的吸附，隔離蛋白常用0.1%-1.0%的牛血清白蛋白。絕大多數(shù)已稀釋的抗體應(yīng)保存在4-8的條件下，以免凍融對抗體蛋白產(chǎn)生有害的效應(yīng)。抗體原液和已分離的免疫球蛋白組分應(yīng)保存于-20條件，避

20、免反復(fù)凍融。冷凍的抗體溶液應(yīng)置于室溫中緩慢地解凍，應(yīng)絕對避免用高溫快速解凍。被細菌污染的抗體常會出現(xiàn)假陽性結(jié)果，為了防止細菌污染，可在抗體溶液中加入0.01%疊氮鈉?？贵w經(jīng)真空冷凍干燥后置-20以下可以保存2-3年，保存稀釋后的單抗應(yīng)加入0.1%疊氮鈉。大多數(shù)稀釋抗體不可進行冷凍保存，多數(shù)抗體可能會丟失抗原活性，多數(shù)抗體只要蛋白濃度適當，可在4下保存數(shù)月。免疫組化技術(shù)在病理診斷和研究中的應(yīng)用30 抗體保存在不吸附蛋白質(zhì)的材料中，如儲存抗體中蛋白濃度 四、免疫組化增強染色方法，可采取幾種形式 不溶性氧顯色劑產(chǎn)物的可見度可通過金屬離子或有機化合物增強。例如將免疫染色切片浸泡于0.5硫酸銅溶液、0.

21、125%四氧化鋨、1氯化鈷、 或1 硫酸鎳銨中，可以根據(jù)使用不同溶液而改變其反應(yīng)產(chǎn)物的顏色以增加可見度12, 但并不提高免疫染色的靈敏度。在應(yīng)用黑白顯微攝影技術(shù)時，這些方法較有效，如鋨的黑色能增強與蘇木素，甲基綠或鈷蘭綠等背景染色形成強烈對比 。免疫組化技術(shù)在病理診斷和研究中的應(yīng)用31 四、免疫組化增強染色方法，可采取幾種形式免疫組化技術(shù) 其它技術(shù)如用咪唑也可以實現(xiàn)免疫染色增強，由辣根過氧化物酶介導(dǎo)DAB 的過氧化反應(yīng)可以被多種含氮化合物增強，咪唑是最有效的一種。另一項免疫染色增強技術(shù)尤其適用于組織內(nèi)抗原數(shù)量很低時，重復(fù)使用初級抗體，開始抗體孵育過程很短，接著PBS沖洗，然后再次與同一濃度的初

22、級抗體進行反應(yīng)，并在4“孵育”過夜，這一過程也可以顛倒即先一抗4孵育過夜（或室溫下）然后PBS洗，再次反應(yīng)。免疫組化技術(shù)在病理診斷和研究中的應(yīng)用32 其它技術(shù)如用咪唑也可以實現(xiàn)免疫染色增強，由辣 五、免疫組化中的固定，這也是免疫組化好壞的關(guān)鍵 有證據(jù)表明目前石蠟包埋處理的組織減少了可以檢測的抗原數(shù)量15。 、冰凍組織 在新鮮冰凍組織中細胞表面抗原及其它組織抗原，僅需極少量組織即可被檢測到，而在常規(guī)操作及蠟塊包埋時這些抗原可能完全丟失。所以新鮮組織冰凍切片仍是抗原保存的金標準。 未被冰凍的組織必須立即固定，以免變干，否則抗原將“失活”。若抗原長期暴露于固定劑后將被毀掉，因此用于免疫組化目的的組織

23、，應(yīng)盡可能短時間固定，即刻包埋。免疫組化技術(shù)在病理診斷和研究中的應(yīng)用33 五、免疫組化中的固定，這也是免疫組化好壞的關(guān)鍵免疫組 、醛固定劑 甲醛是診斷實驗室中被廣泛應(yīng)用的固定劑，組織在10緩沖甲醛中，保存很長的時間仍可保持令人滿意的細胞形態(tài)，但長時間固定于甲醛中絕對是免疫組化不值得提倡的，抗原的保存量與固定時間負相關(guān)。很多種普通組織抗原在持續(xù)固定后丟失。非腫瘤組織的多組織塊固定于甲醛3天后，抗原染色密度顯著下降，7天后大多數(shù)抗原丟失。VimeNtiN和DismiN即使固定于甲醛中一天也會丟失很多。特別是尸檢組織常固定較長時間，影響免疫組化結(jié)果。因此要想獲得多種抗原的滿意結(jié)果，固定時間最好不要超

24、過6-8小時。免疫組化技術(shù)在病理診斷和研究中的應(yīng)用34 、醛固定劑 免疫組化技術(shù)在病理診斷和研究 、非交聯(lián)固定劑 不同的固定劑對抗原有不同的保存結(jié)果，如Carroy 溶液(60乙醇、30 氯仿、10冰醋酸)，methacarN(60甲醇、30氯仿、10醋酸）和95乙醇更適合于檢測組織中的VimeNtiN。BouiN 溶液能較好保存N肽及生物胺。重金屬固定劑如B5和ZeNker溶液更適合于一些核抗原的免疫組化檢測，但這些固定液常使背景染色增加，對于環(huán)境又是一個有毒的污染物。 免疫組化技術(shù)在病理診斷和研究中的應(yīng)用35 、非交聯(lián)固定劑 免疫組化技術(shù)在病理診斷和研 過碘酸鹽-賴氨酸副甲醛溶液能氧化糖類

