DNA測(cè)序概述課件

1、DNA測(cè)序技術(shù)概述DNA測(cè)序技術(shù)簡(jiǎn)介DNA測(cè)序技術(shù)的發(fā)展DNA測(cè)序技術(shù)的小結(jié)與展望DNA測(cè)序簡(jiǎn)介 DNA是一種長(zhǎng)鏈聚合物，組成單位為四種脫氧核苷酸。這些堿基沿著DNA長(zhǎng)鏈所排列而成的序列，可組成遺傳密碼，指導(dǎo)蛋白質(zhì)的合成。對(duì)于每個(gè)生物體來(lái)說(shuō)，基因組包含了整個(gè)生物體的遺傳信息。測(cè)序技術(shù)能夠真實(shí)地反映基因組DNA上的遺傳信息，進(jìn)而比較全面地揭示基因組的復(fù)雜性和多樣性，因而在生命科學(xué)研究中扮演了十分重要的角色。 測(cè)序技術(shù)最早可以追溯到20世紀(jì)50年代，早在1954年就已經(jīng)出現(xiàn)了關(guān)于早期測(cè)序技術(shù)的報(bào)道，直至1977年Sanger等發(fā)明的雙脫氧核苷酸末端終止法和Gilbert等發(fā)明的化學(xué)降解法，標(biāo)志著第

2、一代測(cè)序技術(shù)的誕生。此后三十幾年的發(fā)展中陸續(xù)產(chǎn)生了第二代測(cè)序技術(shù)，這些技術(shù)都采用了合成測(cè)序法，只是在DNA陣列的排布、DNA簇?cái)U(kuò)增，以及基于酶的測(cè)序生化反應(yīng)方面存在差異。第一代DNA測(cè)序技術(shù) 三測(cè)序方法的原理第二代DNA測(cè)序技術(shù) 三個(gè)測(cè)序平臺(tái)的工作原理及操作步驟第三代DNA測(cè)序技術(shù) 單分子測(cè)序的特點(diǎn)及應(yīng)用前景DNA測(cè)序技術(shù)的歷史自沃森和克里克在1953年建立DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)以來(lái)，整個(gè)測(cè)序技術(shù)的發(fā)展歷程。第一代DNA測(cè)序技術(shù) 成熟的DNA測(cè)序技術(shù)始于20世紀(jì)70年代中期。 1977年Sanger發(fā)明了雙脫氧鏈終止法。 同一時(shí)期, Maxam 和Gilbert報(bào)道了通過(guò)化學(xué)降解測(cè)定DNA序列的方法

3、。 20世紀(jì)90年代初出現(xiàn)的熒光自動(dòng)測(cè)序技術(shù)將DNA測(cè)序帶入自動(dòng)化測(cè)序的時(shí)代。這些技術(shù)統(tǒng)稱為第一代DNA測(cè)序技術(shù)。1.鏈終止法 利用DNA聚合酶和雙脫氧鏈終止物測(cè)定DNA核苷酸順序的方法，是由英國(guó)劍橋分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的F. Sanger等人于1977年發(fā)明的。F. Sanger（1980年諾貝爾獎(jiǎng)獲得者）（The chain termination method）技術(shù)路線與要求制備單鏈模板 將單鏈模板與一小段引物退火 加入DNA多聚酶 4種脫氧核苷酸分別加入少量4種雙脫氧核苷酸 將4種反應(yīng)產(chǎn)物分別在4條泳道電泳 根據(jù)4個(gè)堿基在4條泳道的終止位置讀出基因序列 A 克隆于質(zhì)粒中DNA用堿或熱變性B

4、 M13克隆單鏈DNAC 噬?？寺NAD PCR產(chǎn)生單鏈DNAA 高酶活B 無(wú)53外切酶活性C 無(wú)35外切酶活性ddATP/ddCTP/ddGTP/ddTTP 的3碳原子連接的是氫原子,不是羥基5PP 53HOOH 35POH 3P32 55POH 3HODNA聚合酶，dATP，dTTP，dGTP，dCTPddGTPddATPddTTPddCTP制備單鏈DNA加放射性引物ddGTPddATPddTTPddCTP5 32P -GTCATGTGCTAG5 32P GTCATGTGCTA5 32P GTCATGTGCT5 32P GTCATGTGC5 32P GTCATGTG5 32P GTCAT

