免疫實驗免疫學(xué)和免疫檢測技術(shù)試驗培訓(xùn)課件

1、免疫實驗免疫學(xué)和免疫檢測技術(shù)試驗免疫實驗免疫學(xué)和免疫檢測技術(shù)試驗離心單個核細胞（斜面?。?、加于淋巴細胞分離液上層，離心：500g 20min（小于1000rpm)！沿管壁滴加 !淋巴細胞分離液取法3、吸出細胞，懸于營養(yǎng)緩沖液（12倍量含5IU/ml肝素、2滅活小牛血清的PBS液 ），離心：200g 10min，除去血小板。4、洗滌：同樣營養(yǎng)液洗滌2次，洗去淋巴細胞分離液，離心： 500g 10min2免疫實驗免疫學(xué)和免疫檢測技術(shù)試驗離心單個核細胞2、加于淋巴細胞分離液上層，離心：500g 25、檢查細胞存活率：（1）將1滴細胞懸液和1滴臺盼蘭混勻，靜置5-10分鐘。（2）上述混合液滴入細胞計

2、數(shù)板，在顯微鏡下觀察細胞，計數(shù)活細胞數(shù)和死細胞數(shù)。三、注意事項：1。血液制品2。注意將稀釋后的血輕輕地沿管壁鋪在細胞分離液上，避免破壞其界面。 3。在收集單個核細胞時，預(yù)先將毛細滴管中的氣體排空，再將毛細滴管輕輕插入單個核細胞層，沿管壁輕輕旋轉(zhuǎn)吸取細胞，千萬不能吹打，以免影響細胞的收集效果。 3免疫實驗免疫學(xué)和免疫檢測技術(shù)試驗5、檢查細胞存活率：3免疫實驗免疫學(xué)和免疫檢測技術(shù)試驗免疫實驗免疫學(xué)和免疫檢測技術(shù)試驗培訓(xùn)課件實驗二、酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)（ELISA） 一、實驗原理： 酶聯(lián)免疫測定法實質(zhì)上是將專一性很強的、十分靈敏的、能夠定量進行的抗原抗體結(jié)合反應(yīng)與高催化效能的酶促反應(yīng)偶聯(lián)在一起的一種分析

3、方法。它除了用來測定抗體外，原則上適用于一切可以誘導(dǎo)動物產(chǎn)生相應(yīng)抗體的抗原和半抗原物質(zhì)的測定。其特點是專一性強，靈敏度高，操作簡便，無須特殊設(shè)備，特別適用于測定成分復(fù)雜的體液及組織中的微量生命物質(zhì)，而且?guī)缀醪皇芷渌镔|(zhì)的干擾。 5免疫實驗免疫學(xué)和免疫檢測技術(shù)試驗實驗二、酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)（ELISA） 一、實驗原理：5免一、原理（續(xù)）測定方法：酶聯(lián)免疫測定法應(yīng)用非常廣泛。具體操作方法隨測定對象及測定要求的不同而有很大差異。液相固相吸附測定法酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)簡稱酶標(biāo)法。酶標(biāo)法的基本測定方法有三類：即間接法(抗原-抗體-酶標(biāo)抗抗體)雙抗體(夾心)法(抗體-抗原-酶標(biāo)抗體)抗原競爭法。

4、 6免疫實驗免疫學(xué)和免疫檢測技術(shù)試驗一、原理（續(xù)）測定方法：6免疫實驗免疫學(xué)和免疫檢測技術(shù)試驗本次實驗檢測血清IgG，應(yīng)用的是雙抗體夾心法。 7免疫實驗免疫學(xué)和免疫檢測技術(shù)試驗本次實驗檢測血清IgG，應(yīng)用的是雙抗體夾心法。 7免疫實驗免二、實驗方法：1、包被抗體： 包被抗體濃度為：用包被液稀釋（包被聚苯乙烯要在偏堿性條件下進行，所以該包被液用pH9.6的碳酸鹽緩沖溶液）抗體至10或20ug/ml，每孔加100ul。加18孔18孔的安排：套上包裝袋，4過夜，棄上清，以洗滌液(200ul)洗滌三次，甩干。關(guān)于對照、平行！標(biāo)準(zhǔn)：S1-S5ELISA熒光免疫空白對照陰性對照陽性對照8免疫實驗免疫學(xué)和免

5、疫檢測技術(shù)試驗二、實驗方法：1、包被抗體： 包被抗體濃度為：用2、加抗原：！稀釋抗原用加BSA的保溫液稀釋！如上頁圖所示，加抗原，空白和熒光陰性對照加含BSA的保溫液標(biāo)準(zhǔn)抗原1-5的濃度分別為：50，100，200，300，500ng/ml(都從500ng/ml加，分別加10，20，40，60，100ul至各孔，再分別補加90，80，60，40，0ul保溫液即可)熒光各孔：陰性對照：Ab-Ag-FITC-Ab，陽性對照用200ng/ml，500ng/ml37，1hr，洗滌液洗滌三次9免疫實驗免疫學(xué)和免疫檢測技術(shù)試驗2、加抗原：9免疫實驗免疫學(xué)和免疫檢測技術(shù)試驗3、加酶標(biāo)抗體、熒光標(biāo)記抗體：所有

