實(shí)驗(yàn)四 酸性磷酸酶Km及Vmax值測(cè)定

1、酸性磷酸酶Km及Vmax值測(cè)定清洗試管24支 酸性磷酸酶： 催化磷酸單酯的水解反應(yīng) 存在于人的肝臟，前列腺等處 植物中以發(fā)芽的種子中含量最為豐富。 是生物體中重要的一種酶類(lèi)，為某些疾病的檢測(cè)指標(biāo)。 一、概述 酶液 磷酸苯二鈉 苯酚 磷酸氫二鈉 folin-酚測(cè)定酚的濃度 計(jì)算出反應(yīng)速度（用產(chǎn)物生成量/min來(lái)表示） 根據(jù)雙倒數(shù)法計(jì)算出Km及Vmax 二、實(shí)驗(yàn)原理 V=VmaxSSKm+三、實(shí)驗(yàn)步驟：1、豆芽中的酸性磷酸酶的粗提取2、制作酶反應(yīng)時(shí)間與產(chǎn)物生成量的關(guān)系曲線(xiàn)3、制作酚標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn) 4、S與V0關(guān)系實(shí)驗(yàn) 5、雙倒數(shù)作圖法計(jì)算Vmax和Km buffersubstrateenzymeCert

2、ain TimeblankStop the reactionColor developed生化實(shí)驗(yàn)課老師：于曉虹實(shí)驗(yàn)報(bào)告請(qǐng)交到講臺(tái)上來(lái)酶液稀釋取上清液微升，稀釋倍，用大試管裝科代表李博恒 1、磷酸酶原液的制備： 稱(chēng)取5g綠豆芽莖（去頭去根），加入pH5.6的HAC緩沖液2ml研磨成漿并靜置30分鐘。紗布過(guò)濾，取1.8ml濾液,以6000rpm，離心20min，取上清。 上清液用pH 5.6的HAC緩沖液稀釋30倍，用于實(shí)驗(yàn)。2、制作酶反應(yīng)時(shí)間與產(chǎn)物生成量的關(guān)系曲線(xiàn)（目的：選取合適的反應(yīng)時(shí)間） 加 液 程 序 表管號(hào) 1 2 3 4 5 6 0磷酸苯二鈉 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5

3、0.5 0.5酶液 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5精確反應(yīng)時(shí)間 3 5 10 15 20 25 碳酸鈉溶液 2 2 2 2 2 2 2 酶液 0.5Folin酚溶液 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 Folin酚溶液已稀釋好！注： 進(jìn)行酶促反應(yīng)時(shí)，注意預(yù)熱，使所有的反應(yīng)在同等條件下開(kāi)始35保溫10分鐘0123456反應(yīng)時(shí)間03510152025吸光度結(jié)果：以反應(yīng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，A680nm為縱坐標(biāo)，繪制反應(yīng)進(jìn)程曲線(xiàn)，并從該曲線(xiàn)上求出酸性磷酸酶反應(yīng)初速率的時(shí)間范圍。3、制作酚標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)（目的：可從酚標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上查出A680nm所相當(dāng)?shù)姆雍?并計(jì)算出反應(yīng)速度（用每

4、分鐘產(chǎn)物生成量來(lái)表示）0123456780.4mM phenol standard solution00.10.20.30.40.50.60.70.8H2O10.90.80.70.60.50.40.30.21M Na2CO3222222222Folin-phenol reagent0.50.50.50.50.50.50.50.50.5加 液 程 序 表35保溫10分鐘012345678酚含量/mol00.040.080.120.160.200.240.280.32吸光度結(jié)果：以酚含量（mol）為橫坐標(biāo)，A680nm為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。以0號(hào)管作空白，在可見(jiàn)光分光光度計(jì)680 nm波長(zhǎng)處讀取

5、各管的吸光度（A680nm）。4、S與V0關(guān)系實(shí)驗(yàn) 實(shí) 驗(yàn) 加 液 程 序 表管號(hào) 1 2 3 4 5 6 0磷酸苯二鈉 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.50 0.50 醋酸緩沖液 0.40 0.35 0.30 0.25 0.20 - - 酶液 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 - 精 確 反 應(yīng) 15 分 鐘 35度碳酸鈉溶液 2 2 2 2 2 2 2 Folin酚溶液 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 酶液 0.5 35保溫10分鐘測(cè)680nm處吸光度 注： 進(jìn)行酶促反應(yīng)時(shí)，注意預(yù)熱，使所有的反應(yīng)在同等條件下開(kāi)始 實(shí)驗(yàn)中需注意事項(xiàng)： 酶反應(yīng)作用時(shí)間精確控制 Tube number123456S (mM)0.50.7511.251.52.51/SA680phenol content（酚含量）V0 (mole phenol p