免疫膠乳濁度分析在自動(dòng)生化分析儀上應(yīng)用課件

1、免疫膠乳濁度分析在自動(dòng)生化分析儀上的應(yīng)用免疫膠乳濁度分析在自動(dòng)生化分析儀上的應(yīng)用免疫膠乳濁度分析在自動(dòng)生化分析儀上的應(yīng)用免疫比濁回顧免疫膠乳濁度分析（immunolatex turbidimetry）在生化分析儀上進(jìn)行測(cè)定的有關(guān)問題2020/11/32免疫膠乳濁度分析在自動(dòng)生化分析儀上的應(yīng)用免疫膠乳濁度分析在自免疫比濁回顧免疫膠乳濁度分析（immunolatex turbidimetry）在生化分析儀上進(jìn)行測(cè)定的有關(guān)問題2020/11/32免疫比濁回顧2020/11/32免疫比濁免疫檢測(cè)的基礎(chǔ) 抗原抗體間的特異性反應(yīng) 手工操作 自動(dòng)化分析核心基礎(chǔ)2020/11/33免疫比濁免疫檢測(cè)的基礎(chǔ)核心基

2、礎(chǔ)2020/11/33免疫比濁技術(shù)是在免疫沉淀反應(yīng)（Precipitation）檢測(cè)法的基礎(chǔ)上建立的。最早應(yīng)用的免疫沉淀反應(yīng)是Ouchterlony在1948年建立的瓊脂雙向擴(kuò)散法。1965年Mancini等和Fahey等分別建立了可以定量的單向（輻射狀）免疫擴(kuò)散技術(shù)。Laurell等1966年建立了電免疫擴(kuò)散法，使報(bào)告結(jié)果的時(shí)間由單向免疫擴(kuò)散法的24h縮短到4-5h。免疫比濁2020/11/34免疫比濁技術(shù)是在免疫沉淀反應(yīng)（Precipitation）檢經(jīng)典的免疫沉淀試驗(yàn)通常是在抗原與相應(yīng)抗體反應(yīng)的終點(diǎn)判定結(jié)果，存在費(fèi)時(shí)、操作繁瑣、敏感度低（10100mg/L）、不能自動(dòng)化等缺陷。根據(jù)沉淀反

3、應(yīng)時(shí)，抗原抗體結(jié)合后可使反應(yīng)系統(tǒng)透光度發(fā)生改變，建立了以測(cè)定透光度為特征的微量免疫沉淀測(cè)定法法，既免疫濁度測(cè)定技術(shù)。免疫比濁2020/11/35經(jīng)典的免疫沉淀試驗(yàn)通常是在抗原與相應(yīng)抗體反應(yīng)的終點(diǎn)判定結(jié)果，1967年由Richie首次報(bào)告，20世紀(jì)70年代逐步完善，80年代初期初步應(yīng)用臨床常規(guī)檢查。抗原抗體在液相（特殊的緩沖液）中快速結(jié)合，形成抗原抗體復(fù)合物，反應(yīng)液出現(xiàn)濁度。免疫比濁2020/11/361967年由Richie首次報(bào)告，20世紀(jì)70年代逐步完善，液相中抗原與抗體的反應(yīng)結(jié)果與兩者的濃度比例有關(guān)。抗原或抗體顯著過量時(shí)，都只能生成少量的可溶性免疫復(fù)合物，分子極小，不適于免疫比濁法檢測(cè)。

4、 免疫比濁技術(shù)要求溶液中抗體要保持中等過量，此時(shí)免疫復(fù)合物（immunecomplex，IC）仍是可溶性的。在這種情況下，抗原與抗體的反應(yīng)遵循質(zhì)量作用定律（Ag+AbAg.Ab），形成IC的量是抗原或抗體的函數(shù)。當(dāng)抗體固定時(shí)，IC的量與抗原的量成正比。免疫比濁2020/11/37液相中抗原與抗體的反應(yīng)結(jié)果與兩者的濃度比例有關(guān)。抗原或抗體顯LIGHTSOURCEFILTERREACTIONCUVETTETURBIDIMETRIC DETECTORNEPHELOMETRICDETECTORIC散射比濁、透射比濁光路圖 透射光+散射光散光射平光線2020/11/38LIGHTFILTERREACTI