5、GT5 32P GTCATG5 32P GTCAT5 32P GTCA5 32P GTC5 32P GT5 32P G聚合產(chǎn)物分別在4個(gè)泳道電泳從下到上依次讀出DNA片段的核苷酸序列 2.引物 酶促測(cè)序反應(yīng)中利用一個(gè)與模板鏈特定序列互補(bǔ)的合成寡核苷酸作為DNA合成的引物。 M13噬菌體重組克隆的通用測(cè)序引物一般長(zhǎng)15個(gè)29個(gè)核苷酸，并可與緊靠M13mpl8噬菌體多克隆位點(diǎn)區(qū)的Hind 位點(diǎn)或M13mpl9噬菌體多克隆位點(diǎn)區(qū)的EcoR位點(diǎn)的序列互補(bǔ)。這些引物同樣也可用于對(duì)克隆于pUC質(zhì)粒的DNA進(jìn)行雙鏈測(cè)序。此外，還有若干家公司出售一些引物，這些引物是為了對(duì)通過(guò)多種限制酶切位點(diǎn)克隆于不同質(zhì)粒的靶

6、DNA進(jìn)行測(cè)序而設(shè)計(jì)的。 （1）大腸桿菌 DNA聚合酶Klenow 這種酶是最初用以建立Sanger法的酶，也是至今仍然廣泛用于DNA序列測(cè)定的酶，通常碰到的兩個(gè)問(wèn)題是：1)Klenow片段的持續(xù)合成能力低； 2)這種酶對(duì)模板中的同聚核苷酸或其他含牢固二級(jí)結(jié)構(gòu)的區(qū)域進(jìn)行復(fù)制的效能很低； 將聚合反應(yīng)的溫度提高到55，可以緩解但并不能徹底解決這一問(wèn)題。 （2）反轉(zhuǎn)錄酶 盡管日常測(cè)序工作并不廣泛使用反轉(zhuǎn)錄酶，但有時(shí)用這個(gè)酶來(lái)解決一些由于模板DNA中存在AT或GC同聚核苷酸區(qū)而引起的問(wèn)題。（3）測(cè)序酶(SequenaseTM) 是一種經(jīng)過(guò)化學(xué)修飾的T7噬菌體DNA聚合酶。該酶原來(lái)具有很強(qiáng)的3一5外切核

7、酸酶活性，經(jīng)過(guò)修飾后，這一活性大部分均被消除。測(cè)序酶2.0版完全缺失了3一5外切酶活性，極其穩(wěn)定而且活性要比經(jīng)化學(xué)修飾的測(cè)序酶高2倍。測(cè)序酶持續(xù)合成能力很強(qiáng)，聚合速率很高，具有廣泛的耐受性，它是測(cè)定長(zhǎng)段DNA序列的首選酶。 4） Taq DNA聚合酶 適用于測(cè)定在37形成大段穩(wěn)定二級(jí)結(jié)構(gòu)的單鏈DNA模板序列。這是因?yàn)門aqDNA聚合酶在70一75活性最高，這一溫度下即使GC豐富的模板也無(wú)法形成二級(jí)結(jié)構(gòu)。有人報(bào)道，使用TaqDNA聚合酶進(jìn)行測(cè)序，在放射自顯影片上得到的連續(xù)數(shù)百個(gè)堿基條帶始終清晰如一，表明這種酶的持續(xù)合成能力甚佳。 4放射性標(biāo)記的dNTP a-32p dNTP被廣泛地應(yīng)用于DNA測(cè)

