單基因病診斷詳解培訓(xùn)課件

1、單基因病診斷詳解單基因病診斷詳解遺傳病的診斷 ( Diagnosis of Hereditary Disease) 可以分為產(chǎn)前診斷、癥狀前診斷和現(xiàn)癥病人診斷三種類型。遺傳病的診斷是開(kāi)展遺傳咨詢和防治工作的基礎(chǔ)。單基因病診斷詳解2遺傳病的診斷 ( Diagnosis of Heredita遺傳病的診斷方法普遍性診斷原則 是指與一般疾病相同的診斷方法，即通過(guò)對(duì)病史、癥狀、體癥、實(shí)驗(yàn)室檢查和其他診斷技術(shù)所獲得的資料進(jìn)行歸納分析，同時(shí)排除擬診疾病，然后確立診斷。遺傳學(xué)的特殊診斷 主要是指染色體檢查、性染色質(zhì)檢查、特異性酶和蛋白質(zhì)以及代謝中間產(chǎn)物的生化分析、DNARNA以及家系分析、皮膚紋理分析、攜帶

2、者的檢出等等。單基因病診斷詳解3遺傳病的診斷方法普遍性診斷原則 是指與一般疾病相同的診斷一 病史、家族史和體癥1. 病史由于遺傳病多有家族聚集現(xiàn)象，所以病史的采集的準(zhǔn)確性非常重要。除關(guān)注一般病史外，主要著重于患者的家族史、婚姻史和生育史。單基因病診斷詳解4一 病史、家族史和體癥1. 病史由于遺傳病多有家族( 1 ) 家族史 2. 家族史采集家族史時(shí)應(yīng)該特別注意因患者或代述人由于文化程度、記憶能力、思維能力、判斷能力以及精神狀態(tài)而使癥狀、體癥的描述不夠準(zhǔn)確、全面，或者因?yàn)榛颊?、代述人提供假材料等都?huì)影響家族史的準(zhǔn)確性。著重了解結(jié)婚年齡、次數(shù)、配偶健康狀況以及是否近親結(jié)婚等。單基因病診斷詳解5(

3、1 ) 家族史 2. 3 . 生育史著重了解生育年齡、子女?dāng)?shù)目、健康狀況、有無(wú)流產(chǎn)、死產(chǎn)、早產(chǎn)史等。如有新生兒死亡或患兒，則除詢問(wèn)父母及家庭成員上述情況外，還應(yīng)該了解患兒有無(wú)產(chǎn)傷、窒息，妊娠早期母體有無(wú)患病毒性疾病和接觸過(guò)致畸因素，如服用過(guò)致畸藥物或接觸過(guò)電離輻射或有害化學(xué)物質(zhì)等。單基因病診斷詳解6 3 . 生育史著重了解生育年齡、子女?dāng)?shù)目、健康狀況、有無(wú)4. 癥狀和體癥遺傳病除和其他疾病有相同的體癥之外，往往有其本身的特異性癥候群，為診斷提供初步的線索。苯丙酮尿癥：智力發(fā)育不全，特殊腐臭尿液半乳糖血癥：智力發(fā)育不全伴有白內(nèi)障，肝硬化。單基因病診斷詳解74. 癥狀和體癥遺傳病除和其他疾病有相同

4、的體癥之外，往往有由于大多數(shù)遺傳病在嬰兒和兒童時(shí)期即可有體癥和癥狀出現(xiàn)，故除觀察外貌特征外，還應(yīng)該注意身體發(fā)育情況：諸如體重增長(zhǎng)速度，智力增進(jìn)、性器官以及第二性癥發(fā)育、肌肉的張力、嬰兒啼哭的聲音等情況。由于有遺傳異質(zhì)性，若欲作出病因診斷，單憑體癥、癥狀資料是非常困難的，一定要進(jìn)行必要的實(shí)驗(yàn)室檢查。診斷中應(yīng)該注意的問(wèn)題單基因病診斷詳解8由于大多數(shù)遺傳病在嬰兒和兒童時(shí)期即可有體癥和癥狀出現(xiàn)，故除觀二、系譜分析系譜 ( Pedigree ) ：將患者家族的所有成員及其發(fā)病情況按照一定格式排繪制成的圖解，就成為系譜。系譜分析 ( Pedigree Analysis ) ：對(duì)某種性狀或者疾病的多個(gè)系譜

