水糞大腸菌數(shù)檢測(業(yè)內(nèi)借鑒)課件

1、09工業(yè)環(huán)保與安全技術水總大腸菌群檢測09工業(yè)環(huán)保與安全技術水總大腸菌群檢測工作流程實驗工作流程實驗理論知識講解儀器使用說明書安全注意事項2專業(yè)課件工作流程實驗工作流程實驗理論知識講解儀器使用說明書安全注意事工作流程實驗流程分組取樣依單卡領物品實驗返還物品提交報告3專業(yè)課件工作流程實驗流程分組取樣依單卡領物品實驗返還物品提交報告3專 當環(huán)境受到污染后，環(huán)境的 物理性質(zhì) 化學性質(zhì) 生物學特性 如：重金屬離子、NO3- 濃度增加；水體污染變質(zhì)，水生生物種類減少，甚至滅絕；發(fā)生變化理論知識4專業(yè)課件 當環(huán)境受到污染后，環(huán)境的發(fā)生變化理論知識4專業(yè)課件如何監(jiān)測？化學方法：快速、定性定量反映污染物濃度，

2、但為瞬時值； 生物學方法：利用生物種類、數(shù)量的變化，生物學特性的改變來監(jiān)測污染物對環(huán)境的影響。可監(jiān)測到污染物對環(huán)境的綜合影響，但不易精確反映污染物的性質(zhì)、濃度和數(shù)量。5專業(yè)課件如何監(jiān)測？化學方法：快速、定性定量反映污染物濃度，但為瞬時值生活飲用水衛(wèi)生標準2006年12月29日，衛(wèi)生部、國家標準化委員會發(fā)布2006年第12號文件，批準發(fā)布生活飲用水衛(wèi)生標準及檢測方法國家標準。標準自2007年7月1日起實施，其中生活飲用水衛(wèi)生標準中非常規(guī)指標的實施項目和日期由省級人民政府根據(jù)當?shù)貙嶋H情況確定。全部指標最遲于2012年7月1日實施。6專業(yè)課件生活飲用水衛(wèi)生標準2006年12月29日，衛(wèi)生部、國家標飲

3、用水中微生物指標項目單位限值說明總大腸菌群MPN/100mL或CFU/100mL不得檢出一般性污染耐熱大腸菌群MPN/100mL或CFU/100mL不得檢出指示糞便污染大腸埃希氏菌MPN/100mL或CFU/100mL不得檢出指示糞便污染菌落總數(shù)CFU/mL100一般性污染賈第鞭毛蟲個/10 L1腸道原蟲隱孢子蟲個/10 L1腸道原蟲7專業(yè)課件飲用水中微生物指標項目單位限值說明總大腸菌群MPN/100m新國標常規(guī)項目限值變化原國標新國標砷0.05 mg/L0.01 mg/L鎘0.01 mg/L0.005 mg/L鉛0.05 mg/L0.01 mg/L硝酸鹽（以N計）20 mg/L10 mg/L

4、濁度3度1NTU8專業(yè)課件新國標常規(guī)項目限值變化原國標新國標砷0.05 mg/L0.0 檢品 膽鹽乳糖發(fā)酵管 伊紅美蘭平板 大腸桿菌菌落純培養(yǎng) 乳糖復發(fā)酵管（-） 乳糖復發(fā)酵管（） 大腸菌群的檢測流程9專業(yè)課件大腸菌群的檢測流程9專業(yè)課件總大腸菌群當飲用水受到糞便等污染，就有可能帶有沙門氏菌、志賀氏菌、弧菌、腸道病毒等，且它們均可以水為媒介引起腸道傳染病?？偞竽c菌群含量可表明水體被污染的程度，并且間接地表明腸道病菌存在的可能，以及對人體健康具有潛在危險性。 10專業(yè)課件總大腸菌群當飲用水受到糞便等污染，就有可能帶有沙門氏菌、志賀糞大腸菌群糞大腸菌為總大腸菌群的一個亞種；直接來自糞便，除了它耐熱

5、，在44-44.5的高溫條件下仍可生長繁殖并將色氨酸代謝成吲哚，其他特性均與總大腸菌群相同。由于總大腸菌群既包括糞便污染，同時也包括非糞便污染的大腸菌總數(shù)，因此，有必要在飲用水標準中增加糞大腸菌群這個指標，以便直接反映出水體是否受到糞便污染的信息，進一步確保流行病學的安全。11專業(yè)課件糞大腸菌群糞大腸菌為總大腸菌群的一個亞種；直接來自糞便，除了糞大腸菌群檢測方法注解 總大腸菌群中的細菌除生活在腸道中外，在自然環(huán)境中的水與土壤中也經(jīng)常存在，但此等在自然環(huán)境中生活的大腸菌群培養(yǎng)的最合適溫度為25左右，如在37培養(yǎng)則仍可生長，但如將培養(yǎng)溫度再升高至44.5，則不再生長，而直接來自糞便的大腸菌群細菌，

