治療性抗體研發(fā)的進(jìn)展和關(guān)鍵技術(shù)課件

1、治療性抗體研發(fā)的進(jìn)展和關(guān)鍵技術(shù)治療性抗體研發(fā)的進(jìn)展和關(guān)鍵技術(shù)主要內(nèi)容治療性抗體研發(fā)概況治療性抗體研發(fā)的主要進(jìn)展治療性抗體研發(fā)中要注意的問題主要內(nèi)容治療性抗體研發(fā)概況治療性抗體研發(fā)的進(jìn)展和關(guān)鍵技術(shù)課件治療性抗體研發(fā)的進(jìn)展和關(guān)鍵技術(shù)課件基因特克： Wassim NashabehTerminologies: Aggregates, main peak, fragmentsContainer Integrity TestingDi-, tri-sulfide bond formation N, O-Glycosylation, et al, mAbs, 2010, 2 :3, 285-298.CTLA

2、-4 黑色素瘤FormulationHydrolysis (DP)Formulation抗體分子結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：四條肽鏈，重鏈糖基化，結(jié)構(gòu)上有較多二硫鍵通過雙特異性抗體靶向效應(yīng)細(xì)胞發(fā)現(xiàn)藥物靶標(biāo)的主要方法KADCYLA (T-DM1)二聚體克隆篩選是質(zhì)量控制的關(guān)鍵步驟Assays: HPSEC, CE-SDS, SDS, AUCVEGF 結(jié)腸癌 肺癌用抗體藥物治療的疾病腫瘤自身免疫病感染性疾病抗移植排斥心血管疾病骨質(zhì)疏松罕見病眼黃斑變性炭疽基因特克： Wassim Nashabeh用抗體藥物治療的疾抗體結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系抗體結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系抗體藥物的作用機(jī)理直接效應(yīng) 誘導(dǎo)凋亡 抑制增殖 阻斷生長因子或生長因

3、子受體 干擾血管生成間接效應(yīng) 依賴補(bǔ)體的細(xì)胞毒（CDC） 依賴抗體的細(xì)胞毒（ADCC) 作為毒素、放射性同位素和細(xì)胞 毒藥物的載體 形成抗獨(dú)特型抗體 通過雙特異性抗體靶向效應(yīng)細(xì)胞抗體藥物的作用機(jī)理直接效應(yīng) 誘導(dǎo)凋亡抗體藥物在臨床應(yīng)用中面臨的挑戰(zhàn)免疫原性殺傷靶細(xì)胞的活性弱成藥性問題新靶點(diǎn)抗體藥物在臨床應(yīng)用中面臨的挑戰(zhàn)免疫原性抗體藥物研發(fā)的主要進(jìn)展降低抗體的免疫原性改變抗體的效應(yīng)功能提高抗體表達(dá)量引入先進(jìn)的抗體表征和質(zhì)控方法改進(jìn)抗體規(guī)?；a(chǎn)技術(shù)新靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)抗體藥物研發(fā)的主要進(jìn)展降低抗體的免疫原性CDR移植FR移植SDR移植表面氨基酸重塑Phage display轉(zhuǎn)基因鼠單細(xì)胞PCR人工設(shè)計(jì)抗體人

4、源化和人源抗體CDR移植Phage display抗體人源化和人源抗體人源抗體制備的主要技術(shù)EB病毒轉(zhuǎn)化人B細(xì)胞人-人雜交瘤技術(shù)抗體庫技術(shù)轉(zhuǎn)基因小鼠人工設(shè)計(jì)和合成人源抗體人源抗體制備的主要技術(shù)EB病毒轉(zhuǎn)化人B細(xì)胞抗體庫技術(shù)轉(zhuǎn)基因小鼠抗體庫技術(shù)轉(zhuǎn)基因小鼠人工設(shè)計(jì)和合成人源抗體Her2晶體結(jié)構(gòu)D4SDS非還原電泳155KDaHF人源表達(dá)抗體的純化和功能鑒定HF人源抗體基因合成、構(gòu)建、表達(dá)人源化抗體設(shè)計(jì)、虛擬篩選抗體專家分析系統(tǒng)抗原抗體復(fù)合物結(jié)構(gòu)信息分析HF人源抗體對Her2+ +細(xì)胞的ADCC殺傷效應(yīng)分析HFSKVO3 Her2+MCF7 - Her2+HerceptinSKVO3 Her2+MC