5、ONTURBIDIMETR目前，國(guó)內(nèi)開展的各項(xiàng)免疫檢驗(yàn)，均求使用國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局（SFDA）準(zhǔn)入和批準(zhǔn)的儀器和試劑。這樣做不僅能使各項(xiàng)檢查更加統(tǒng)一，規(guī)范，各實(shí)驗(yàn)室之間檢查結(jié)果更具可比性，而且也可避免很多不必要的醫(yī)療糾紛。免疫比濁技術(shù)中散射比濁法目前均用獲國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局（SFDA）批準(zhǔn)進(jìn)口的自動(dòng)化分析儀器和配套的各種檢測(cè)項(xiàng)目的專用試劑。透射比濁法（生化分析儀）可用國(guó)產(chǎn)試劑。全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程 第3版透射還是散射2020/11/39目前，國(guó)內(nèi)開展的各項(xiàng)免疫檢驗(yàn)，均求使用國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局散射比濁 專用儀器 專用配套試劑 原裝進(jìn)口試劑昂貴透射比濁 生化分析儀 開放試劑 （可用國(guó)產(chǎn)

6、試劑）速率法和終點(diǎn)法測(cè)定；速率法的靈敏度和特異性優(yōu)于終點(diǎn)法；終點(diǎn)法的穩(wěn)定性較好；透射還是散射2020/11/310散射比濁透射比濁速率法和終點(diǎn)法測(cè)定；透射還是散射2020/1目前，由于技術(shù)的發(fā)展，兩種比濁法的靈敏度和特異性已接近，而全自動(dòng)生化儀的自動(dòng)化程度和精密度要?jiǎng)儆趯Ｓ蒙⑸浔葷醿x，透射免疫比濁法在臨床上的應(yīng)用日益廣泛。生化分析儀通過免疫比濁法技術(shù)，架起了現(xiàn)代生化檢驗(yàn)和現(xiàn)代免疫技術(shù)的橋梁。免疫化學(xué)是免疫學(xué)技術(shù)和生物化學(xué)技術(shù)的結(jié)合。既具有免疫學(xué)抗原抗體結(jié)合的特異性，又具有生物化學(xué)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)。透射還是散射2020/11/311目前，由于技術(shù)的發(fā)展，兩種比濁法的靈敏度和特異性已接近，而全透射免

7、疫比濁可溶性抗原與其特異性抗體，在一定緩沖液中形成的復(fù)合物，經(jīng)一段時(shí)間聚合后出現(xiàn)濁度，人射光在滲過反應(yīng)液時(shí)，由于溶液內(nèi)IC粒子對(duì)光線的反射和吸收，引起透射光減少，可用吸光度A表示。用已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)參考品建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)出待測(cè)抗原的含量。透射比濁法主要用于生化分析儀。2020/11/312透射免疫比濁可溶性抗原與其特異性抗體，在一定緩沖液中形成的復(fù)透射免疫比濁免疫復(fù)合物直徑為35lOOnm，這一范圍要求近紫外光處入射光發(fā)出最大的干擾(最大吸收峰)，選擇290410nm波長(zhǎng)測(cè)定最佳。由于抗原抗體結(jié)合后在短時(shí)間內(nèi)(19s)形成可見的復(fù)合物，才能進(jìn)行比濁。為了提高復(fù)合物形成速度，加入促聚劑，如4聚乙二

8、醇(MW：60008000)，可使復(fù)合物形成在310min完成。2020/11/313透射免疫比濁免疫復(fù)合物直徑為35lOOnm，這一范圍要求近比濁法中，少量的小的抗原抗體復(fù)合物極難形成濁度，除非放置較長(zhǎng)時(shí)間；如形成較大的復(fù)合物，則抗原和抗體用量也較大，顯然不符合微量化的要求。為解決快速反應(yīng)及微量化的要求，建立了免疫膠乳濁度法（immunolatex turbidimetry）。免疫膠乳濁度分析（immunolatex turbidimetry）2020/11/314比濁法中，少量的小的抗原抗體復(fù)合物極難形成濁度，除非放置較長(zhǎng)其基本原理是：將特異性抗體吸附在大小適中、均勻一致的膠乳顆粒上，當(dāng)遇