8、序。然而32P發(fā)射的強(qiáng)粒子造成兩個(gè)問(wèn)題。首先由于發(fā)生散射，放射自顯影片上的條帶遠(yuǎn)比凝膠上的DNA條帶更寬、更為擴(kuò)散，因此將影響到所讀取的序列正確性。其次32P的衰變會(huì)引起樣品中DNA的輻射分解，因此用32P進(jìn)行標(biāo)記的測(cè)序反應(yīng)只能保存一兩天，否則DNA將被嚴(yán)重破壞以至測(cè)序凝膠上模糊不清、真假難辨。 通過(guò)M13載體獲得單鏈DNA以測(cè)序M13噬菌體載體是專為得到單鏈DNA測(cè)序模板而設(shè)計(jì)的。 美國(guó)哈佛大學(xué)的Maxam和Gilbert于1977年發(fā)明的，化學(xué)降解法主要用于測(cè)定短片段DNA的序列。 用化學(xué)試劑處理末端放射性標(biāo)記的DNA片段，造成堿基的特異性切割。由此產(chǎn)生的一組具有各種不同長(zhǎng)度的DNA鏈的反

9、應(yīng)混合物，經(jīng)凝膠電泳和放射自顯影后，直接讀出待測(cè)DNA片段的核苷酸順序。2.化學(xué)降解法同時(shí)完成4組反應(yīng)，A、G、C、T鏈終止法：主流技術(shù)，易于機(jī)械化自動(dòng)控制?；瘜W(xué)降解法：試劑含有毒性?；瘜W(xué)降解法的特點(diǎn)重現(xiàn)性好，所用試劑簡(jiǎn)單，易于掌握；所測(cè)長(zhǎng)度比Sanger法短一些，對(duì)放射性標(biāo)記末端250個(gè)核苷酸以內(nèi)的DNA序列效果較好；序列來(lái)自原DNA分子而不是酶促合成反應(yīng)所生成的拷貝；因此，不會(huì)出現(xiàn)誤讀、可對(duì)未克隆的片段、合成的寡核苷酸直接進(jìn)行測(cè)序；5 和3 端均可標(biāo)記，可從兩方向測(cè)同一DNA，保證準(zhǔn)確性；操作繁瑣、費(fèi)時(shí)、分辨率較低、試劑毒性大。 3、熒光自動(dòng)測(cè)序技術(shù) 熒光自動(dòng)測(cè)序技術(shù)基于Sanger原理，

10、用四種不同的熒光混合物分別標(biāo)記四種反應(yīng)的產(chǎn)物，用四種反應(yīng)物混合在一起進(jìn)行電泳，在激光的激發(fā)下四種帶有不同熒光染料標(biāo)記物的ddNTP可以在同一反應(yīng)管種進(jìn)終止測(cè)序反應(yīng)，并于變性的聚丙烯酰胺凝膠的同一泳道中進(jìn)行電泳檢測(cè)。當(dāng)帶有某種熒光素標(biāo)記的DNA片段電泳到激光探頭的檢測(cè)范圍時(shí)，激光所激發(fā)的熒光信號(hào)被探測(cè)器接受，經(jīng)計(jì)算機(jī)分析數(shù)據(jù)，自動(dòng)排列出DNA序列。第一代半自動(dòng)測(cè)序示意圖第一代全自動(dòng)測(cè)序 毛細(xì)管電泳測(cè)序 用毛細(xì)管電泳取代聚丙烯凝膠平板電泳，可使DNA的測(cè)序速度更為迅速。這種電泳裝置有96個(gè)泳道，每次可同時(shí)進(jìn)行96次測(cè)序，每輪實(shí)驗(yàn)不到2小時(shí)，1天可完成近千次反應(yīng)。毛細(xì)管電泳測(cè)序裝置第一代測(cè)序法的比較