5、F7 - Her2+HF人源抗體對Her2靶點(diǎn)的特異性識別人工設(shè)計(jì)和合成人源抗體Her2晶體結(jié)構(gòu)D4SDS非1986199419971998200020012002200320042006200720082009201020112012鼠源 嵌合 人源化 人源FDA批準(zhǔn)的抗體藥物OKT3ReoProRituxanZenapaxSimulectSynagisRemicadeHerceptinEnbrelMylotargCampathZevalinHumiraXolairBexxarRaptivaAvastinErbituxTysabriLucentisVectibixSolirisCimziaA

6、ctemraStelaraSimponiIlarisArzerraNumaxProliaABThraxBenlystaYervoyPerjeta1986鼠源 嵌合 第二代抗體藥物抗TNF adalimuab (Humira，全人抗體） certolizumab（Cimzia，PEG修飾的Fab） golimumab （Simponi，全人抗體）抗CD20 ofatumumab （Arzerra， 全人抗體）抗RSV motarizumab （親和力更高）抗EGFR panitumumab （Vectibix， 全人抗體）第二代抗體藥物抗TNF adalimuab (Hum抗體效應(yīng)功能的改造定點(diǎn)

7、突變改造Fc改變糖基化雙特異性或多特異性抗體抗體效應(yīng)功能的改造定點(diǎn)突變改造Fc減弱抗體的效應(yīng)功能Fc上進(jìn)行定點(diǎn)突變 Teplizumab(Leu234Ala,Leu235Ala)去糖基化 Otelixizumab(去糖基化，Asn297Ala)選擇IgG4亞型或雜合亞型（IgG2/IgG4）Fc融合蛋白減弱抗體的效應(yīng)功能Fc上進(jìn)行定點(diǎn)突變提高抗體的效應(yīng)功能雙特異性抗體改變抗體效應(yīng)功能偶聯(lián)細(xì)胞毒物質(zhì)抗體Fc突變改變抗體糖基化細(xì)胞內(nèi)抗體抗體融合蛋白提高抗體的效應(yīng)功能雙特異性抗體改變抗體偶聯(lián)細(xì)胞毒物質(zhì)抗體Fc直接效應(yīng) 誘導(dǎo)凋亡Terminologies: sequence polymorphism;

8、 mutation; mis-incorporation; sequence extension, insertion, deletion, and crossover.HER2 乳腺癌Basic Variants, 18%MT111,MEDI565突變Met252Tyr，Ser254Thr，Thr256Glu增加抗體的半壽期S-GlutathionylationProduct RecoveryCD30 x CD16A抗CD20 ofatumumab （Arzerra， 全人抗體）形成抗獨(dú)特型抗體Proteolytic processing (C-term)直接效應(yīng) 誘導(dǎo)凋亡1 抗體Fc突變提

9、高效應(yīng)功能突變Ser239Asp，Glu330Leu，ILe332Glu提高ADCC突變Gly236Ala，Ser239Asp，ILe332Glu提高ADCP和ADCC雜合IgG亞型提高CDC突變Met252Tyr，Ser254Thr，Thr256Glu增加抗體的半壽期1 抗體Fc突變提高效應(yīng)功能突變Ser239Asp，Glu32 改變抗體Fc的糖基化2 改變抗體Fc的糖基化各種糖基化變化對抗體功能的影響來自潘海報(bào)告各種糖基化變化對抗體功能的影響來自潘海報(bào)告第三代抗體藥物抗CD20 obinutuzumab（糖基化改造，提高 ADCC） AME-133v (Fc改造，提高ADCC) TRLI-