9、到相應(yīng)抗原時(shí)，則使膠乳顆粒發(fā)生凝集。單個(gè)膠乳顆粒在入射光波之內(nèi)，不阻礙光線透過；兩個(gè)或兩個(gè)以上膠乳顆粒凝聚時(shí)則使透過光減少。免疫微球凝聚的程度為被測(cè)物濃度的函數(shù)，由此可測(cè)出標(biāo)本中待測(cè)物的含量。免疫膠乳濁度分析（immunolatex turbidimetry）2020/11/315其基本原理是：免疫膠乳濁度分析（immunolatex t(a)帶抗體的膠乳在1個(gè)波長(zhǎng)之內(nèi)可透過光線 (b)結(jié)合后，則形成光線衰減2020/11/316(a)帶抗體的膠乳在1個(gè)波長(zhǎng)之內(nèi)可透過光線2020/11/3該技術(shù)的關(guān)鍵在于兩個(gè)方面：首先是選擇適用的膠乳，其大?。ㄖ睆剑┮孕∮诓ㄩL(zhǎng)。用500nm波長(zhǎng)者，選擇100

10、nm顆粒較適合；用585nm波長(zhǎng)者，則選用100200nm顆粒為好。目前多用200nm的膠乳顆粒。其次，膠乳與抗體結(jié)合時(shí)用化學(xué)交聯(lián)雖好，但失活也較嚴(yán)重；一般用吸附法即可。免疫膠乳濁度分析（immunolatex turbidimetry）2020/11/317該技術(shù)的關(guān)鍵在于兩個(gè)方面：免疫膠乳濁度分析（immunol免疫膠乳濁度分析（immunolatex turbidimetry）2020/11/318免疫膠乳濁度分析（immunolatex turbidim膠乳顆粒多為惰性微球和羧基化微球氨基化高分子納米微球氨基化納米微球的顆粒大小較傳統(tǒng)的微球更?。s0.1m），它與抗體的結(jié)合是通過其表面

11、的氨基與抗體的氨基端共價(jià)結(jié)合，在微球與抗體之間有一個(gè)橋聯(lián)化學(xué)臂，降低了位阻效應(yīng)，不僅提高了抗體的結(jié)合率，而且還為抗體提供合適的三維空間立體結(jié)構(gòu)，有效地保護(hù)了抗體與抗原結(jié)合的活性區(qū)域。與采用惰性納米微球的傳統(tǒng)技術(shù)相比，檢測(cè)的靈敏度得到了極大的改善，最高可達(dá)到1.0ng/ml。免疫膠乳濁度分析（immunolatex turbidimetry）2020/11/319膠乳顆粒多為惰性微球和羧基化微球免疫膠乳濁度分析（immu（1）操作簡(jiǎn)單，可在幾分鐘內(nèi)快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)血清蛋白含量，真實(shí)反映病情進(jìn)展和評(píng)估治療效果，對(duì)于疾病的早期診斷和治療具有重要的臨床意義；（2）不易受人為操作和外界因素干擾，檢測(cè)穩(wěn)定

12、性和重復(fù)性都很好；（3）能利用普通的生化分析儀進(jìn)行檢測(cè)，容易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，可在各級(jí)基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)普及和應(yīng)用。免疫膠乳濁度分析（immunolatex turbidimetry）2020/11/320（1）操作簡(jiǎn)單，可在幾分鐘內(nèi)快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)血清蛋白含量，真膠乳比濁分析顆粒增強(qiáng)透射免疫比濁法（particle-enhanced turbidimetric immunoassay, PETIA）膠乳增強(qiáng)免疫濁度測(cè)定（Latex enhanced turbidimetric immunoassay , LETIA ）粒子強(qiáng)化免疫濁度測(cè)定免疫膠乳濁度分析（immunolatex turbidimetry

13、）2020/11/321膠乳比濁分析免疫膠乳濁度分析（immunolatex tu生化儀上開展的免疫項(xiàng)目serum proteins 血清蛋白類IgA（免疫球蛋白A）IgG（免疫球蛋白G）IgM（免疫球蛋白M）IgE（免疫球蛋白E）C3（補(bǔ)體C3）C4（補(bǔ)體C4）Microalbumin （微量白蛋白）2-microglobulin （ 2球蛋白）-1- acid glycoprotein （ -1酸性糖蛋白）Ferritin（鐵蛋白）Transferrin（轉(zhuǎn)鐵蛋白） 2020/11/322生化儀上開展的免疫項(xiàng)目serum proteinsMicro心血管疾病監(jiān)測(cè)Apo A-1（載脂蛋白A1

