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文檔簡介

1、從RNA提取到熒光定量PCR內(nèi)容摘要一、熒光定量PCR的原理二、熒光定量PCR的應(yīng)用三、熒光定量PCR的操作四、熒光定量PCR結(jié)果分析一、熒光定量PCR的原理 定時(shí)定量PCR技術(shù)-定義 利用熒光信號(hào)的變化實(shí)時(shí)檢測PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，通過Ct或標(biāo)準(zhǔn)曲線的關(guān)系對起始模板進(jìn)行定量分析 名詞概念： 擴(kuò)增曲線 熒光閾值 Ct值擴(kuò)增曲線曲線拐點(diǎn)清楚，特別是低濃度樣本指數(shù)期明顯，曲線指數(shù)期斜率與擴(kuò)增效率成正比，斜率越大擴(kuò)增效率越高。標(biāo)準(zhǔn)的基線平直或略微下降，無明顯的上揚(yáng)趨勢。擴(kuò)增曲線平行性好，表明各反應(yīng)管的擴(kuò)增效率相近。Ct值PCR擴(kuò)增過程中，擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)過

2、的擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)二、熒光定量PCR的應(yīng)用注意事項(xiàng)-提取總RNA培養(yǎng)條件：菌種需同步活化后轉(zhuǎn)接，平板培養(yǎng)取樣研磨：使用無菌槍頭刮取孢子到1.5mL無RNA EP管中,然后轉(zhuǎn)移到研缽中研磨至粉末狀，保存于1mL的Trizol溶液中提取過程：按照說明書規(guī)范操作注意事項(xiàng)-DNA消化RNA檢測 OD280:蛋白或有機(jī)試劑； OD260:核酸； OD260/OD280=1.8-2.0時(shí)，RNA可用； 當(dāng)R2.2時(shí)，RNA降解成單核酸消化前RNA需定量 賽百盛總RNA提取試劑盒：提取量1-2ug/mL檢測消化是否完全 普通PCR程序：25ul體系，模板RNA加4ul注意事項(xiàng)-上機(jī)混樣模板儀器操作A226-3A226-1A226-2Ct的必要條件 兩個(gè)基因（目的基因和內(nèi)參基因）必須有相一致的擴(kuò)增效率，并盡可能接近100%！如何判斷擴(kuò)增效率一致 同時(shí)擴(kuò)增目的基因和內(nèi)參基因，通過查看

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