11、 方法雙脫氧末端終止法 化學(xué)降解法熒光自動(dòng)測(cè)序技術(shù) 優(yōu)點(diǎn)操作簡(jiǎn)便，結(jié)果清晰可靠，一次能確定300-500個(gè)核苷酸序列，已成為最常用的DNA測(cè)序方法不需要進(jìn)行酶促反應(yīng)，可以分析甲基化等DNA的修飾情況自動(dòng)化程度高，高效率，精確度增加 缺點(diǎn)花費(fèi)時(shí)間過(guò)久，成本較高一次最多只能分析250個(gè)核苷酸 ，所用的許多化學(xué)試劑有毒純化量小，不能純化較長(zhǎng)的片段第二代DNA測(cè)序技術(shù) 二代測(cè)序的核心思想是邊合成邊測(cè)序，即通過(guò)捕捉新合成的末端的標(biāo)記來(lái)確定DNA的序列。 第二代測(cè)序技術(shù)主要包括羅氏454公司的GS FLX測(cè)序平臺(tái)、Illumina 公司的Solexa Genome Analyzer測(cè)序平臺(tái)和ABI公司的S

12、OLiD測(cè)序平臺(tái)。 第二代測(cè)序技術(shù)最顯著的特征是高通量,一次能對(duì)幾十萬(wàn)到幾百萬(wàn)條DNA分子進(jìn)行序列測(cè)序,使得對(duì)一個(gè)物種的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序或基因組深度測(cè)序變得方便易行。1、 Roche 454GS FLX 454公司可謂新一代測(cè)序技術(shù)的奠基人。2005年底，454公司推出了革命性的基于焦磷酸測(cè)序法的超高通量基因組測(cè)序系統(tǒng)Genome Sequencer 20 System，被Nature雜志以里程碑事件報(bào)道，開創(chuàng)了邊合成邊測(cè)序（sequencing-by-synthesis）的先河。后來(lái)，他們又推出了全新的GS FLX 系列試劑和軟件的補(bǔ)充，讓GS FLX的通量一下子提高了5倍，準(zhǔn)確性、讀長(zhǎng)也進(jìn)一步提

13、升。Roche 454測(cè)序原理原理：在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、熒光素酶和雙磷酸酶的作用下，將每一個(gè)dNTP的聚合與一次化學(xué)發(fā)光信號(hào)的釋放偶聯(lián)起來(lái)，通過(guò)檢測(cè)化學(xué)發(fā)光信號(hào)的有無(wú)和強(qiáng)度，達(dá)到實(shí)時(shí)檢測(cè)DNA序列的目的。 樣品處理主要是針對(duì)大片段的DNA分子，如基因組DNA、Fosmid或BAC質(zhì)粒等，利用超聲或氮?dú)獯驍鄬⑦@些DNA分子片段化，然后采用瓊脂糖凝膠電泳回收或磁珠純化，選擇500-800bp的DNA片段。對(duì)于非編碼RNA或PCR產(chǎn)物，則不需要這一步驟。一、樣品處理 454 （GS FLX）測(cè)序技術(shù)流程二、文庫(kù)制備 文庫(kù)制備包括接頭連接和磁珠純化兩步，基因組DNA/cDNA片段經(jīng)末端修復(fù)

14、與特異性接頭連接等修飾后變性處理回收單鏈的DNA 。 454的文庫(kù)接頭分A、B兩種，各44bp，由20bp的PCR引物、20bp的測(cè)序引物及4bp（TCAG）的“key”堿基構(gòu)成，其中B接頭的5端帶有生物素（Biotin）標(biāo)記，用于磁珠純化步驟。三、連接微珠一個(gè)DNA片段一個(gè)磁珠：?jiǎn)捂淒NA文庫(kù)被固定在特別設(shè)計(jì)的DNA捕獲磁珠上。每一個(gè)磁珠攜帶了一個(gè)獨(dú)特的單鏈DNA片段。磁珠結(jié)合的文庫(kù)被擴(kuò)增試劑乳化，形成油包水的混合物，這樣就形成了只包含一個(gè)磁珠和一個(gè)獨(dú)特片段的微反應(yīng)器。四、emRCR 每個(gè)獨(dú)特的片段在自己的微反應(yīng)器里進(jìn)行獨(dú)立的擴(kuò)增，而沒(méi)有其他的競(jìng)爭(zhēng)性或者污染性序列的影響。整個(gè)片段文庫(kù)的擴(kuò)增平