6、ELISA各孔均加100ul（已稀釋好,稀釋倍數(shù)：2000各熒光孔不加酶標(biāo)抗體，加熒光標(biāo)記抗體100ul,(已稀釋好，稀釋倍數(shù)：50)！注意！熒光怕見光，注意避光，加液、保溫時都要避光37，45min，取出后保溫平衡10分鐘,洗滌液洗滌三次，熒光各孔可不洗10免疫實驗免疫學(xué)和免疫檢測技術(shù)試驗3、加酶標(biāo)抗體、熒光標(biāo)記抗體：10免疫實驗免疫學(xué)和免疫檢測技4、觀察熒光、ELISA各孔加底物：一組同學(xué)觀察熒光、一組同學(xué)加酶底物。酶底物溶液要現(xiàn)配，由老師或同學(xué)代表配制一份即可。各孔加100ul，37保溫15min。終止酶反應(yīng)：各孔加4mlol/L硫酸50ul終止。5、酶標(biāo)儀上測各孔492nm的光吸收。打

7、印直線附在實驗報告上！11免疫實驗免疫學(xué)和免疫檢測技術(shù)試驗4、觀察熒光、ELISA各孔加底物：11免疫實驗免疫學(xué)和免疫實驗三、納米金免疫檢測技術(shù)一、實驗原理：以雙抗體夾心法為例。在硝酸纖維素膜的膜片上滴加純化的抗體，為膜所吸附。當(dāng)?shù)渭釉谀ど系臉?biāo)本液體滲濾過膜時，標(biāo)本中含抗原被膜上抗體捕獲，其余無關(guān)蛋白等濾出膜片。其后加入的膠體金標(biāo)記的抗體也在滲濾中與已結(jié)合在膜上的抗原相結(jié)合。因膠體金本身呈紅色，陽性反應(yīng)即在膜中央顯示紅色斑點。12免疫實驗免疫學(xué)和免疫檢測技術(shù)試驗實驗三、納米金免疫檢測技術(shù)一、實驗原理：12免疫實驗免疫學(xué)和一、實驗原理本實驗不用夾心法，直接加抗原，再加金標(biāo)抗體。13免疫實驗免疫學(xué)

8、和免疫檢測技術(shù)試驗一、實驗原理本實驗不用夾心法，直接加抗原，再加金標(biāo)抗體。13二、實驗操作：點加抗原：（人IgG）：在硝酸纖維素膜下墊吸水材料（衛(wèi)生紙），用微量移液器取3ul抗原溶液點于硝酸纖維素膜上，注意點樣時要逐次點于膜上，待前次所點液體滲入后再繼續(xù)點，不要使斑點太大，同時注意不要太用力將膜點破，致使斑點太大。 烤干或吹干，保證抗原能夠吸附到膜上，給蛋白質(zhì)一定吸附時間，否則下步的洗滌有可能將蛋白洗掉?。Ｏ礈?、封閉：點加10ul 含1%BSA的PBS洗滌（BSA作用是封閉），待干（注意別讓BSA覆蓋前一步抗原），另點1個點（作為陰性對照）。14免疫實驗免疫學(xué)和免疫檢測技術(shù)試驗二、實驗操作：

9、點加抗原：（人IgG）：在硝酸纖維素膜下墊吸點加金標(biāo)抗體：金標(biāo)記抗體稀釋至1：25-1：50，點加10ul，即可在陽性對照點處觀察到紅色斑點，而陰性對照則無。15免疫實驗免疫學(xué)和免疫檢測技術(shù)試驗點加金標(biāo)抗體：金標(biāo)記抗體稀釋至1：25-1：50，點加10三、注意事項：1斑點大小控制。2勿用力戳破膜。3給第一抗體和封閉蛋白（BSA）一定吸附時間。4把你的實驗結(jié)果粘貼于實驗報告上，報告測定結(jié)果，指出陽性點和陰性點。16免疫實驗免疫學(xué)和免疫檢測技術(shù)試驗三、注意事項：1斑點大小控制。16免疫實驗免疫學(xué)和免疫檢測實驗四、免疫熒光檢測技術(shù)一、基本原理：熒光雙抗夾心法定位與定量抗原二、操作： 1、抗體包被：（同實驗二）2、加樣本：同實驗二，但在本實驗中不做標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣品加兩個稀釋濃度，如1：20，1：40，另外加一個陽性對照（用人IgG標(biāo)準(zhǔn)），每孔做一個復(fù)孔，加空白對照共計8孔。3、加熒光抗體：從這里開始與實驗二不同之處是一定要記得避光操作。按照要求加入一定稀釋度的熒光標(biāo)記抗人IgG抗體（一般為1：80倍左右），避光37保溫箱中保溫30-45分鐘。17免疫實驗免