10、05 (Fc改造，提高ADCC) Pro13192 (Fc改造，提高ADCC)抗RSV/F MEDI-557 (Fc改造，增加半壽期)第三代抗體藥物抗CD20 obinutuzumab（糖3 抗體上偶聯(lián)細(xì)胞毒物質(zhì)3 抗體上偶聯(lián)細(xì)胞毒物質(zhì)治療性抗體研發(fā)的進(jìn)展和關(guān)鍵技術(shù)課件單抗: 癌細(xì)胞表面過量表達(dá)的抗原且能內(nèi)吞。偶聯(lián)鏈: 在血液中穩(wěn)定但可以在細(xì)胞內(nèi)釋放毒素。毒素藥物: 需要極毒的可以抑制細(xì)胞生長的化合物賴氨酸 偶聯(lián)輕重鏈間二硫鍵偶聯(lián)定點(diǎn)偶聯(lián)KADCYLA (T-DM1)Genentech/ImmunogenADCETRIS (aCD33-vcMMAE)Seattle GeneticsThio-M

11、ab or Ambrxs unnatural AA incoporation抗體-藥物偶聯(lián)技術(shù)單抗: 癌細(xì)胞表面過量表達(dá)的抗原且能內(nèi)吞。賴氨酸 偶聯(lián)輕重鏈FDA批準(zhǔn)的ADC藥物放射性同位素，Bexxar, Zevalin毒素小分子藥物，Mylotarg，T-DM1 AdcetrisFDA批準(zhǔn)的ADC藥物放射性同位素，Bexxar, Ze4 雙特異性抗體4 雙特異性抗體歐洲上市的雙特異性抗體歐洲上市的雙特異性抗體在臨床試驗(yàn)的雙特異性抗體抗體名稱靶抗原臨床試驗(yàn)SAR156597IL4 x IL13Phase IAFM13CD30 x CD16APhase IFBT-A05,Bi20CD20 x C

12、D3Phase IMT110EpCAM x CD3Phase IMT111,MEDI565CEA x CD3Phase IIMCgp100Gp100 x CD3Phase ITF2CEA x IMP288 haptenPhase IMEHD-7945AEGFR x HER3;dual IgG1Phase IMM-111HER2 x HER3Phase ICVX-241Ang2 x VEGF;dual IgG1Phase IIOzoralizumab ATN103TNF x albuminPhase II在臨床試驗(yàn)的雙特異性抗體抗體名稱靶抗原臨床試驗(yàn)SAR15655 免疫細(xì)胞因子5 免疫細(xì)胞因子

13、靶抗原選擇針對已確認(rèn)過的靶 臨床確認(rèn) 實(shí)驗(yàn)確認(rèn)尋找新的功能性靶抗原靶抗原選擇針對已確認(rèn)過的靶自身免疫病的治療靶自身免疫病的治療靶上市抗腫瘤抗體藥物的靶抗原靶分子 適 應(yīng) 癥CD20 NHL CLLHER2 乳腺癌 CD52 CLL EGFR 結(jié)腸癌 VEGF 結(jié)腸癌 肺癌 CD33 AML CTLA-4 黑色素瘤 CD30 淋巴瘤 上市抗腫瘤抗體藥物的靶抗原靶分子 適治療性抗體研發(fā)的進(jìn)展和關(guān)鍵技術(shù)課件治療性抗體研發(fā)的進(jìn)展和關(guān)鍵技術(shù)課件發(fā)現(xiàn)藥物靶標(biāo)的主要方法分子流行病學(xué)調(diào)查人類遺傳學(xué)研究人類功能基因組學(xué)蛋白組學(xué)生物信息學(xué)藥理學(xué)模式動物發(fā)現(xiàn)藥物靶標(biāo)的主要方法分子流行病學(xué)調(diào)查候選基因可成藥的候選藥靶

14、與疾病的相關(guān)性候選基因可成藥的候選藥靶與疾病的相關(guān)性治療性抗體研發(fā)中要注意的問題抗體分子結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：四條肽鏈，重鏈糖基化，結(jié)構(gòu)上有較多二硫鍵L治療性抗體研發(fā)中要注意的問題抗體分子結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：四條肽鏈，重鏈Protein expressionSolubilitystability 抗體結(jié)構(gòu)與成藥性的關(guān)系Protein expression 抗體結(jié)構(gòu)與成藥性的關(guān)系Master Cell BankWorking Cell BankRaw MaterialsSmall-scale Cell CultureLarge-scale Cell CultureProduct RecoveryProduct Fil