14、）Apo B（載脂蛋白B）Lp(a)（脂蛋白a）h-CRP(超敏感C反應(yīng)蛋白）Homocysteine （同型半胱氨酸）D-Dimer（D二聚體）Myoglobin（肌紅蛋白）cTnI（肌鈣蛋白I）生化儀上開展的免疫項(xiàng)目2020/11/323心血管疾病監(jiān)測(cè)生化儀上開展的免疫項(xiàng)目2020/11/323Rheuma 風(fēng)濕病RF（類風(fēng)濕因子）ASO（抗鏈O）CRP（C-反應(yīng)蛋白）腎小球過濾率最敏感的指標(biāo)cystatin C （胱抑素C ）生化儀上開展的免疫項(xiàng)目2020/11/324Rheuma 腎小球過濾率最敏感的生化儀上開展的免疫項(xiàng)目20TDM治療藥物監(jiān)測(cè)Phenobarbital （苯巴比妥）P

15、henytoin（苯妥英納）Valproic acid（丙戊酸）Carbamazepine （卡馬西平）Theophylline（茶堿）Gentamicin（慶大霉素）Digoxin（地高辛）Digitoxin（洋地黃）Vitamins維生素Vitamin B12 （維生素B12）Folate（葉酸）infectious Diseases 傳染性疾病TOXO（弓形體）RUBELLA（風(fēng)疹病毒）生化儀上開展的免疫項(xiàng)目2020/11/325TDM治療藥物監(jiān)測(cè)Vitamins維生素生化儀上開展的免疫項(xiàng)免疫比濁法試劑的組成R1（試劑 I）: 緩沖液R2（試劑 II）: 啟動(dòng)試劑 (帶或不帶乳膠顆粒)S

16、TANDARDS（標(biāo)準(zhǔn)液） (一點(diǎn)或多點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn))CONTROLS（質(zhì)控液）2020/11/326免疫比濁法試劑的組成R1（試劑 I）: 緩沖液2020/11免疫比濁法試劑的組成R1緩沖液 R2啟動(dòng)試劑 校準(zhǔn)血清2020/11/327免疫比濁法試劑的組成R1緩沖液 R2啟動(dòng)試劑 校準(zhǔn)血清2反應(yīng)類型（不需要乳膠）AgAb (Reagent)2020/11/328反應(yīng)類型（不需要乳膠）AgAb (Reagent)2020/反應(yīng)類型（需要乳膠）LATEX PARTICLEAg2020/11/329反應(yīng)類型（需要乳膠）Ag2020/11/329試劑成份的功用緩沖液: 使反應(yīng)有最大限度的敏感性避免非特異的結(jié)

17、果降低反應(yīng)時(shí)間啟動(dòng)試劑:產(chǎn)生抗原-抗體反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)液:建立濃度與信號(hào)（吸光度）之間的關(guān)系質(zhì)控液: 檢查定標(biāo)的情況2020/11/330試劑成份的功用緩沖液: 2020/11/330CRM470-全新的國(guó)際蛋白標(biāo)準(zhǔn)2020/11/331CRM470-全新的國(guó)際蛋白標(biāo)準(zhǔn)2020/11/331CRM 歐共體參考局（ BCR ）的認(rèn)可參考品。CRM470是14種（血清）蛋白分析物的參考制品。CRM470基于人血清（人血清蛋白參考制備物 lot 5 ，RPPHS lot 5）的Certified Reference Material由以下組織共同發(fā)展： IFCC BCR Brussels CAP USA C

18、RM470-全新的國(guó)際蛋白標(biāo)準(zhǔn)2020/11/332CRM 歐共體參考局（ BCR ）的認(rèn)可參考品。CRM470CRM 470在歐洲由BCR制備提供。在美國(guó)則由美國(guó)病理協(xié)會(huì)（CAP）提供材料。生產(chǎn)廠家用CRM470對(duì)自己的定標(biāo)液和質(zhì)控液進(jìn)行標(biāo)化。CRM和SRM（Standard Reference Material標(biāo)準(zhǔn)參考材料）可以認(rèn)為是目前可以提供的最高質(zhì)量的材料。SRM主要用于USA（國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)和技術(shù)研究院NIST）。 CRM470-全新的國(guó)際蛋白標(biāo)準(zhǔn)2020/11/333CRM 470在歐洲由BCR制備提供。在美國(guó)則由美國(guó)病理協(xié)會(huì)基于CRM470參考物的成人參考范圍CRM470參考物及其參