6、習慣于37左右生長，如將培養(yǎng)溫度升高至44.5仍可繼續(xù)生長。 因此，可用提高培養(yǎng)溫度方法將自然環(huán)境中的大腸菌群與糞便中的大腸菌群區(qū)分。在37培養(yǎng)生長的大腸菌群，包括在糞便內(nèi)生長的大腸菌群稱為“總大腸菌群”(Total coliform)；在44.5仍能生長的大腸菌群，稱為“糞大腸菌群”(Fecal coliform)，糞大腸菌群細菌在衛(wèi)生學上具有重要的意義。12專業(yè)課件糞大腸菌群檢測方法注解 總大腸菌群中的細菌除生活在目的：1.學習水樣的采取方法和水樣總大腸菌菌群測定的方法；2.了解水源水的平板菌落計數(shù)的原則。13專業(yè)課件目的：1.學習水樣的采取方法和水樣總大腸菌菌群測定的方法；1水中總大腸菌

7、群的測定一、測定意義 作為水體受糞便污染的指標。 二、總大腸菌群的特征 在37 48h之內(nèi)發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣 是革蘭氏陰性無芽孢桿菌 在特殊培養(yǎng)基上能夠長出具有典型特征的菌落 14專業(yè)課件水中總大腸菌群的測定一、測定意義 作為水體受糞便污染的指標。實驗原理：目前檢測大腸菌群的標準分析法是多管發(fā)酵法。多管發(fā)酵法包括初步發(fā)酵試驗，平板劃線分離和復發(fā)酵試驗三部分。15專業(yè)課件實驗原理：目前檢測大腸菌群的標準分析法是多管發(fā)酵法。15專業(yè) 水中總大腸菌群的測定 總大腸菌群:指那些能在37 48h之內(nèi)發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣的、需氧及兼性厭氧的革蘭氏陰性的無芽孢桿菌。主要包括有埃希氏菌屬、檸檬酸桿菌屬、腸桿菌屬、克

8、雷伯氏菌屬等菌屬的細菌。 生活飲用水的總大腸菌群數(shù)每升不得超過3個16專業(yè)課件 水中總大腸菌群的測定 總大腸菌群:指那些能在37 48h水中總大腸菌群的測定一、多管發(fā)酵法 (1) 生活飲用水 初發(fā)酵試驗 平板分離 復發(fā)酵試驗 陽性管接種在伊紅美蘭培養(yǎng)基上，37培養(yǎng)1824h，挑選典型特征的菌落，涂片、革蘭氏染色、鏡檢 各100mL原水樣各10mL3724hG-G-G+3718-24h3724h17專業(yè)課件水中總大腸菌群的測定一、多管發(fā)酵法 (1) 生活飲用水 (2) 水源水：將水樣作1：10稀釋 水樣25mL225mL無菌水各1mL各1mL各10mL10-13724h水源水大腸菌群的測定18專

9、業(yè)課件(2) 水源水：將水樣作1：10稀釋 水樣25mL225mL(3) 地表水和廢水：水樣應作1:10，1:100，1:1000或更高的稀釋 MPN值=MPN指數(shù) 水源水大腸菌群的測定19專業(yè)課件(3) 地表水和廢水：水樣應作1:10，1:100，1:10水源水大腸菌群的測定1.初發(fā)酵試驗 水樣25mL225mL無菌水各1mL各1mL各10mL10-1EC培養(yǎng)液3724h44.52448h20專業(yè)課件水源水大腸菌群的測定1.初發(fā)酵試驗 水樣25mL225mL無2.復發(fā)酵試驗 陽性管接到EC培養(yǎng)液中。在37溫度下培養(yǎng)24h2h，立即觀察，發(fā)酵管產(chǎn)氣則證實為大腸菌群陽性 3.計算和報告結果 查M

10、PN表，按總大腸菌群的計算方法計算每升水中糞大腸菌群細菌的MPN值 水源水大腸菌群的測定21專業(yè)課件2.復發(fā)酵試驗 陽性管接到EC培養(yǎng)液中。在37溫度下培養(yǎng)2檢測操作方法檢品取樣培養(yǎng)基配制滅菌與消毒接種培養(yǎng)與計數(shù)22專業(yè)課件檢測操作方法檢品取樣培養(yǎng)基配制滅菌與消毒接種培養(yǎng)與計數(shù)22專檢品取樣1.水體取樣： 應取距水面1015cm的深層水樣。先將滅菌的帶玻璃塞瓶，瓶口向下浸入水中，然后翻轉過來，除去玻璃塞，水立即流入瓶中，盛滿后，將瓶塞蓋好，再從水中取出。2. 自來水取樣： 打開自來水龍頭，讓水流流出1min左右，用燒杯接取自來水。23專業(yè)課件檢品取樣1.水體取樣：23專業(yè)課件3. 將河水水樣分