25、，產(chǎn)生交聯(lián)、穩(wěn)定脂質(zhì)和蛋白，并保留形態(tài)的完整，較適合于淋巴細胞膜抗原的保存。并較適用于雌激素受體蛋白的免疫染色。 當固定劑中含有酸性物質(zhì)時最易導(dǎo)致抗原的丟失，可能是蛋白質(zhì)三級，四級結(jié)構(gòu)受損，因此使用中性或接近于生理PH值的固定劑可獲得最滿意的形態(tài)及抗原保存效果。因此現(xiàn)在提倡使用緩沖甲醛固定液。 免疫組化技術(shù)在病理診斷和研究中的應(yīng)用36 過碘酸鹽-賴氨酸副甲醛溶液能氧化糖類，產(chǎn)生交 細胞涂片的固定100% 的乙醇最為常用，在免疫染色準備中通常是先用乙醇固定爾后脫落細胞巴氏染色。SuthipiNtawoNg等發(fā)現(xiàn)將空氣干燥的涂片在0.1甲醛鹽溶液中固定14小時，隨后在100乙醇溶液中10分鐘，可得

26、到組織抗原保存的最佳效果，同時還可以減少背景染色。這一種固定方法可使樣品在室溫下保存一周，或在-70中保存5周，便于涂片及細針抽吸樣品的空氣干燥，并進行實驗研究，而不必擔心固定過程中的抗原丟失。 免疫組化技術(shù)在病理診斷和研究中的應(yīng)用37 細胞涂片的固定100% 的乙醇最為常用，在免 、初級固定的微波照輻射 加熱能使蛋白質(zhì)部分變性，但加熱從未在固定劑中廣泛應(yīng)用，微波(MW) 加熱技術(shù)的出現(xiàn)克服了生物組織導(dǎo)熱性能差的限制，提供了一種清潔而快捷的產(chǎn)生穩(wěn)定熱量的方法。在過去10年微波輻射作為一種快速組織固定法而得到廣泛應(yīng)用，而且成為甲醛的優(yōu)良替代物用于細胞抗原的保存，將樣品切成2毫米厚浸泡于生理鹽水，

27、MW輻射溫度至62C，隨后組織將放在100 乙醇和氯仿或二甲苯中循環(huán)處理3.5小時，然后借助真空技術(shù)進行石蠟包埋，對于細針抽吸或內(nèi)鏡活檢材料可處理時間稍短些，約 65 分鐘左右，應(yīng)用MW代替甲醛作為固定劑及在自動處理過程中放棄使用甲醛，不僅消除了有毒和具有潛在毒性的試劑的危害，而且實現(xiàn)了從各種組織中獲得高質(zhì)量診斷切片的快捷準備措施。 免疫組化技術(shù)在病理診斷和研究中的應(yīng)用38 、初級固定的微波照輻射 免疫組化技術(shù)在 MW固定組織以保留抗原的方法明顯優(yōu)于10中性甲醛固定的組織，除了能對多種抗原的免疫染色有很好的效果外，其形態(tài)學保存效果也很出色。甲醛固定的組織從5小時起其免疫染色的程度低于相應(yīng)MW的

28、切片。MW還可以保存大量不穩(wěn)定的淋巴細胞抗原，這些抗原在甲醛固定或石蠟包埋后通常被丟失。MW 對于CytokeratiN 和DismiN 沒有影響，因此對這兩種抗原檢測，MW 的組織無需在免疫染色前進行酶的預(yù)處理。MW固定既改變了傳統(tǒng)的甲醛固定引起的污染毒性，同時它具有使石蠟組織更好保留抗原的優(yōu)點。 免疫組化技術(shù)在病理診斷和研究中的應(yīng)用39 MW固定組織以保留抗原的方法明顯優(yōu)于10 、重金屬溶液的固定 重金屬鹽如鋅鹽已被作為一種有效的蛋白沉淀劑產(chǎn)生不溶性復(fù)合物，多肽鋅甲醛作為一種固定劑可增強免疫染色。有研究表明組織固定后浸泡于硫酸鋅中也可改善免疫染色效果。據(jù)介紹鋅甲醛(1硫酸鋅，溶于3.7 非

29、緩沖甲醛中）用于自動組織處理法中較使用中性緩沖甲醛溶液能取得更好的抗原保存效果，值得注意的是它對抗原并沒有嚴重的影響與損壞19?，F(xiàn)在有加熱誘導(dǎo)抗原保存技術(shù)，因此沒有必要與足夠的理由去使用像重金屬這樣的環(huán)境污染物。 免疫組化技術(shù)在病理診斷和研究中的應(yīng)用40 、重金屬溶液的固定 免疫組化技術(shù)在病理診斷和研 六、抗原(決定簇)熱修復(fù) 組織在甲醛或其它固定液中固定會引起位于蛋白內(nèi)或蛋白間的亞甲基橋的橋連，即甲醛可使蛋白質(zhì)凝固，引起蛋白質(zhì)交聯(lián)，進而引起許多抗原決定簇被封閉，阻礙抗原抗體的結(jié)合，斷開交聯(lián)，暴露抗原決定簇，使抗原抗體充分的結(jié)合，以達到抗原修復(fù)的作用。最常用的抗原修復(fù)技術(shù)是酶消化或熱引導(dǎo)的抗原