19、考范圍血漿蛋白質(zhì)每個(gè)CRM470的參考范圍（g/L）白蛋白3552-1-抗胰蛋白酶0.92.0（-1-抗胰蛋白酶抑制劑）C3C-補(bǔ)體0.91.8C4-補(bǔ)體0.10.4銅蘭蛋白0.20.6C-反應(yīng)蛋白（CRP）0.005-1-酸性糖蛋白（類粘蛋白）0.51.2觸珠蛋白0.32.0IgA0.74.0IgG716IgM0.42.3-2-巨球蛋白1.33.0前白蛋白（transthyretin）0.20.4轉(zhuǎn)鐵蛋白2.03.6 注：C3C在新鮮樣本中可期望較低的參考范圍2020/11/334基于CRM470參考物的成人參考范圍CRM470參考物及其參對(duì)實(shí)驗(yàn)室的生化分析儀盡可能充分的掌握并理解。理解各個(gè)

20、檢測(cè)項(xiàng)目的方法學(xué)原理。仔細(xì)認(rèn)真閱讀商品化試劑的說明書。銷售商或者廠家技術(shù)部門的支持?！八^生化分析儀就是將實(shí)驗(yàn)參數(shù)輸入儀器，由儀器按照試驗(yàn)指令來完成整個(gè)試驗(yàn)。參數(shù)設(shè)置，基本功在儀器之外，如果對(duì)分析化學(xué)、對(duì)酶動(dòng)力學(xué)、儀器性能沒有一定的掌握，是很難設(shè)置好參數(shù)的?！痹谧詣?dòng)生化分析儀上的應(yīng)用2020/11/335對(duì)實(shí)驗(yàn)室的生化分析儀盡可能充分的掌握并理解。“所謂生化分析儀免疫濁度法在生化分析儀上常見的測(cè)定（分析）方式FINAL POINT DFINAL - SAMPLE BLANK D - AFINAL - INITIAL D - BKINETIC (C - B)/ timeR2 (LATEX OR

21、ANTISERA)SAMPLEAND R1 (BUFFER)TIMEOD increment2020/11/336免疫濁度法在生化分析儀上常見的測(cè)定（分析）方式R2 (LAT測(cè)定CRP分析方式 采用雙試劑、兩步終點(diǎn)法37 5min37 5minA1A2SampleenR1R2R1R2End2020/11/337測(cè)定CRP分析方式 采用雙試劑、兩步終點(diǎn)法37 5miHeidelberger & Kendall ExperienceExcess antibodyzone Equivalence zoneExcess antigen zoneAntigen concentration TURBIDI

22、TY ( OD )（useful zone）ABC2020/11/338Heidelberger & Kendall Expe免疫濁度測(cè)量多點(diǎn)定標(biāo)依據(jù)抗原抗體反應(yīng)特性，免疫比濁測(cè)量選擇在A區(qū)，IC的濁度隨著抗原的增加而增加，但不是呈線性的對(duì)應(yīng)關(guān)系（曲線往往有截距或呈S形），要得到正確的結(jié)果，必須做一個(gè)多點(diǎn)定標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。自動(dòng)生化分析儀多推薦5點(diǎn)或6點(diǎn)定標(biāo)，然后選擇適當(dāng)?shù)臄?shù)學(xué)模型作曲線擬合，如：Logit-Log變換； y=d+cx+bx2+ax32020/11/339免疫濁度測(cè)量多點(diǎn)定標(biāo)依據(jù)抗原抗體反應(yīng)特性，免疫比濁測(cè)量選擇在多點(diǎn)定標(biāo)：RF、CRPREAL RELATION AND CURVE

23、OF CALIBRATIONSTRAIGHT LINE CALIBRATION(THERE IS AN ERROR)concentrationOD increment2020/11/340多點(diǎn)定標(biāo)：RF、CRPREAL RELATION AND CCONCENTRATIONOD incrementREAL RELATIONSTRAIGHT LINECALIBRATION一點(diǎn)定標(biāo)：例如ASO2020/11/341CONCENTRATIONOD incrementREAL免疫濁度測(cè)量多點(diǎn)定標(biāo)校準(zhǔn)曲線的選擇和擬合效果檢驗(yàn)：選擇何種校準(zhǔn)曲線作數(shù)據(jù)處理，是試驗(yàn)成功的關(guān)鍵之一。一般用試劑廠家提供的或文獻(xiàn)介紹的校準(zhǔn)模式。應(yīng)該對(duì)擬合曲線作檢驗(yàn)和比較。2020/11/342免疫濁度測(cè)量多點(diǎn)定標(biāo)校準(zhǔn)曲線的選擇和擬合效果檢驗(yàn)：2020/帶現(xiàn)象（zone phenomenon）的影響抗原或抗體過剩使免疫復(fù)合物部分或全部解離的現(xiàn)象，稱