熒光定量PCR儀參數(shù)比照表

1、熒光定量PCR儀參數(shù)比照表口岫 品牌QIAGENRocheBio-RadABI比較參數(shù)Rotor-Gene Q 5- plex+HRM480CFX96 / IQ5ABI 7300 ( 32000)激發(fā)光源LED （發(fā)光二極管） 每個(gè)通道配備獨(dú)立的LED光源，HRM為獨(dú)立的通道氙燈LED / 1個(gè)鹵素?zé)酐u鎢燈：光強(qiáng)逐漸衰 減，壽命短，每2-3個(gè) 月需要更換一次。獨(dú)立光源和 濾光片獨(dú)立光源和濾光片， 每個(gè)通道均得到特 異，均一的激發(fā)；最 小的光譜重疊， 6個(gè)LED獨(dú)立激發(fā)， 無需預(yù)熱，使用方 便，即開即用，自動 開關(guān)光源，即使過 夜，也不用擔(dān)心光源 會燒壞棱鏡折射，光譜重疊及 相互的干擾，需要預(yù)

2、熱，實(shí)驗(yàn)結(jié)束必須關(guān) 機(jī)；氙燈使用壽命僅1000- 2000小時(shí)，一兩年必 需更換，氙燈更換成本 更高達(dá)幾千美金；且它 們的光強(qiáng)會不斷衰減， 影響結(jié)果穩(wěn)定性96個(gè)光纖檢測，移動 檢測，穩(wěn)定性差，需 要預(yù)熱，實(shí)驗(yàn)結(jié)束必 須關(guān)機(jī)；光路需要復(fù)雜調(diào)校， 儀器搬動后也需要專 業(yè)調(diào)校棱鏡折射，光譜重疊及 相互的干擾，需要預(yù) 熱，實(shí)驗(yàn)結(jié)束必須關(guān) 機(jī)；鹵鎢燈使用壽命僅 1000-2000 小時(shí)，一兩 年必需更換，氙燈更換 成本更高達(dá)幾千美金； 且它們的光強(qiáng)會不斷衰 減，影響結(jié)果穩(wěn)定性激發(fā)光范圍365-670nm450nm,483nm,523nm,588nm,615nm400-700nm / 450- 730nm

3、500-660nm熒光檢測器PMT （光電倍增 管）：靈敏度高CCDCCD /二級管低溫CCD：靈敏度 低，檢測線性范圍較窄升降溫速率升溫15C/秒；降溫 20。/秒。升溫 4.8C/sec 降溫 2.5C/sec升溫5C/sec 降溫 3.3C/sec基座的平均升降溫速度 3.5C/秒，樣品實(shí)際平 均溫度變化速度為1C/ 秒溫度均一性0.01 C0.2 C0.5 C0.5 C溫度分辨率0.02 C 0.1 C 0.2 C 0.25 C線性范圍與 區(qū)分度10個(gè)數(shù)量級（1-101Q 能清晰區(qū)分單個(gè)拷貝10個(gè)數(shù)量級9個(gè)數(shù)量級9個(gè)數(shù)量級溫度范圍室溫-99 C4-99 C4-99 C4-99 C反應(yīng)體

4、系最低可以做5微升體 系，節(jié)省試劑5-100ul 體系10-50ul 體系只能做到10微升體系內(nèi)參溫度均一性好，沒有 光程差，不需要加ROX內(nèi)參96孔板有光程差，必 須加ROX內(nèi)參96孔板有光程差，必 須加ROX內(nèi)參溫度均一性不夠好，96 孔板有光程差，必須加 ROX內(nèi)參，增加了成 本HRM分析技術(shù)上專用的HRM分析工 具，可自動分類/型， 突變檢測等需要增加軟件的功能， 不同的軟件，HRM功能表現(xiàn)不 好，無文獻(xiàn)支持HRM功能表現(xiàn)不好，無 文獻(xiàn)支持耗材耗材開發(fā)專用耗材，頂部無法標(biāo) 記專用耗材，頂部無法 標(biāo)記專用耗材，頂部無法標(biāo) 記SNP類型堿基變化1C/T 和 G/A2C/A 和 G/T3C/