30、決定簇的修復(fù)（heat-iNduced epitope retrieval，HIER）。Cattoretti等報道用10mmol枸椽酸鹽緩沖液(PH6.0)使用MW處理，能增加抗體稀釋度，增強染色與減少“孵育”時間，這是一種重現(xiàn)抗原的步驟，其它作者拓展了這一方法，顯示了該法對多種診斷性抗體都有效。 免疫組化技術(shù)在病理診斷和研究中的應(yīng)用41 六、抗原(決定簇)熱修復(fù)免疫組化技術(shù)在病理診斷和研 該法具體過程為，脫蠟重新水化切片置于10mmol(PH 6.0)的枸椽酸鹽緩沖液中，(2.1g -水枸櫞酸溶于900ml蒸鎦水，使用13ml 2mol NaOH調(diào)節(jié)PH至6.0）置于家用微波爐內(nèi)，將能量調(diào)至

31、最高，直至樣品沸騰，該熱溶液被棄去或用蒸鎦水再次加滿，重復(fù)以上過程，當再次達到沸點時加熱停止，切片在免疫染色前在熱緩沖液中再浸泡25分鐘，如組織曾經(jīng)固定較長時間該法可重復(fù)使用。該法用于目前的大多數(shù)診斷性抗體，能大大改善染色結(jié)果。 免疫組化技術(shù)在病理診斷和研究中的應(yīng)用42 該法具體過程為，脫蠟重新水化切片置于10m 如最常易被甲醛固定，石蠟包埋而掩蓋的抗原CD19，抗體稀釋倍后仍有染色。也有些抗原應(yīng)用此方法并不增加免疫染色，如H222克隆的ER，mPR3克隆的PgR、CD21 、CD35、Mac387、LM、IV型膠原等。有時此法聯(lián)合使用酶消化可以改善一些抗原染色。最近該法又進一步改進，將切片置

32、于枸椽酸鹽緩沖液的密閉玻璃容器中，微波輻射至沸騰，然后調(diào)節(jié)微波使緩沖液一直處于沸騰狀態(tài)10分鐘，然后在熱緩沖液中再浸泡25分鐘，可以大大增強靈敏度。 免疫組化技術(shù)在病理診斷和研究中的應(yīng)用43 如最常易被甲醛固定，石蠟包埋而掩蓋的抗原CD 使用HIER時注意兩點： 抗體孵育前每一步操作均不能使組織干燥， 加熱后放置足夠的時間，使之變涼（至少10-20分鐘），可假設(shè)為允許蛋白恢復(fù)到它自然的結(jié)構(gòu)。免疫組化技術(shù)在病理診斷和研究中的應(yīng)用44 使用HIER時注意兩點：免疫組化技術(shù)在病理診斷 除了枸櫞酸鹽緩沖液外，還有幾種“抗原重現(xiàn)”試劑EDTA，Tris-Hcl，氯化銨或商品化靶修復(fù)液。用微波輻射0.05

33、mol/L甘氨酸鹽酸(PH3.5)中的組織切片可以檢測核抗原的免疫染色，用微波輻射4M尿素中的切片，可以顯示細胞及膜表面免疫球蛋白有效23，還可以用高壓鍋、電飯煲、電爐、電水壺等代替微波爐產(chǎn)生高溫加熱，也有抗原重現(xiàn)的作用。 EDTA-HIER的作用機制是通過鈣離子的鰲合而實現(xiàn)，而且這種鰲合作用只有在堿性PH值下才起作用，枸櫞酸鹽緩沖液的作用似乎也是通過此作用。免疫組化技術(shù)在病理診斷和研究中的應(yīng)用45 除了枸櫞酸鹽緩沖液外，還有幾種“抗原重現(xiàn)”試劑酸性抗原修復(fù)液如Tris-Hcl似乎通過高濃度的氫離子離解了鈣離子復(fù)合物或打斷了福爾馬林固定產(chǎn)生的交聯(lián)而實現(xiàn)。抗原修復(fù)液中PH值也至關(guān)重要，多數(shù)抗原在

34、偏堿性PH值時效果好。對固定時間很長的非常舊的檔案資料，酸性PH值抗原修復(fù)液工作效果優(yōu)于堿性PH值的修復(fù)液。檢測細胞膜或細胞漿抗原時，應(yīng)用檸檬酸鹽（CB）或EDTA緩沖液進行微波3檔10分，效果，EDTA緩沖液作用優(yōu)于CB，但有時可出現(xiàn)背景著色。檢測細胞核抗原用CB，高氏處理較為理想，酶消化幾乎沒有作用，但這種方法對切片要求高，須防止脫片現(xiàn)象。檢測細胞外間質(zhì)抗原用酶消化好，特別是復(fù)合酶是最佳選擇。 免疫組化技術(shù)在病理診斷和研究中的應(yīng)用46酸性抗原修復(fù)液如Tris-Hcl似乎通過高濃度的氫離子離解了七、抗原保存的幾項特殊技術(shù) 、凍干 組織置于-45 10-2torr有P2O5中48小時能將組織凍