15、行進(jìn)行。對(duì)于每一個(gè)片段而言，擴(kuò)增后產(chǎn)生了幾百萬(wàn)個(gè)相同的拷貝。隨后，乳液混合物被打破，擴(kuò)增的片段仍然結(jié)合在磁珠上。乳液PCR（emRCR）五、反應(yīng)板準(zhǔn)備、上機(jī)測(cè)序 454測(cè)序的反應(yīng)板稱為PTP（Pico Titer Plate），含有350萬(wàn)個(gè)由光纖組成的小孔，每個(gè)孔的直徑為29m，而測(cè)序磁珠的直徑為20m，因此每個(gè)孔中僅能容納一個(gè)磁珠。 攜帶DNA的捕獲磁珠隨后放入PTP板中進(jìn)行后繼的測(cè)序。放置在單獨(dú)的試劑瓶里的堿基，依照T、A、C、G的順序依次循環(huán)進(jìn)入PTP板，每次只進(jìn)入一個(gè)堿基。如果發(fā)生堿基配對(duì)，就會(huì)釋放一個(gè)焦磷酸。這個(gè)焦磷酸在ATP硫酸化酶和螢光素酶的作用下，經(jīng)過(guò)一個(gè)合成反應(yīng)和一個(gè)化學(xué)發(fā)

16、光反應(yīng)，最終將螢光素氧化成氧化螢光素，同時(shí)釋放出光信號(hào)。此反應(yīng)釋放出的光信號(hào)實(shí)時(shí)被高靈敏度CCD捕獲到。一個(gè)磁珠一條讀長(zhǎng)Roche 454測(cè)序步驟六、測(cè)序和分析 將磁珠與測(cè)序試劑加入PTP中，使之可用于上機(jī)測(cè)序。GS FLX測(cè)序技術(shù)的優(yōu)點(diǎn) GS FLX系統(tǒng)的測(cè)序也是一種依靠生物發(fā)光進(jìn)行DNA序列分析的新技術(shù)。在DNA聚合酶，ATP硫酸化酶，熒光素酶和雙磷酸酶的協(xié)同作用下，將優(yōu)點(diǎn)引物上每一個(gè)dNTP 的聚合與一次熒光信號(hào)釋放偶聯(lián)起來(lái)。通過(guò)檢測(cè)熒光信號(hào)釋放的有無(wú)和強(qiáng)度，就可以達(dá)到實(shí)時(shí)測(cè)定DNA序列的目的。此技術(shù)不需要熒光標(biāo)記的引物或核酸探針，也不需要進(jìn)行電泳； 特點(diǎn)：分析結(jié)果快速、準(zhǔn)確、靈敏度高和

17、自動(dòng)化。 2.Illumina -Solexa Genome Analyzer Solexa 系統(tǒng)應(yīng)用了邊合成邊測(cè)序（Sequencing By Synthesis）的原理。加入改造過(guò)的DNA聚合酶和帶有4種熒光標(biāo)記的dNTP。 這些核苷酸是“可逆終止子”，因?yàn)?羥基末端帶有可化學(xué)切割的部分，它只容許每個(gè)循環(huán)摻入單個(gè)堿基。此時(shí)，用激光掃描反應(yīng)板表面，讀取每條模板序列第一輪反應(yīng)所聚合上去的核苷酸種類。之后，將這些基團(tuán)化學(xué)切割，恢復(fù)3端粘性，繼續(xù)聚合第二個(gè)核苷酸。這樣，統(tǒng)計(jì)每輪收集到的熒光信號(hào)結(jié)果，就可以得知每個(gè)模板DNA片段的序列。Solexa測(cè)序技術(shù)路線：Solexa測(cè)序技術(shù)的特點(diǎn)通量高 目前

