人子宮內(nèi)膜異位癥在位和異位內(nèi)膜細胞原代培養(yǎng)及形態(tài)學(xué)觀察

1、百度文庫-百度文庫-好好學(xué)習(xí)，天天向上 A:Endometrioticstromalcells;B:Endometrioticglandularcells.A:Eutopicendometrialglandularcellsfromendometriosisfreewomen;B:Eutopicendometrialstromalcellsfromendometriosisfreewomen;C:Eutopicendometrialglandularcellsfrompatientswithendometriosis;D:Eutopicendometrialstromalcellsfrompa

2、tientswithendometriosis;E:Endometrioticglandularcells;F:Endometrioticstromalcells.圖2正常對照和EM在位、異位子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞和腺上皮細胞形態(tài)特征(HE染色，X300)(略)Figure2Morphologicalcharacterizationofglandularandstromalcellsfrompatientswithendometriosisandendometriosisfreewomen(HEstaining,X300)電子顯微鏡觀察(1)正常對照子宮內(nèi)膜腺上皮細胞：細胞膜表面可見微絨毛，部分細胞

3、膜表面有長絨毛，細胞間見緊密連接及橋粒連接，胞漿線粒體、核糖體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)較豐富，可見脂滴，核大，核仁明顯。(2)正常對照子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞：一種是呈多角形的子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞，具有上皮樣形態(tài)的細胞表面未見微絨毛，細胞間無連接結(jié)構(gòu)，胞漿有散在核糖體及粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，可見溶酶體及一些囊泡，核膜平滑，核染色質(zhì)均勻。另一種細胞呈梭形，電鏡下見細胞無微絨毛，無連接結(jié)構(gòu)，胞漿粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核糖體和空泡較多，外周胞漿中有豐富的微絲。（3）EM在位子宮內(nèi)膜腺上皮細胞：細胞成團，有極性，圓形，胞膜表面有微絨毛，核大，呈橢圓形或有切跡，細胞間見橋粒連接，胞漿線粒體、核糖體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)較豐富，可見脂滴，核仁明顯。（4）EM在位

4、子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞：電鏡下見細胞表面無微絨毛，無連接結(jié)構(gòu)，胞漿內(nèi)有線粒體，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核糖體和空泡較多，溶酶體多見，核大，有不規(guī)則切跡、凹陷，核內(nèi)染色體稀疏，核仁明顯。（5）EM異位子宮內(nèi)膜腺上皮細胞：細胞游離，呈橢圓形，表面有細小微絨毛，細胞間有橋粒連接及緊密連接，核圓大，異染色質(zhì)多，胞漿內(nèi)多粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核糖體、溶酶體及空泡。（6）EM異位子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞：呈長梭形細胞，有較多微絨毛和胞漿突起，核大，橢圓形，核仁明顯，細胞間少有橋粒連接，胞漿內(nèi)有不規(guī)則線粒體和空泡，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核糖體可見。見圖3。圖3正常對照和EM在位、異位子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞和腺上皮細胞形態(tài)的電鏡觀察（略）Figure3Morp

5、hologicalcharacterizationofglandularandstromalcellsfrompatientswithendometriosisandendometriosisfreewomenbyelectronmicroscopeA:Eutopicendometrialglandularcellsfromendometriosisfreewomen(Xll000);B:Eutopicendometrialstromalcellsfromendometriosisfreewomen(X9300);C:Eutopicendometrialglandularcellsfrompa

6、tientswithendometriosis(X11000);D:Eutopicendometrialstromalcellsfrompatientswithendometriosis(X11000);E:Endometrioticglandularcells(X13000);F:Endometrioticstromalcells(X6300).討論EM的病因至今仍不清楚，較為經(jīng)典并被廣泛接受的是經(jīng)血逆流學(xué)說。隨著腹腔鏡的廣泛應(yīng)用，發(fā)現(xiàn)經(jīng)血逆流在生育期婦女十分普遍，但發(fā)展為EM的則只是少數(shù)。目前主要有兩種觀點：一種認為EM與免疫缺陷有關(guān)，由于EM患者存在免疫缺陷，不能清除隨經(jīng)血逆流的“異位”

7、子宮內(nèi)膜細胞，而導(dǎo)致其在盆腔內(nèi)種植6,7；另一種觀點則提出EM的發(fā)生與EM患者在位子宮內(nèi)膜細胞的特性有關(guān)，由于其發(fā)生了某些類似腫瘤細胞樣的改變，使之逃脫了免疫監(jiān)視和清除而得以在盆腔內(nèi)種植8。有學(xué)者提出子宮內(nèi)膜干細胞假說，即隨經(jīng)血逆流的具有分化潛能和自我更新特征的子宮內(nèi)膜干細胞促使了最初異位病灶的產(chǎn)生，并維持病灶的存在，促使病灶的進一步發(fā)展9。無論何種學(xué)說，顯然EM在位、異位子宮內(nèi)膜細胞與正常生育期婦女在位子宮內(nèi)膜細胞在基因、蛋白表達及生物學(xué)行為等方面均存在差異。因此，原代培養(yǎng)正常對照在位子宮內(nèi)膜細胞和EM在位及異位子宮內(nèi)膜細胞，對于研究細胞的生長、分化和代謝以及卵巢激素的作用機制，揭示EM的發(fā)