35、干，隨后進行石蠟包埋，對于保存淋巴細胞膜上不穩(wěn)定抗原有效。但該法設(shè)備特殊、昂貴，組織干、硬、脆、切片后的形態(tài)學效果差。 免疫組化技術(shù)在病理診斷和研究中的應(yīng)用47七、抗原保存的幾項特殊技術(shù)免疫組化技術(shù)在病理診斷和研究中的應(yīng) 、丙酮和丙酮-甲基苯甲酸鹽-二甲苯(AMEX法) 丙酮為一種澄清無色易燃液體，在水、乙醇及大多數(shù)有機溶劑中均能溶解，作為脫水劑已廣泛用于組織的處理，而且比乙醇等脫水劑更易揮發(fā)。丙酮易燃故不用于自動化處理過程，組織長期接觸丙酮會變脆，丙酮作為細胞學中抗原固定劑，主要用于顯示淋巴細胞膜抗原。 免疫組化技術(shù)在病理診斷和研究中的應(yīng)用48 、丙酮和丙酮-甲基苯甲酸鹽-二甲苯(AME 最

36、近丙酮在AMEX技術(shù)中充當固定劑，將組織固定于丙酮中-20過夜，隨后用甲基苯甲酸鹽及二甲苯清洗，爾后石蠟包埋，所得到的組織學效果據(jù)稱比冰凍切片更好而且仍保存了淋巴細胞不穩(wěn)定的抗原，這些學者聲稱從AMEX法固定的組織中可提取出與新鮮組織同樣多的蛋白質(zhì)。 免疫組化技術(shù)在病理診斷和研究中的應(yīng)用49 最近丙酮在AMEX技術(shù)中充當固定劑，將組織固定 、塑料包埋 在適當?shù)墓潭ê笥眯滦退芰习窠M織，可獲得良好的細胞形態(tài)學和抗原保存，用副甲醛、丙酮或BouiN液固定后在低溫(4時)用多聚酶樹酯包埋。 、冰凍替代法及塑料包埋 即用冰凍替代法配合低溫塑料包埋避免了組織的固定而且具有比固定、包埋組織及低溫、恒溫切片

37、更優(yōu)越的形態(tài)學保存效果。 免疫組化技術(shù)在病理診斷和研究中的應(yīng)用50 、塑料包埋 免疫組化技術(shù)在病理診斷和研究 八、脫鈣溶液和組織處理 很多報告都顯示了EDTA、甲酸、10醋酸幾乎都不影響免疫反應(yīng)，即使經(jīng)過長達7周的脫鈣過程,但5% 硝酸脫鈣將造成免疫反應(yīng)的減弱，此時，用蛋白酶消化可稍加改善，三氯乙酸被認為是一種較有效的一步脫鈣固定劑。 免疫組化技術(shù)在病理診斷和研究中的應(yīng)用51 八、脫鈣溶液和組織處理免疫組化技術(shù)在病理診斷和研究中 有關(guān)脫鈣組織中抗原保留的詳細研究較少，60以上可引起抗原失活，細胞形態(tài)的喪失，尤其是核結(jié)構(gòu)，因此浸蠟最好在60以下進行。必要時使用低溶點的蠟。組織切片在58烤干與37

38、相比，前者抗原顯著丟失28，但是抗原重現(xiàn)溶液在沸點的有效使用說明溫度對于所受加熱為濕熱的固定組織并不是一個關(guān)鍵的因素。 免疫組化技術(shù)在病理診斷和研究中的應(yīng)用52 有關(guān)脫鈣組織中抗原保留的詳細研究較少，60九、免疫組化染色方法 、傳統(tǒng)的免疫組化染色 多種免疫組化方法的使用取決于各人愛好，免疫染色方法中的任何一步都可能隱藏著陷井，如阻斷內(nèi)源性過氧化物酶和過氧化物酶樣酶失敗可導(dǎo)致假陽性結(jié)果，非特異性的背景染色，尤其是結(jié)締組織及膠原的染色，是免疫過氧化物酶染色中最令人討厭的。如普通血清或牛白蛋白預(yù)先孵育可以減少背景染色。應(yīng)用最大可能稀釋的初級抗體同樣有利于減少不必要的背景染色。 免疫組化技術(shù)在病理診斷

39、和研究中的應(yīng)用53九、免疫組化染色方法免疫組化技術(shù)在病理診斷和研究中的應(yīng)用53 多數(shù)初級抗體室溫孵育為20-30分鐘，將溫度提高到70時，可以縮短孵育時間，但可能由此而增加背景染色而影響結(jié)果，最好是應(yīng)用初級抗體的最低濃度4過夜（室溫22過夜也有報道）。有些效價低的單克隆抗體或不易于與抗原結(jié)合的抗體，4過夜有時染色效果并不理想，可能是溫度影響了抗體的生物活性，降低了兩者特異性結(jié)合的速率。提高溫度無疑是克服上述問題的方法之一。 免疫組化技術(shù)在病理診斷和研究中的應(yīng)用54 多數(shù)初級抗體室溫孵育為20-30分鐘，將 但應(yīng)使用高質(zhì)量的抗體稀釋液來稀釋一抗或使用商品化的抗體工作液，因為兩者均含有抗體保護劑和