5、進(jìn)行綜合研究，從而得出這種性狀或者疾病的遺傳方式，稱之為系譜分析。單基因病診斷詳解9二、系譜分析系譜 ( Pedigree ) ：將患者家族的所一例并指癥的系譜單基因病診斷詳解10一例并指癥的系譜單基因病診斷詳解10一例多指（趾）的系譜12 2341567123456單基因病診斷詳解11一例多指（趾）的系譜12 2341567123456單一例-地中海貧血的系譜12213456789812345679101112設(shè)：貧血基因 0 正常基因 A A 0A 0A 0A A重型貧血輕型貧血0 0A 0 單基因病診斷詳解12一例-地中海貧血的系譜1221345678981231211376451091

6、24128131634215356101112131415一例白化病的系譜單基因病診斷詳解1312113764510912412813163一例甲型血友病的系譜21 2 3 4 5 6 7 8 9 10 111 2 3 4 5 6 7 8 91單基因病診斷詳解14一例甲型血友病的系譜21 2 2一例抗維生素D性佝僂病的系譜1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 111 2 3 4 5 6 7 8 91設(shè)：致病基因XA 正常基因XaXA XaXaYXAYXAXaXAY單基因病診斷詳解152一例抗維生素D性佝僂病的系譜1 2 進(jìn)行系譜分析應(yīng)注意的問(wèn)題系譜的系統(tǒng)性、完整性、可靠性。去偽存真。分析顯

7、性遺傳病時(shí)應(yīng)注意延遲顯性、不規(guī)則顯性、外顯不全等。分析性連鎖遺傳病時(shí)應(yīng)注意與從性和限性遺傳相區(qū)別。要注意顯隱性的相對(duì)性。因?yàn)橥环N遺傳病采用不同觀察指標(biāo)會(huì)得出不同的結(jié)論。注意新的基因突變。單基因病診斷詳解16進(jìn)行系譜分析應(yīng)注意的問(wèn)題系譜的系統(tǒng)性、完整性、可靠性。去偽存HbA HbA HbA HbS HbS HbS 正常人 攜帶著 患者（致死） 無(wú) 有（50%） 有（全部） 無(wú) 有（生存力強(qiáng)） - 基因型 疾 病 （隱性）鐮形細(xì)胞 （顯性）抗 瘧 疾 （顯性）單基因病診斷詳解17HbA HbA HbA HbS Hb三、生物化學(xué)檢查基因突變引起的單基因病往往表現(xiàn)在酶和蛋白質(zhì)的質(zhì)與量的改變或者缺如。

8、因此酶和蛋白質(zhì)的定量分析是診斷單基因病和先天性代謝性的主要方法。單基因病診斷詳解18三、生物化學(xué)檢查基因突變引起的單基因病往往表現(xiàn)在酶和蛋白質(zhì)的1. 代謝產(chǎn)物的檢出酶的缺陷導(dǎo)致一系列生化代謝紊亂，從而導(dǎo)致代謝底物、中間產(chǎn)物、終產(chǎn)物、旁路代謝產(chǎn)物發(fā)生改變。因此，檢測(cè)某些代謝常物的質(zhì)和量的改變，可以間接反映出酶的變化而作出診斷。苯丙酮尿癥 ：血清中的苯丙氨酸；尿中苯乙酸。粘多糖病 ：尿中的硫酸皮膚素、硫酸乙酰肝素。DMD ：血清中的磷酸肌酸酶活性。單基因病診斷詳解191. 代謝產(chǎn)物的檢出酶的缺陷導(dǎo)致一系列生化代謝紊亂，從而導(dǎo)2. 酶和蛋白質(zhì)的分析基因突變導(dǎo)致的單基因病主要是特定的蛋白質(zhì)、酶的質(zhì)和量