18、一臺(tái)機(jī)器在兩周內(nèi)最高可產(chǎn)出360G 的數(shù)據(jù);準(zhǔn)確率高 高于98. 5% ，同時(shí)也有效地解決了多 聚重復(fù)序列的讀取問(wèn)題;成本低 低于傳統(tǒng)Sanger 測(cè)序技術(shù)的成本;DNA 序列的讀取長(zhǎng)度不斷增加可以進(jìn)行Pair-end( PE) 雙向測(cè)序 PE 文庫(kù)插入片段大小范圍可由150 bp 到10 kb。正確選擇插入片段長(zhǎng)度有利于高重復(fù)序列含量基因組的組裝，這進(jìn)一步擴(kuò)展了該技術(shù)的應(yīng)用范圍。 但是讀長(zhǎng)錯(cuò)誤率會(huì)增高。讀長(zhǎng)會(huì)受到多個(gè)引起信號(hào)衰減的因素所影響，如熒光標(biāo)記的不完全切割。3. ABI SOLiD測(cè)序技術(shù) SOLiD的獨(dú)特之處在于以四色熒光標(biāo)記寡核苷酸的連續(xù)連接合成為基礎(chǔ)，取代了傳統(tǒng)的聚合酶連接反應(yīng)

19、，可對(duì)單拷貝DNA片段進(jìn)行大規(guī)模擴(kuò)增和高通量并行測(cè)序。就通量而言，SOLiD 3系統(tǒng)是革命性的，目前SOLiD 3單次運(yùn)行可產(chǎn)生50GB的序列數(shù)據(jù)，相當(dāng)于17倍人類基因組覆蓋度。而其無(wú)以倫比的準(zhǔn)確性、系統(tǒng)可靠性和可擴(kuò)展性更讓它從其他新一代測(cè)序平臺(tái)中脫穎而出。 SOLiD工作流程 a. 文庫(kù)制備 b. 乳液PCR/微珠富集 c. 微珠沉積 d. 連接測(cè)序 e. 數(shù)據(jù)分析SOLiD優(yōu)點(diǎn) 1.系統(tǒng)可擴(kuò)展性2.高通量 3.靈活性 SOLiD系統(tǒng)已不再是一臺(tái)單純的測(cè)序儀，而是成為功能更全面的基因分析儀。除了測(cè)序和重測(cè)序，還能進(jìn)行全基因表達(dá)圖譜分析、SNP、microRNA、甲基化等多種分析。例子： SN

20、P分析 盡管絕大多數(shù)的人類遺傳信息在所有人中都相同，但是研究人員通常更感興趣的是研究個(gè)體之間微小的遺傳差異。包括DNA片段的插入、缺失、倒位和易位等，可能對(duì)基因產(chǎn)生重要影響，并導(dǎo)致人類疾病的發(fā)生。 甲基化分析 甲基化是自然發(fā)生的DNA化學(xué)修飾的一種。已知抑癌基因的失活與DNA序列特定區(qū)域的甲基化有關(guān)。而去甲基化則可能導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定和表達(dá)模式變化。DNA甲基化區(qū)域可能作為基因在癌癥過(guò)程中的標(biāo)記。研究人員一直致力研究從正常到癌變過(guò)程中甲基化模式如何變化的，原癌基因異常甲基化模式在癌變過(guò)程中扮演怎樣的角色。羅氏/454基因組測(cè)序儀FLX系統(tǒng)焦磷酸測(cè)序法光學(xué)230-400在第二代中最高讀長(zhǎng)；比第一代

21、的測(cè)序通量大樣品制備較難；難于處理重復(fù)和同種堿基多聚區(qū)域；試劑沖洗帶來(lái)錯(cuò)誤累積；儀器昂貴illuminaHiSeq2000/miSeq可逆鏈終止物和合成測(cè)序法熒光/光學(xué)2x150很高測(cè)序通量?jī)x器昂貴；用于數(shù)據(jù)刪節(jié)和分析的費(fèi)用很高ABI/SOLiD5500 xlSOLiD系統(tǒng)連接測(cè)序法熒光/光學(xué)25-35很高測(cè)序通量；在廣為接受的幾種第二代平臺(tái)中，所要拼接出人類基因組的試劑成本最低測(cè)序運(yùn)行時(shí)間長(zhǎng)；讀長(zhǎng)短，造成成本高，數(shù)據(jù)分析困難和基因組拼接困難；儀器昂貴公司平臺(tái)名稱測(cè)序方法檢測(cè)方法大約讀長(zhǎng)(堿基數(shù))優(yōu)點(diǎn)相對(duì)局限性三大測(cè)序平臺(tái)的技術(shù)特點(diǎn)和差異第三代DNA測(cè)序技術(shù) 第二代測(cè)序技術(shù)在制備測(cè)序文庫(kù)的時(shí)候