15、trationFormulationPool BulksSterile Filter, Fill, and Partial Stopper VialsLyophilizeCap VialsLiquid ProductsProduct InspectionContainer Integrity TestingLabeled Final Vial ProductPackaging單抗體生產(chǎn)工藝和過程Drug Substance李鋒Drug ProductMaster Cell BankWorking Cell B從細(xì)胞表達(dá)到病人臨床注射，單抗體藥物可能發(fā)生多種反應(yīng)變化細(xì)胞培養(yǎng)配伍制劑和儲藏分離純化

16、臨床注射和新陳代謝酶糖基化化學(xué)糖基化還原反應(yīng)序列變異還原反應(yīng)水解反應(yīng)聚合化氧化反應(yīng)異構(gòu)化化學(xué)糖基化脫氨基化巰基半胱胺酸化酶降解反應(yīng)理化分析和質(zhì)量控制對于抗體制藥工業(yè)各個環(huán)節(jié)起著支持和指導(dǎo)的重要作用。如同眼睛對人的作用一樣，沒有好的分析手段和方法，抗體生產(chǎn)過程就可能走向歧途。 引自張伯彥報(bào)告從細(xì)胞表達(dá)到病人臨床注射，單抗體藥物可能發(fā)生多種反應(yīng)變化細(xì)胞可變區(qū)： 選擇Gln為氨基末端，減少電荷變異 突變CDR區(qū)上不穩(wěn)定的點(diǎn) 突變某些氨基酸，避免抗體聚合 去除可變區(qū)上的糖基化位點(diǎn)恒定區(qū)： 鉸鏈區(qū)改造避免出現(xiàn)半個抗體和不規(guī)則 二硫鍵或異型結(jié)構(gòu) 提高與FcRn結(jié)合，增加血清半壽期影響抗體藥物穩(wěn)定性和效能的

17、因素可變區(qū)：影響抗體藥物穩(wěn)定性和效能的因素單抗體藥物產(chǎn)品是各種變異體的混合物 電荷變異體 by iCIEF 7.07.27.47.67.88.08.28.48.68.89.09.29.4Lower pI MarkerUpper pI MarkerMain Peak, 54% Acidic Variants, 28%Basic Variants, 18% 序列變異體 by Tryptic Peptide Map Clone# M83R 體積變異體 by SEC 二聚體 脫氨基化 (32)Met 氧化 (22)糖基化（22)高甘露糖化,G0, G1,G1,G2（5）唾液酸化（5）C-端Lys （2

18、）2644552=9600(9600)2 108 約1億個可能的變異體！美國FDA： Steven Kozlowski 基因特克： Wassim NashabehOODDDGGKKpyro-EODGGDODpyro-E單抗體藥物產(chǎn)品是各種變異體的混合物 Amidation (C-term)*Di-, tri-sulfide bond formation N, O-GlycosylationC-mannosylation (W)Proteolytic processing (C-term)Sequence Variants Oxidation (M, W, H, F, Y)S-Cysteinyl

19、ationDisulfide scramblingS-GlutathionylationThioether formationReduction Deamidation (NG,NT,NS) Isomerization (DG,DS,DD) TransaminationGlycation (K)Hydrolysis (DP)1。影響抗體質(zhì)量的蛋白表達(dá)后修飾細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞外都有發(fā)生；2。質(zhì)控的目標(biāo)是降低或避免在生產(chǎn)過程中不希望看到的 PTM和序列變異發(fā)生的現(xiàn)象?？寺『Y選是質(zhì)量控制的關(guān)鍵步驟Amidation (C-term)*Oxidation (mAb Variants and Character

20、ization MethodologiesSize Variants (體積變異體）Terminologies: Aggregates, main peak, fragmentsAssays: HPSEC, CE-SDS, SDS, AUCCharge Variants （電荷變異體）Terminologies: Acidic peak, main peak, and basic peak variantsAssays: HPIEC, iCIEF, pH-IECSequence Variants （序列變異體）: caused by unintended amino acid substitutionsTerminologies: sequence polymorphism; mutation; mis-incorporation; sequence