40、穩(wěn)定劑，這樣才能使提高抗體孵育溫度成為可能。具體步驟是加完一抗后，把組織切片置于密封較好的濕盒內(nèi)，室溫18-20過夜，有空調(diào)設(shè)備的房間或使用恒溫培養(yǎng)箱更為適宜。這樣可以較準確地控制實驗溫度，保持免疫組化染色外部條件的穩(wěn)定。 應(yīng)該強調(diào)的是組織切片在操作過程中不能晾干，否則會產(chǎn)生假陰性。 免疫組化技術(shù)在病理診斷和研究中的應(yīng)用55 但應(yīng)使用高質(zhì)量的抗體稀釋液來稀釋一抗或使用商品、微波刺激免疫染色 微波輻射可以減少初級抗體孵育的時間，可以獲得較佳的細胞形態(tài)學保存效果和更干凈的背景29，微波還可用于石蠟切片染色中初級抗體、次級抗體、過氧化物酶復(fù)合物等所有階段的孵育，還可用于加速阻斷步驟，整個染色時間大約

41、16分鐘30，因此尤其適用于緊急的、或特殊情況時所需的即時染色及迅速獲得的結(jié)果。 免疫組化技術(shù)在病理診斷和研究中的應(yīng)用56、微波刺激免疫染色 免疫組化技術(shù)在病理診斷和研究中的應(yīng)、預(yù)先染色的切片免疫組化染色 對HE切片重新進行免疫組化染色，多采用于ABC方法，移去蓋玻片后，用酸性乙醇對蘇木素、伊紅進行短時間脫色，隨后針對性進行免疫染色，該法并不影響抗原檢出。 免疫組化技術(shù)在病理診斷和研究中的應(yīng)用57、預(yù)先染色的切片免疫組化染色 免疫組化技術(shù)在病理診斷、復(fù)染 一般來講免疫組化切片不需復(fù)染。但為了識別某些細胞的類型，復(fù)染是有用的。一般為輕微復(fù)染，常用于核復(fù)染的是蘇術(shù)素和甲基綠，鈷藍B與甲基綠具有相似

42、的性質(zhì)，尤其適用于切片中將黑色素染成藍-綠色，這使得DAB棕色原本難以區(qū)別的黑色素變得易于區(qū)別了。 免疫組化技術(shù)在病理診斷和研究中的應(yīng)用58、復(fù)染 免疫組化技術(shù)在病理診斷和研究中的應(yīng)用58十、蛋白酶解消化 10的緩沖甲醛是診斷實驗室中最通用的固定劑，這種固定劑易使蛋白質(zhì)產(chǎn)生交聯(lián)，使抗原分子的抗原決定簇被掩飾，用蛋白酶對組織切片進行預(yù)處理，可以打開抗原分子間的交聯(lián)，重建其免疫反應(yīng)活力。蛋白酶的消化可以增加細胞和組織的，使抗原和抗體最大限度地結(jié)合。胰蛋白酶消化最早用于石蠟切片的免疫熒光染色，現(xiàn)已廣泛用于免疫組化。除胰蛋白酶外，還有胃蛋白酶、水解酶和鏈霉菌酶等，牛胰蛋白酶，0.1%胃蛋白酶最為常用，

43、消化的時間取決于抗原掩蓋的強度，蛋白酶消化的時間與甲醛固定時間成正比32, 相比較乙醇固定的組織顯示了較好的抗原保存，尤其是VimeNtiN，在乙醇中經(jīng)不同時間長度固定后，免疫染色效果無明顯區(qū)別。 免疫組化技術(shù)在病理診斷和研究中的應(yīng)用59十、蛋白酶解消化免疫組化技術(shù)在病理診斷和研究中的應(yīng)用59 有學者指出固定于95乙醇和固定于甲醛-乙醇(90ml 80%乙醇，10ml濃甲醛和0.22g醋酸鈉)中的組織抗原保存的相對范圍相似，而固定于10甲醛的組織，其大量抗原將無法標記。乙醇除了可以較好的保存胞漿中VimeNtiN外，對于其它抗原并不是一種優(yōu)越的試劑，而且乙醇固定的形態(tài)學，表現(xiàn)為組織皺縮，核染色

44、質(zhì)聚集及嗜堿性增強。在生理鹽水中用微波輻射固定使組織直接經(jīng)純乙醇處理而避免這些缺點。胃蛋白作用強，但偏酸性，易造成組織結(jié)構(gòu)破壞?？乖迯?fù)液胰蛋白酶一般用于細胞內(nèi)抗原，膜抗原慎用。復(fù)合酶（胰蛋白酶為主）濃度增高，并含有穩(wěn)定劑，PH7.2，主要用于細胞外間質(zhì)抗原的檢測。 免疫組化技術(shù)在病理診斷和研究中的應(yīng)用60 有學者指出固定于95乙醇和固定于甲醛- 適當?shù)拿赶兄跍p少背景染色而增強特定抗原的免疫反應(yīng)，但可能會出現(xiàn)假陰性。也有些情況酶消化反爾產(chǎn)生背景染色及假陽性。過分消化會破壞細胞的完整性使抗原丟失，酶消化還易于引起掉片?？墒褂镁G礬酸，ELMER凝膠和多聚賴氨酸等作為粘合劑來解決掉片這一問題。