9、改變的結(jié)果。因此對(duì)酶的活性和蛋白質(zhì)含量的測(cè)定是確定某些單基因病的主要方法。單基因病診斷詳解202. 酶和蛋白質(zhì)的分析基因突變導(dǎo)致的單基因病主要是特定的蛋檢測(cè)材料的主要來(lái)源有： 特定的組織和細(xì)胞，如肝細(xì)胞、皮膚成纖維細(xì)胞，腎，腸粘膜細(xì)胞等。注意的問(wèn)題：一種酶的缺乏不一定在所有組織中都能夠檢測(cè)出來(lái)。例如苯丙氨酸羥化酶必須用肝組織活檢，而血細(xì)胞中無(wú)法得到。單基因病診斷詳解21檢測(cè)材料的主要來(lái)源有： 特定的組織和細(xì)胞，如肝細(xì)胞、皮膚成纖上海：19811987年對(duì)284,396名新生兒進(jìn)行PKU篩查，查出PKU患兒15名，高苯丙氨酸血癥4名。生物化學(xué)檢查 苯丙酮尿癥, PKU酶活性檢查 PAH 肝細(xì)胞血

10、液濾片法 Guthrie test 血液FeCl3顯色反應(yīng) 苯丙酮酸 尿液?jiǎn)位虿≡\斷詳解22上海：19811987年對(duì)284,396名新生兒進(jìn)行PKU四、基因診斷基因分析，即基因診斷 ( Gene Diagnosis )： 是利用DNA 分析技術(shù)直接從基因水平 ( DNA or RNA ) 檢測(cè)遺傳病的基因缺陷。這種方法和傳統(tǒng)的診斷方法主要差別在于直接從基因型推斷表型，可以越過(guò)基因產(chǎn)物，直接檢測(cè)基因的結(jié)構(gòu)而作出診斷，改變了傳統(tǒng)的表型診斷方式，所以又稱為逆向診斷 ( Reverse Diagnosis )。單基因病診斷詳解23四、基因診斷基因分析，即基因診斷 ( Gene Diagno單基因病

11、診斷詳解24單基因病診斷詳解241978年，Kan YW 鐮狀細(xì)胞貧血癥狀前診斷 外周靜脈血產(chǎn) 前 診 斷 孕早期的絨毛細(xì)胞 孕中期的羊水胎兒脫落細(xì)胞 母親外周血中的胎兒有核紅細(xì)胞植入前診斷 受精卵卵裂細(xì)胞基因診斷單基因病診斷詳解251978年，Kan YW 鐮狀細(xì)胞貧血癥狀前診斷 基因診斷的優(yōu)點(diǎn)材料容易獲得，不受細(xì)胞類型的限制；不受基因表達(dá)的時(shí)空限制。不受年齡的限制；可以于發(fā)病前做出診斷；方便有效，迅速準(zhǔn)確，攜帶者也可以有效檢出。單基因病診斷詳解26基因診斷的優(yōu)點(diǎn)材料容易獲得，不受細(xì)胞類型的限制；單基因病診斷 基因診斷的難點(diǎn)：對(duì)大多數(shù)疾病尚未找到合適的基因診斷方法，另外由于遺傳異質(zhì)性、基因突

12、變的多樣性，一種基因診斷方法對(duì)同一疾病往往有很大差異。 基因診斷的對(duì)象：一般是指單基因病和某些有主基因改變的多基因病。 至1997年，發(fā)現(xiàn)人類單基因病遺傳病已達(dá)8587種，現(xiàn)已達(dá)到15988種單基因病診斷詳解27 基因診斷的難點(diǎn)：對(duì)大多數(shù)疾病尚未找到合適的基因診斷方進(jìn)行基因診斷必須具備的條件：(1)致病基因的染色體定位已明確(2)致病基因的結(jié)構(gòu)、順序與突變性質(zhì)巳清楚(3)致病基因與DNA多態(tài)存在連鎖關(guān)系根據(jù)所具備的條件選擇適合的基因診斷技術(shù)單基因病診斷詳解28進(jìn)行基因診斷必須具備的條件：(1)致病基因的染色體定位已明確基因診斷方法 目前常用的基因診斷方法: (1)聚合酶鏈反應(yīng)DNA擴(kuò)增法 (2