11、別稀釋成10-1、10-2、10-3三個連續(xù)稀釋濃度（注意：在稀釋前后一定要充分混勻）、自來水樣不稀釋。 注意：河水樣的稀釋，取1個滅菌空試管，加入9mL滅 菌水。用取過滅菌水的移液管取1mL河水樣，放入試管中，振蕩試管混合均勻。 檢品取樣24專業(yè)課件3. 將河水水樣分別稀釋成10-1、10-2、10-3三個連或者是品紅亞硫酸鈉培養(yǎng)基。生長特征菌落。發(fā)酵（產(chǎn)酸產(chǎn)氣）EC肉湯配方：胰蛋白胨20g/l乳糖5g/l3號膽鹽1.5g/lK2HPO4 4g/lKH2PO4 1.5g/lNaCl 5g/lpH：7.0初發(fā)酵（產(chǎn)酸產(chǎn)氣）EC肉湯伊紅美蘭培養(yǎng)基3倍EC肉湯培養(yǎng)基配制25專業(yè)課件或者是品紅亞硫酸

12、鈉培養(yǎng)基。生長特征菌落。發(fā)酵（產(chǎn)酸產(chǎn)氣）初發(fā)品紅亞硫酸鈉培養(yǎng)基（Endo Agar）（遠藤瓊脂培養(yǎng)基）26專業(yè)課件品紅亞硫酸鈉培養(yǎng)基（Endo Agar）（遠藤瓊脂培養(yǎng)基）2品紅亞硫酸鈉培養(yǎng)基平板及典型菌落27專業(yè)課件品紅亞硫酸鈉培養(yǎng)基平板及典型菌落27專業(yè)課件伊紅美藍培養(yǎng)基 蛋白胨 10g乳糖 10g磷酸氫二鉀 2g瓊脂 2030g蒸餾水 1000ml2%伊紅水溶液 20ml0.5 %美藍水溶液 13ml 28專業(yè)課件伊紅美藍培養(yǎng)基 蛋白胨 10g28專業(yè)課件滅菌與消毒滅菌1.無菌操作中需要用到的器具需滅菌，如取樣瓶、培養(yǎng)皿、涂布棒等；2.培養(yǎng)基需滅菌；3.無菌水需滅菌。消毒1.接種前，空氣

13、環(huán)境需紫外線消毒；2.無菌操作時，手需酒精消毒29專業(yè)課件滅菌與消毒滅菌1.無菌操作中需要用到的器具需滅菌，如取樣瓶、1.加熱已經(jīng)配制好的固體培養(yǎng)基（牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基），使固體培養(yǎng)基溶化。2.倒制平板：每個空平皿中倒約20mL的培養(yǎng)基，放置桌面待其凝固。3.用移液管吸取0.1mL水樣，滴于平板中；將玻璃涂布棒于酒精燈的外焰上加熱，殺死表面微生物，待其冷卻后用涂布棒將水滴均勻的涂滿整個平板表面，盡量將水涂干。5. 倒置于37度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。涂布平板接種法：30專業(yè)課件1.加熱已經(jīng)配制好的固體培養(yǎng)基（牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基），使涂布平板接種法：31專業(yè)課件涂布平板接種法：31專業(yè)課件

14、1.挑取無片狀菌苔生長的平板作為計數(shù)平板，若片狀菌苔的大小不到平板的一半，而其余的一半菌落分布很均勻時，可將此一半的菌落數(shù)乘2以代表全平板的菌落數(shù)。 2.選擇平均菌落數(shù)在30-300之間的平板來計算該水樣的菌落總數(shù)。如果所有的平板的菌落總數(shù)都不在30-300范圍之內(nèi)，則取最靠近30-300的平板進行計數(shù) 3. 如果有兩個稀釋濃度的總菌落數(shù)落在了30-300范圍之內(nèi)，則先計算兩個濃度下每ml水體中細菌總數(shù)，如果兩個數(shù)值的比值大于2則取小的濃度，如若小于2則取兩值的平均值。菌落計數(shù)32專業(yè)課件菌落計數(shù)32專業(yè)課件33專業(yè)課件33專業(yè)課件10-110-210-3細菌總數(shù)（個/mL)156215213