45、免疫組化技術(shù)在病理診斷和研究中的應(yīng)用61 適當?shù)拿赶兄跍p少背景染色而增強特定抗原的十一、免疫組化染色的質(zhì)量保證 對于不同抗體的特異性、相似抗體克隆的不同來源、相似的克隆冠以不同名稱出售、以及其它問題不斷出現(xiàn)，強調(diào)了要認真制定一個診斷性免疫組化的質(zhì)量保證，各種酶聯(lián)抗體，顯色劑，藥盒等可以通過多種商業(yè)途徑購得，目前已有300多種免疫試劑及抗體有售，不斷增長的抗體數(shù)目，不斷成為可商業(yè)購得的商品，卻沒有統(tǒng)一靈敏度及特異性標準。 免疫組化技術(shù)在病理診斷和研究中的應(yīng)用62十一、免疫組化染色的質(zhì)量保證免疫組化技術(shù)在病理診斷和研究中的 不同克隆所要檢測的是相似抗原，相同抗原可作為濃縮形式或未稀釋形式，還

46、可作為培養(yǎng)基上清液，或即用型液體出售，同一商品可在不同分銷商名下作為不同名稱的商品出售，購買者所購買的試劑不必去證實制造商及分銷商所聲稱的靈敏度和特異性，而且有趣的是所有商業(yè)抗體都標明“非診斷用”，但事實上這些抗體正是用于診斷這一目的。免疫組化技術(shù)在病理診斷和研究中的應(yīng)用63 不同克隆所要檢測的是相似抗原，相同抗原可作為 關(guān)于免疫組化染色的標準問題最初是由美國生物染色委員會(Biological staiN commissioN USA)的一項小研究而引發(fā)的，該組織評估了5家獨立實驗室針對3種多發(fā)性腫瘤塊進行的單純抗-角蛋白抗體染色，所報道的染色形式在所參加的5家實驗室中有顯著差別34，另一項

47、關(guān)于乳腺癌中激素受體免疫染色在多家實驗室的研究中也得到了不盡相同的結(jié)果。 免疫組化技術(shù)在病理診斷和研究中的應(yīng)用64 關(guān)于免疫組化染色的標準問題最初是由美國生物染毫無疑問，免疫組化如能正確應(yīng)用，確實是一種有力而又有用的診斷工具，它為外科病理學家提供了高水準的專業(yè)服務(wù)，補充了他們的觀察技巧，拓寬了形態(tài)學診斷的潛能。為了保證免疫染色的高質(zhì)量， 我們對切片處理方面的所有問題都應(yīng)認真考慮與檢查，以確保組織抗原的最佳保存。免疫組化在未完成之前無可靠的檢測手段，染色結(jié)果常反復(fù)無常，這與許多因素有關(guān)，如抗原保存，蛋白酶消化，增強技術(shù)及對抗體的管理、使用和試劑的濃度，因此穩(wěn)定質(zhì)量的保持比其它的實驗室技術(shù)更困難，

48、除非進行大量的免疫組化操作，否則保持好的質(zhì)量與取得合理的經(jīng)驗是很難的。 免疫組化技術(shù)在病理診斷和研究中的應(yīng)用65毫無疑問，免疫組化如能正確應(yīng)用，確實是一種有力而又有用的診斷 每次使用新抗體時都必須檢測其最佳稀釋度、使用免疫組化方法與組織固定等。但使用一些試劑盒或即用型試劑，可以減少上述麻煩，使用方便。但試劑盒也有其自身的缺陷，這些即用型已稀釋過的抗體給人有一種方便與穩(wěn)定的假象，某些試劑盒無法達到期望效果，但又難以將這些試劑定為假貨。藥盒即用型試劑由制造商設(shè)計成適合所有使用者，其試劑濃度并不是最佳濃度，因為各個實驗室有不同的固定與組織處理方法，所以使用即用型試劑的結(jié)果常并不是最佳結(jié)果。 免疫組化

49、技術(shù)在病理診斷和研究中的應(yīng)用66 每次使用新抗體時都必須檢測其最佳稀釋度、使用 免疫染色質(zhì)量控制需要設(shè)置對照組，包括已知存在抗原的陽性對照組，如含抗原的正常組織，最好是使用含少量抗原的瘤組織作為對照，使與所檢測切片中的抗原水平趨于一致，而且后者可能含有表達抗原的非瘤組織，可以作為內(nèi)部對照。陰性對照，應(yīng)用缺乏抗原的組織切片?？瞻讓φ眨床捎梅敲庖哐澹彌_液，或其它無特異性的抗體（最好是同一免疫球蛋白的類型）以取代初級抗原的位置或用抗原預(yù)先吸附抗體而除去陽性染色，這常是可靠的對照，但由于該法不實用而未被常規(guī)使用。 免疫組化技術(shù)在病理診斷和研究中的應(yīng)用67 免疫染色質(zhì)量控制需要設(shè)置對照組，包括已知

50、存在抗 實驗室在確定使用新抗體之前，使用者應(yīng)該了解下列情況： 、確定對于所要研究抗原的最敏感抗體； 、檢測抗體的最佳工作濃度； 、熟悉相關(guān)試劑的靈敏度、特異性、特別應(yīng)了解哪些組織表達這些抗原，確定免疫染色的方法及細胞中的抗原分布，這將有助于確定陽性染色，特別是當細胞表達水平低時尤為重要 。免疫組化技術(shù)在病理診斷和研究中的應(yīng)用68 實驗室在確定使用新抗體之前，使用者應(yīng)該了解下 、使用于診斷樣品之前，應(yīng)用陽性切片進行預(yù)試驗以獲得使用抗體的經(jīng)驗； 、在實驗室中應(yīng)有一份該試劑已出版的文獻作為參考資料，對于非特異性染色的假陽性等情況，要心中有數(shù)，以避免不確切的解釋、推論等。 免疫組化技術(shù)在病理診斷和研究