5、G4A/T很小02C典型的Tm變化較大0.5C稀有性 (人類) 64% 20% 9% 7%這個(gè)表格反映的是堿基的不同，帶來的Tm值的變化，可以看出A/T之間的突變， 需要溫度分辨率小于 0.2C才能區(qū)分開，而象AB等其它公司的分辨率是土 0.25C，所 有它是區(qū)別不開第四類的SNP變化的，HRM技術(shù)的發(fā)明者，曾發(fā)表過一篇文章，用市場上所有能做HRM機(jī)器的定量，做 了一次比較，結(jié)果顯示QIAGEN Rotor-Gene Q是能做的最好的一個(gè)公司； 文章全文可見以下鏈接：Herrmann et al 2007 Clinical Chemistry 53,http:/www.clinchem,org

6、/cgi/content/abstract/clinchem,2007088120v1 Expanded Instrument Comparison of Amplicon DNA Melting Analysis for Mutation Scanning and GenotypingFig 1 (detail) Normalized melting curves of a 110 bp B -globin amplicon (triplicate HRM data)以下是一些關(guān)于定量PCR HRM （High Resolution Melt中文：高分辨 率熔解曲線）一些介紹?。≦IAGEN

7、）有2個(gè)最顯著特點(diǎn)：1）是溫控精度非常高（溫度均一性：0.01C，溫度分辨率：0.02C ）及 升降溫速度非常快（升溫可達(dá)15 c/秒，降溫可達(dá)20C/#）2）是區(qū)別與其它的公司定量PCR的是它的HRM功能，這個(gè)是其 它廠家都無法能做到的（比如ABI 7500Fast及其它公司這種板式加熱系統(tǒng)， 因?yàn)樗臏囟确直媛蔬_(dá)不到）QIAGEN是一個(gè)集遺傳分析和定量完美結(jié)合 的一款機(jī)器；現(xiàn)階段，大家檢測SNP時(shí)都用一貫的檢測方法，包括測序，探針還有 DHPLC等等而甲基化大多用MSP.至于HRM技術(shù)并不為大家所熟知，有 兩個(gè)原因：1）適合做HRM技術(shù)的儀器在國內(nèi)的普及程度不高，具我了解能真正能夠做HRM

8、 的只有 QIAGEN Roter-Gene Q+HRM 系列和 Idaho LightScanncer.Roche；其中QIAGEN在其溫度控制及軟件分析上是做的 最好的.（其它的比如ABI 7500 Fast及伯樂也對外宣傳它的HRM功能，但由 于它的溫控精度，決定了它做HRM功能是做不好的，可見也是一個(gè)趕時(shí)髦的功 能，也只能通過軟件的模擬來處理）2）HRM的實(shí)驗(yàn)靈敏度太高，影響實(shí)驗(yàn)因素過多，很多人都做了，但是就是做 不出來.因此就放棄，就換用其他比較成熟的方法.殊不知,HRM技術(shù)的檢測 方法有其他技術(shù)難以比擬的優(yōu)勢，不僅能實(shí)現(xiàn)高通量和高精度的同 時(shí),PCR和熒光定量在同一管內(nèi)進(jìn)行，能夠有

9、效避免假陽性. （QIAGEN在上海 有個(gè)用的非常好的用戶，是交通大學(xué)華山醫(yī)院的 關(guān)明主任，用這個(gè)機(jī)器發(fā)表 了一篇非常好的文章，如果老師有興趣，可過去看看）作為新一代的遺傳掃描工具,HRM具有簡，效，快,廉等其他技術(shù)難以比擬 的優(yōu)勢：簡：無需序列特異性探針，不受堿基位點(diǎn)局限，同時(shí)檢出已知或未知突變、 SNP和甲基化位點(diǎn)：閉管操作，避免交叉污染。效：最低檢測0.1%-0，01%的突變或異常甲基化，檢測SNP靈敏度和特 異性均為100%。快：1次同時(shí)檢測幾十個(gè)樣本，在一個(gè)小時(shí)左右就完了成檢測。廉：簡化操作步驟、降低人工和試劑成本，費(fèi)用遠(yuǎn)少于測序、Taqman探 針等方法。價(jià)格就幾毛錢（2毛人民幣）；其它用定量PCR來做SNP研究的方法，都只能對已知SNP進(jìn)行分 析，而且基本都需要合成序列特異性探針，局限性和費(fèi)用都比較大，一來 只能做已知的SNP，二來需要合成序列特異性探針。而HRM則不受這 些條件的限制，既可做已知位點(diǎn)又可做未知位點(diǎn)，且無需序列特異性探 針，費(fèi)用大大降低，應(yīng)用的靈活性也大大提高。H