13、)限制性酶譜Southern印跡雜交直接分析法 (3)限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)連鎖分析法 (4)寡核苷酸探針(oligonucleotide probe)檢測(cè)法 (5)DNA測(cè)序 (6)基因芯片單基因病診斷詳解29基因診斷方法 目前常用的基因診斷方法:單基因病診斷詳解2（一） 聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction, PCR)聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）是在體外特異和迅速地?cái)U(kuò)增特定靶DNA序列的方法單基因病診斷詳解30（一） 聚合酶鏈反應(yīng)聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）是在體外特異和迅PCR的原理：1. 為可選擇性擴(kuò)增,要有特異引物2. 要有前身物、聚合酶和離子3. 是鏈?zhǔn)椒?/p>

14、應(yīng)，每一周期經(jīng)過(guò)變性、復(fù)性和延伸三步4. 一周期后DNA倍增單基因病診斷詳解31PCR的原理：?jiǎn)位虿≡\斷詳解31 PCR的過(guò)程： 變性（92-95；1分鐘） 復(fù)性（40-60；1分鐘） 延伸（72；1.5分鐘）單基因病診斷詳解32 PCR的過(guò)程：?jiǎn)位虿≡\斷詳解32 5 3 3 5 變性 5 3 3 5 特異引物 復(fù)性 5 3 5 3 3 5 3 5 DNA聚合酶 延伸 3 5 5 3 PCR單基因病診斷詳解33 5 以地貧基因診斷為例 由于中國(guó)人地貧80%以上為東南亞型缺失型 （- -SEA/）, 該突變的缺失范圍約20kb基因片段。因此， 采用跨越斷裂點(diǎn)PCR法（gap-PCR）,一次即

15、可診斷出各種基因型。PCR的應(yīng)用單基因病診斷詳解34以地貧基因診斷為例PCR的應(yīng)用單基因病診斷詳解34單基因病診斷詳解35單基因病診斷詳解351 21 2單基因病診斷詳解361 21 2單基因病診斷詳解36Multi-PCR單基因病診斷詳解37Multi-PCR單基因病診斷詳解37PCR-SSCP1989年，Orita等建立的PCR產(chǎn)物單鏈DNA凝膠電泳技術(shù)。1 2 3 4 5a b1：正常人； 2,4,5：純合體患者； 3：雜合體(2的弟弟)左為泳動(dòng)變位模式：a 正常人；b 純合體患者單基因病診斷詳解38PCR-SSCP1989年，Orita等建立的PCR產(chǎn)物單鏈PCR-SSCPGAAGAG

16、TGTTATCTCCAC單基因病診斷詳解39PCR-SSCPGAAGAGTGTTATCTCCAC單單基因病診斷詳解40單基因病診斷詳解40 PCR-DHPLCDHPLC（變性高效液相色譜）進(jìn)行基因突變檢測(cè)的原理 DHPLC進(jìn)行基因突變檢測(cè)是基于異源雙鏈的形成和不同的雙鏈與吸附拄的結(jié)合牢固程度不同。單基因病診斷詳解41 PCR-DHPLC單基因病診單基因病診斷詳解培訓(xùn)課件 異源雙鏈由于堿基對(duì)不匹配，在部分變性的溫度條件下，就會(huì)在不匹配的堿基對(duì)處部分解鏈，由于單鏈DNA帶負(fù)電荷減少，結(jié)合力弱，因此，異源雙鏈比同源雙鏈先洗脫出來(lái)，根據(jù)柱子保留時(shí)間的不同將同源雙鏈和異源雙鏈分離，出現(xiàn)不同的檢測(cè)峰。單基