51、中的應(yīng)用69 、使用于診斷樣品之前，應(yīng)用陽性切片進行預(yù)試驗 優(yōu)秀免疫組化切片的觀察免疫組化技術(shù)在病理診斷和研究中的應(yīng)用70 優(yōu)秀免疫組化切片的觀察免疫組化技術(shù)在病理診斷和研究中的應(yīng)免疫組化技術(shù)在病理診斷和研究中的應(yīng)用71免疫組化技術(shù)在病理診斷和研究中的應(yīng)用71免疫組化技術(shù)在病理診斷和研究中的應(yīng)用72免疫組化技術(shù)在病理診斷和研究中的應(yīng)用72免疫組化技術(shù)在病理診斷和研究中的應(yīng)用73免疫組化技術(shù)在病理診斷和研究中的應(yīng)用73免疫組化技術(shù)在病理診斷和研究中的應(yīng)用74免疫組化技術(shù)在病理診斷和研究中的應(yīng)用74免疫組化技術(shù)在病理診斷和研究中的應(yīng)用75免疫組化技術(shù)在病理診斷和研究中的應(yīng)用75免疫組化技術(shù)在病理診

52、斷和研究中的應(yīng)用76免疫組化技術(shù)在病理診斷和研究中的應(yīng)用76免疫組化技術(shù)在病理診斷和研究中的應(yīng)用77免疫組化技術(shù)在病理診斷和研究中的應(yīng)用77免疫組化技術(shù)在病理診斷和研究中的應(yīng)用78免疫組化技術(shù)在病理診斷和研究中的應(yīng)用78免疫組化技術(shù)在病理診斷和研究中的應(yīng)用79免疫組化技術(shù)在病理診斷和研究中的應(yīng)用79免疫組化技術(shù)在病理診斷和研究中的應(yīng)用80免疫組化技術(shù)在病理診斷和研究中的應(yīng)用80免疫組化技術(shù)在病理診斷和研究中的應(yīng)用81免疫組化技術(shù)在病理診斷和研究中的應(yīng)用81免疫組化技術(shù)在病理診斷和研究中的應(yīng)用82免疫組化技術(shù)在病理診斷和研究中的應(yīng)用82十二、免疫組化染色的說明與缺陷 、免疫組化染色的形式，病理學

53、家在免疫組化染色中不應(yīng)只限于熟悉陽性反應(yīng)的特征，還應(yīng)注意染色中的各種變化，因為不同的組織、固定處理方法、及抗體特性，免疫組化染色結(jié)果有變化。不正確的結(jié)果常來源于技術(shù)性錯誤或闡述的錯誤。真正陽性染色應(yīng)是將所研究的特異細胞染成棕色，特別是單個細胞在一群細胞中或一個腫瘤中的異源性染色。在DAB顯色中，陽性反應(yīng)棕色顆?？梢燥@示單個細胞胞漿、細胞膜、核周區(qū)域、細胞核或僅限于胞漿的一個區(qū)域，如細胞的一極等。彌漫棕色或單一黃色的腫瘤細胞染色可能是非特異性的。 免疫組化技術(shù)在病理診斷和研究中的應(yīng)用83十二、免疫組化染色的說明與缺陷免疫組化技術(shù)在病理診斷和研究中 多數(shù)用于腫瘤診斷的免疫標記物定位于胞漿或細胞膜表

54、面，如CEA、HBSAg等，表達于細胞核的有P53、ki-67、LamiN、CycliN D1,雌激素，孕酮及雄激素蛋白。定位于細胞核及膜上表達的抗原有NE、LN2(CD74)、S-100蛋白等，核膜上表達的有C-erbB-2,表面免疫球蛋白等?？乖奶禺愋苑植夹问接蠧D30在R-S細胞顯示膜標記，核周高爾基氏體染色，偶爾胞漿反應(yīng)，Merkel細胞癌顯示角蛋白細絲和N細絲核旁螺旋狀。惡性間皮瘤的鑒別是通過瘤細胞周圍長而復(fù)雜的微絨毛，由單抗上皮膜抗原清楚的標記。 免疫組化技術(shù)在病理診斷和研究中的應(yīng)用84 多數(shù)用于腫瘤診斷的免疫標記物定位于胞漿或細胞 所謂橫紋肌樣腫瘤及其刺激物表現(xiàn)出顯著的Vime

55、NtiN細絲呈球狀團塊，這與該部位超微結(jié)構(gòu)上基質(zhì)間細絲形成的螺旋相一致。免疫組化染色中更強調(diào)了HE切片上所見不到的細胞形態(tài)學特征，如樹突狀網(wǎng)織細胞的樹突可以用S-100蛋白和CD21進行免疫組化染色而顯示，多種肉瘤細胞通過VimeNtiN免疫染色，顯示復(fù)雜的胞漿突起，N內(nèi)分泌細胞通過細胞角蛋白染色顯示長的胞漿突起和N內(nèi)分泌標記物等。 免疫組化技術(shù)在病理診斷和研究中的應(yīng)用85 所謂橫紋肌樣腫瘤及其刺激物表現(xiàn)出顯著的 、不同于顯色劑反應(yīng)產(chǎn)物的色素： 甲醛色素、黑色素、含鐵血黃素應(yīng)與DAB陽性顆粒鑒別，它們存在的部位、質(zhì)地和顏色方面均有差別。用1NaOH溶于70%乙醇溶液進行切片預(yù)處理可以去掉甲醛色