8、病機制及臨床治療均具有重要意義。但是，目前在位和異位子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞及腺上皮細胞的分離培養(yǎng)成功率并不高，尤其是異位子宮內(nèi)膜細胞的培養(yǎng)成功率較低。本研究采用自行改良方法對正常對照子宮內(nèi)膜和EM在位和異位子宮內(nèi)膜中腺上皮細胞及間質(zhì)細胞進行了體外原代培養(yǎng)，分別獲得純度較高的腺上皮細胞和間質(zhì)細胞，正常對照子宮內(nèi)膜細胞分離培養(yǎng)成功率達%；EM在位子宮內(nèi)膜細胞分離培養(yǎng)成功率達%；EM異位子宮內(nèi)膜細胞分離培養(yǎng)成功率達%，高于Ryan等10報道的56%和赫敏等11報道的%。EM異位子宮內(nèi)膜體外培養(yǎng)需注意以下幾點：（1）體積較大的卵巢巧克力囊腫，其內(nèi)皮分離培養(yǎng)后，細胞數(shù)量很少，不易分離培養(yǎng)成功。（2）巧克力囊腫

9、內(nèi)壁有新鮮出血且囊腫體積較?。ㄖ睆絍3cm）,分離培養(yǎng)后的細胞容易生長。（3）子宮韌帶異位結(jié)節(jié)以及腹膜異位灶的分離培養(yǎng)不易成功，但取材時若能獲取較大的紫紅色異位結(jié)節(jié)，亦可分離出數(shù)量較多的間質(zhì)細胞和腺上皮細胞。（4）本研究中內(nèi)膜標本消化時使用的是W型膠原酶和DNaseI,雖然價格較常用的胰酶貴，但是經(jīng)其消化后的間質(zhì)細胞容易貼壁生長。可以適當延長W型膠原酶和DNaseI的消化時間（一般為2h）,使內(nèi)膜組織充分消化以獲取更多的細胞。而胰酶消化時間過長會影響細胞的活性，使間質(zhì)細胞不易貼壁，甚至造成細胞培養(yǎng)失敗。（5）在子宮內(nèi)膜細胞分離培養(yǎng)過程中，離心次數(shù)不宜過多，離心轉(zhuǎn)速不宜過高，否則易造成細胞丟失，

10、并影響細胞活性。在本研究中，間質(zhì)細胞和腺上皮細胞的離心次數(shù)不超過4次，而離心轉(zhuǎn)速最高為1000r/min。離體在位和異位子宮內(nèi)膜細胞的爬片，排除了內(nèi)膜組織中非內(nèi)膜成分的干擾，有利于進行各項指標的檢測，使免疫細胞化學(xué)檢測定性、定位準確，還能進行半定量分析12。在光鏡及電鏡下，可對3種形態(tài)特征的細胞類型進行鑒別：（1）腺上皮細胞；（2）2種形態(tài)的間質(zhì)細胞，其中一種是呈多角形的子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞，另一種是呈梭形的子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞。透視電鏡下EM異位子宮內(nèi)膜腺上皮細胞中異染色質(zhì)增多，核增大，這種形態(tài)與癌細胞基本相似，可能與EM的惡性行為有關(guān)。而EM異位子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞的體積比正常對照及EM在位子宮內(nèi)膜間

11、質(zhì)細胞小，并且其細胞膜表面有較多的微絨毛和胞漿突起，說明EM異位子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞的運動能力和侵襲能力增強。Caetje等13用膠原凝膠體實驗檢測原代培養(yǎng)異位子宮內(nèi)膜細胞的侵襲活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)異位子宮內(nèi)膜細胞的侵襲活性與轉(zhuǎn)移性膀胱癌細胞株（E128）相似，而正常在位子宮內(nèi)膜細胞與非轉(zhuǎn)移性癌細胞株（RT112）相似，表明無侵襲性,證實了EM具有惡性腫瘤樣的侵襲特征。而本實驗中所觀察到EM異位子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞的形態(tài)改變，也可能與這種惡性腫瘤樣的侵襲特征有關(guān)。此外，EM異位子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞胞漿內(nèi)存在不規(guī)則線粒體，是否與這種侵襲特征相關(guān)，尚待進一步研究。本研究中采取的內(nèi)膜組織標本均為增生期內(nèi)膜，今后的研究

12、中需注意補充分泌期的內(nèi)膜標本，以進一步完善對離體在位和異位子宮內(nèi)膜的觀察和監(jiān)測，為EM研究提供充分的理論依據(jù)。參考文獻HaradaT,KaponisA,IwabeT,etal.Apoptosisinhumanendometriumandendometriosis.HumReprodUpdate,2004,10(1):2938.ColletteT,BellehumeurC,KatsR,etal.Evidenceforanincreasedreleaseofproteolyticactivitybytheeutopicendometrialtissueinwomenwithendometriosi

13、sandforinvolvementofmatrixmetalloproteinase9.HumReprod,2004,19(6):.譚先杰,劉東遠,郎景和,等.子宮內(nèi)膜腺上皮及基質(zhì)細胞分離、培養(yǎng)作為子宮內(nèi)膜異位癥體外細胞模型的探索.現(xiàn)代婦產(chǎn)科進展,2002,11(1):3032.王小敏,黃海鵬,何福仙.簡易人子宮內(nèi)膜細胞培養(yǎng)法及其優(yōu)點.贛南醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2002,22(3):256258.MatthewsCJ,RedfernCP,HirstBH,etal.Characterizationofhumanpurifiedepithelialandstromalcellsfromendometriu

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