17、因病診斷詳解43 異源雙鏈由于堿基對(duì)不匹配，在部分變性的溫度條 DHPLC的特點(diǎn)： 1）快速分離DNA分子，一般進(jìn)行基因突變檢測(cè)，一個(gè)樣品約需8.8分鐘 2）自動(dòng)化操作系統(tǒng) 3）準(zhǔn)確測(cè)定DNA片段大小 4）基因突變檢出率高，達(dá)95-100% 5）經(jīng)濟(jì)、操作簡(jiǎn)便、PCR產(chǎn)物無(wú)須進(jìn)行純化處理即可用于突變檢測(cè) 單基因病診斷詳解44 DHPLC的特點(diǎn)：?jiǎn)位虿≡\斷詳解44（二）分子雜交單基因病診斷詳解45（二）分子雜交單基因病診斷詳解45 Southern印跡雜交 (Southern blot hybridization)原理: DNA堿基的替換和數(shù)目的改變可導(dǎo)致限制性酶切片段長(zhǎng)度改變 1. 點(diǎn)突變至

18、酶切位點(diǎn)消失或出現(xiàn)新切點(diǎn) 2. 較大片段堿基缺失 3. 串聯(lián)重復(fù)數(shù)目較大的改變 4. 較大片段堿基重復(fù)單基因病診斷詳解46 Southern印跡雜交單基因限制酶的識(shí)別序列與切割： 絕大多數(shù)型限制酶的識(shí)別序列都是 回文結(jié)構(gòu), 即以雙對(duì)稱軸按5 3方向閱讀時(shí),其堿基順序在雙鏈上相同 BamH識(shí)別GGATCC 5-GGATCCATGGAACCGTAGCGGATCCTAGT- 3 3-CCTAGGTACCT TGGCATCGCCTAGGATCA- 5 Bgl識(shí)別AGATCT 5-AGATCTTACATTGGCATCGAGATCTTAGT-3 3-TCTAGAATGTAACCGTAGCTCTAGAATC

19、A-5單基因病診斷詳解47限制酶的識(shí)別序列與切割：?jiǎn)位虿≡\斷詳解47 探針的種類和標(biāo)記 雜交探針 DNA cDNA 寡核苷酸基因組DNA 或PCR產(chǎn)物 mRNA 逆轉(zhuǎn)錄 化學(xué)合成 雙鏈 0.1-20kb 雙鏈 0.1-10kb 單鏈 15-150bp缺口平移，隨機(jī)引物，PCR缺口平移，隨機(jī)引物，PCR類型來(lái)源特征標(biāo)記 末端標(biāo)記單基因病診斷詳解48 探針的種類和 探針標(biāo)記(probe labeling) 同位素標(biāo)記: 32P, 35S, 3H 非同位素標(biāo)記: 生物素，地高辛標(biāo)記方法: 缺口平移 雙鏈探針標(biāo)記 隨機(jī)引物 PCR 寡核苷酸標(biāo)記: 5末端標(biāo)上標(biāo)記物單基因病診斷詳解49 探針標(biāo)記(pr

20、obe labeling)單基1限制性酶譜直接分析法： 應(yīng)用專一性基因探針和限制性內(nèi)切酶，經(jīng) Southern印跡雜交直接檢測(cè)致病基因存在 原理： 限制性內(nèi)切酶能識(shí)別 DNA中特定核苷酸順序，在正常情況下某種限制性內(nèi)切酶所切出的片段長(zhǎng)度是固定的，當(dāng)基因發(fā)生突變后, 核苷酸順序發(fā)生改變, 導(dǎo)致限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)改變，從而使片段長(zhǎng)度發(fā)生改變。單基因病診斷詳解501限制性酶譜直接分析法：?jiǎn)位虿≡\斷詳解50直接分析法鐮狀細(xì)胞貧血(HbS)： 第6位密碼子ATAA AS SSMst: CCTNAGG 1.2 Kb 0.2Kb1.40 Kb1.20 Kb0.20 KbA: CCTGAGGAGS: CCTGTGGAG單基因病診斷詳解51直接分析法鐮狀細(xì)胞貧血(HbS)： 第6位密碼子A/ / / - - / - - - - / - -單基因病診斷詳解52/ / / - - / - RFLP連鎖分析Neurofibroma, NF1 RFLP連鎖分析1 21 2 3 4 5 6 7 81 2 3 4 5 6 7 84.7 kb3.0 kb?單基因病診斷詳解53RFLP連鎖分析Neurofibroma, NF11 ASO點(diǎn)雜交(ASO dot hybridization