56、素，而對免疫組化染色效果無明顯影響。該溶液對已染過的切片也同樣有效40。DAB的顆粒與黑色素較難區(qū)別，尤其是在含大量黑色素細胞病灶中用鈷蘭B復(fù)染可將黑色素染成蘭綠色，可與免疫標記細胞形成鮮明對照41。用陽性、陰性切片進行對照檢查有助于區(qū)別可能見到的內(nèi)源性或外源性色素的性質(zhì)。 免疫組化技術(shù)在病理診斷和研究中的應(yīng)用86 、不同于顯色劑反應(yīng)產(chǎn)物的色素：免疫組化技術(shù) 、假陽性和假陰性染色 非特異性抗體吸附常見于壞死組織中，使壞死組織呈較高的背景染色。組織細胞活躍的吞噬，并象其它細胞一樣被動地吸附抗原，因此即使這些細胞不制造抗原，也會顯示出免疫活性，巨噬細胞可從鄰近壞死組織或破壞的骨骼肌細胞中攝取肌球蛋

57、白，并顯示吸收蛋白血清的免疫球蛋白，并不是自身合成的。非特異性染色亦可見于中性粒細胞的胞漿，組織切片游離緣即“邊緣現(xiàn)象” (edge pheNomeNoN)，有時人為的染色可以見于滲出液中漂浮的個別細胞膜表面。 免疫組化技術(shù)在病理診斷和研究中的應(yīng)用87 、假陽性和假陰性染色免疫組化技術(shù)在病理診斷和 假陽性染色主要來源于多克隆抗血清中污染的抗體。在細胞學標本中，假陽性染色常反應(yīng)在變性、擠碎與壞死細胞中。而且在蛋白滲出液中和紅細胞中有較高的背景染色，可以干擾結(jié)果。假陰性反應(yīng)可能是抗體未能充分滲透如漿細胞胞漿中的Russel小體，甲狀腺濾泡中的膠質(zhì)等固化結(jié)構(gòu)。其它引起假陽性和假陰性染色的原因包括試劑

58、不適當?shù)男r與稀釋度，組織中抗原濃度過低，抗原掩飾或丟失及操作過程中不適當?shù)姆跤龝r間與溫度等。 免疫組化技術(shù)在病理診斷和研究中的應(yīng)用88 假陽性染色主要來源于多克隆抗血清中污染的抗體。 為了評估抗原保存是否足夠，Battifora等倡導(dǎo)將VimeNtiN染色作為一種內(nèi)部對照或報告分子，因為VimeNtiN是一種不同程度分布于所有組織的無處不在的分子，而且它對于過短或過長的固定所造成的抗原丟失或掩飾很敏感，不僅可作為抗原保存質(zhì)量的指標，而且允許選擇更合適的領(lǐng)域進行其它免疫染色的解釋，尤其對于固定過程很敏感的不穩(wěn)定抗原。 免疫組化技術(shù)在病理診斷和研究中的應(yīng)用89 為了評估抗原保存是否足夠，Batt

59、ifora十三、關(guān)于免疫組化染色結(jié)果報告 在報告免疫組化染色結(jié)果時應(yīng)考慮到以臨床發(fā)現(xiàn)及形態(tài)學特征為基礎(chǔ)的各種鑒別診斷關(guān)系，免疫組化染色不應(yīng)孤立地解釋。因此免疫組化報告應(yīng)是外科病理報告的一部分，應(yīng)與常規(guī)病理報告總合為一份原始報告，或因染色延誤而作為增補報告發(fā)出。 免疫組化技術(shù)在病理診斷和研究中的應(yīng)用90十三、關(guān)于免疫組化染色結(jié)果報告免疫組化技術(shù)在病理診斷和研究中 美國解剖與外科病理理事會建議免疫組化報告應(yīng)考慮到診斷、鑒別診斷、所研究標本性質(zhì)、固定方法、所應(yīng)用的抗體、合適的克隆及有關(guān)該抗體陽性與陰性發(fā)現(xiàn)的文獻，他們強調(diào)了總結(jié)免疫組化發(fā)現(xiàn)在最終外科病理報告中的重要性，作為全面病理形態(tài)學檢查的附屬物，

60、正象電鏡研究結(jié)果一樣，有時免疫組化的結(jié)果也起到診斷的關(guān)鍵作用。 免疫組化技術(shù)在病理診斷和研究中的應(yīng)用91 美國解剖與外科病理理事會建議免疫組化報告應(yīng)考十四、免疫組化在病理診斷中的作用（一）、對“未分化”惡性腫瘤的分類 如在HE切片上由于腫瘤的“未分化”而缺少腫瘤細胞起源的特征，不能分類，但臨床上又必須根據(jù)腫瘤的種類作出治療與預(yù)后判斷，這種情況下免疫組化也許有用。在進行免疫組化前病理醫(yī)生應(yīng)根據(jù)腫瘤發(fā)生部位、組織學的蛛絲馬跡及臨床特征正確地選擇抗體。如發(fā)生于直腸的上皮樣包含大細胞的未分化腫瘤，其鑒別診斷主要考慮為未分化癌、淋巴瘤、惡性黑色素瘤，可以使用表X-1列出的免疫組化抗體： 免疫組化技術(shù)在病