15、246822640261321856無法計數(shù)354731928104無法計數(shù)30312試一試 34專業(yè)課件10-110-210-3細菌總數(shù)15621521324682例次不同稀釋度的平均菌落數(shù)兩個稀釋度菌落數(shù)之比菌落總數(shù)/CFUmL-1報告方式/ CFUmL-110-110-210-31234561 3652 7602 890無法計算27無法計算1642952711 650113052046605135121.62.216 40037 75027 100513 00027030 50016 000或1.610438 000或3.810427 000或2.7104510 000或5.110527

16、0或2.710231 000或3.1104計算和報告計數(shù)結果 35專業(yè)課件例次兩個稀釋度菌落總數(shù)/CFUmL-1報告方式/ CFU計算根據(jù)證實有大腸菌群存在的陽性發(fā)酵管，查MPN檢索表，求出每100ml水樣中的大腸菌群數(shù)。MPN表見P19236專業(yè)課件計算根據(jù)證實有大腸菌群存在的陽性發(fā)酵管，查MPN檢索表，求出大腸菌群測定 國家標準采用三步法 大腸菌群 需氧及兼性厭氧、在37能分解乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣的革 蘭氏陰性無芽胞桿菌。 乳糖發(fā)酵試驗分離培養(yǎng)證實試驗樣品稀釋后，選擇三個稀釋度，每個稀釋度接種三管乳糖膽鹽發(fā)酵管。361培養(yǎng)482h，觀察是否產(chǎn)氣。 將產(chǎn)氣發(fā)酵管培養(yǎng)物轉種于伊紅美藍瓊脂平板上，361

17、培養(yǎng)18-24h，觀察菌落形態(tài)。挑取平板上的可疑菌落，進行革蘭氏染色觀察。同時接種乳糖發(fā)酵管361培養(yǎng)242h，觀察產(chǎn)氣情況。 根據(jù)證實為大腸桿菌陽性的管數(shù)，查MPN表，報告每100ml（g）大腸菌群的MPN值。 37專業(yè)課件大腸菌群測定 國家標準采用三較清潔樣品的三步法圖示 100mL50mL三倍濃縮乳糖蛋白胨培養(yǎng)液100mL5mL5mL5mL5mL5mL5mL5mL5mL5mL5mL水樣10mL10mL10mL10mL10mL10mL10mL10mL10mL10mL38專業(yè)課件較清潔樣品的三步法圖示 100mL50mL三倍濃縮乳糖蛋白胨三步法圖示 取產(chǎn)酸產(chǎn)氣的發(fā)酵管中培養(yǎng)液在伊紅美蘭平板上

18、進行劃線取有核心和帶金屬光澤的深紫色菌落進行革蘭氏染色乳糖蛋白胨培養(yǎng)液鏡檢（革蘭氏陰性菌）37 培養(yǎng)48h證實產(chǎn)氣（陽性）結果與否37 培養(yǎng)24h37培養(yǎng)24h 39專業(yè)課件三步法圖示 取產(chǎn)酸產(chǎn)氣的發(fā)酵管中培養(yǎng)液在伊紅美蘭平板上進行劃大腸菌群測定 計算方法 挑選菌落特征：黑紫色、有光澤或無光澤菌落； 紅色、粉紅色菌落。抑制劑：膽鹽、煌綠、十二烷基硫酸鈉。 為陰性結果的水樣體積（mL）全部水樣體積（mL） MPN 1000為陽性結果的發(fā)酵管（瓶）的數(shù)目 產(chǎn)酸判斷：紫色培養(yǎng)液變成黃色產(chǎn)氣判斷：發(fā)酵導管內(nèi)有小氣泡，如輕輕打動試管有氣泡沿管壁 上浮，應考慮可能有氣體產(chǎn)生，需進一步試驗。 40專業(yè)課件大腸菌群測定 計算方法 挑選菌落特征：黑紫色、有光澤或無光澤美國FDA標準方法行業(yè)標準采用兩步法：用于對出口食品中大腸菌群進行檢驗 推測試驗證實試驗樣品稀釋后，選擇三個稀釋度，每個稀釋度接種三管LST肉湯發(fā)酵管。361培養(yǎng)482h，觀察是否產(chǎn)氣。 將產(chǎn)氣發(fā)酵管培養(yǎng)物轉種于煌綠乳糖膽鹽（BGLB）肉湯中，361培養(yǎng)482h ，觀察是否產(chǎn)氣。以BGLB產(chǎn)氣為陽性，查MPN表，報告每ml（g）樣品中大腸菌群的MPN值。 41專業(yè)課件美國FDA標準方法行業(yè)標準采用兩步法：用于對出口食品中大 如對一自來水廠出水進行檢驗，初發(fā)酵一般