22、都需要經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增，而這一PCR過(guò)程可能引入突變或者改變樣品中核酸分子的比例關(guān)系。另外，第二代測(cè)序的讀長(zhǎng)普遍偏短，在進(jìn)行數(shù)據(jù)拼接時(shí)會(huì)遇到麻煩。為了克服這樣的缺點(diǎn)，業(yè)界發(fā)展出了以單分子實(shí)時(shí)測(cè)序和納米孔為標(biāo)志的第三代測(cè)序技術(shù)。 2008年4月HelicoBioScience公司的Timothy等人在Science上報(bào)道了他們開發(fā)的真正的單分子測(cè)序技術(shù)，也被成為第三代測(cè)序技術(shù)。這項(xiàng)技術(shù)完全跨過(guò)了第二代測(cè)序技術(shù)依賴基于PCR擴(kuò)增的信號(hào)放大過(guò)程，真正達(dá)到了讀取單個(gè)熒光分子的能力。 1. Helicos公司 Heliscope單分子測(cè)序儀基于邊合成邊測(cè)序的思想，將待測(cè)序列隨機(jī)打斷成小片段并在3末端加上P

23、oly(A)，用末端轉(zhuǎn)移酶在接頭末端加上Cy3熒光標(biāo)記。用小片段與表面帶有寡聚Poly(T)的平板雜交。然后，加入DNA聚合酶和Cy5熒光標(biāo)記的dNTP進(jìn)行DNA合成反應(yīng)，每一輪反應(yīng)加一種dNTP。 將未參與合成的dNTP和DNA聚合酶洗脫。 檢測(cè)上一步記錄的雜交位置上是否有熒光信號(hào)，如果有則說(shuō)明該位置上結(jié)合了所加入的這種dNTP。用化學(xué)試劑去掉熒光標(biāo)記，以便進(jìn)行下一輪反應(yīng)。經(jīng)過(guò)不斷地重復(fù)合成、洗脫、成像、淬滅過(guò)程完成測(cè)序。 Pacific Biosciences公司的SMRT技術(shù)基于邊合成邊測(cè)序的思想，以SMRT芯片為測(cè)序載體進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)。 SMRT芯片是一種帶有很多ZMW孔的厚度為100

24、nm的金屬片。將DNA聚合酶、待測(cè)序列和不同熒光標(biāo)記的dNTP放入ZMW孔的底部，進(jìn)行合成反應(yīng)。與其他技術(shù)不同的是，熒光標(biāo)記的位置是磷酸基團(tuán)而不是堿基。2. Pacific Biosciences公司 當(dāng)一個(gè)dNTP被添加到合成鏈上的同時(shí)，它會(huì)進(jìn)入ZMW孔的熒光信號(hào)檢測(cè)區(qū)并在激光束的激發(fā)下發(fā)出熒光，根據(jù)熒光的種類就可以判定dNTP的種類。此外由于dNTP在熒光信號(hào)檢測(cè)區(qū)停留的時(shí)間（毫秒級(jí)）與它進(jìn)入和離開的時(shí)間（ 微秒級(jí)） 相比會(huì)很長(zhǎng)，所以信號(hào)強(qiáng)度會(huì)很大。其它未參與合成的dNTP由于沒(méi)進(jìn)入熒光型號(hào)檢測(cè)區(qū)而不會(huì)發(fā)出熒光。在下一個(gè)dNTP被添加到合成鏈之前，這個(gè)dNTP的磷酸基團(tuán)會(huì)被氟聚合物（fluoropolymer）切割并釋放，熒光分子離開熒光信號(hào)檢測(cè)區(qū)。 3. Oxford Nanopore Technologies公司 Oxford Na