反轉(zhuǎn)錄的原理及應(yīng)用(1)課件

1、RNA反轉(zhuǎn)錄原理及應(yīng)用2016年11月吳思思原理酶過程意義本實驗所用的技術(shù)12345頁碼 RNA反轉(zhuǎn)錄6注意事項 RNA反轉(zhuǎn)錄原理反轉(zhuǎn)錄是以RNA為模板,通過反轉(zhuǎn)錄酶(Reversetranscripatase),合成DNA的過程，是DNA生物合成的一種特殊方式。問題1：反轉(zhuǎn)錄酶是指代哪些？是特定的一個還是多個酶共同作用？答：反轉(zhuǎn)錄酶有兩種，一種是來源于哺乳動物，另一種來源于鳥類。哺乳類的反轉(zhuǎn)錄酶都是一條多肽鏈；鳥類的反轉(zhuǎn)錄酶則由兩上亞基結(jié)構(gòu)。所以反轉(zhuǎn)錄酶是特定的一個酶，但是它具有多種活性，在反轉(zhuǎn)錄不同階段中發(fā)揮不同的作用。 RNA反轉(zhuǎn)錄原理注：反轉(zhuǎn)錄與逆轉(zhuǎn)錄不等同。反轉(zhuǎn)錄是進行基因工程過程中

2、，人為地提取出所需要的目的基因的信使RNA，并以之為模板人工合成DNA的過程；逆轉(zhuǎn)錄是RNA類病毒自主行為，在整合到宿主細胞內(nèi)以RNA為模板形成DNA的過程。二者雖同為RNADNA的過程，但地點不同，相對性的來說，反轉(zhuǎn)錄在體外，逆轉(zhuǎn)錄在體內(nèi)。 RNA反轉(zhuǎn)錄過程 反轉(zhuǎn)錄的生物學(xué)意義（1）對分子生物學(xué)的中心法則進行了修正和補充（2）在致癌病毒的研究中發(fā)現(xiàn)了癌基因，在人類一些癌細胞如膀胱癌、 小細胞肺癌等細胞中，也分離出與病毒癌基因相同的堿基序列，稱為細胞癌基因或原癌基因。癌基因的發(fā)現(xiàn)為腫瘤發(fā)病機理的研究提供了很有前途的線索。（3）在實際工作中有助于基因工程的實施。由于目的基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物易于制備，可

3、將mRNA反向轉(zhuǎn)錄形成cDNA用以獲得目的基因。 技術(shù)應(yīng)用RT-PCRRT-PCR又稱反轉(zhuǎn)錄PCR。是將RNA的逆轉(zhuǎn)錄（RT）和聚合酶鏈式擴增反應(yīng)（PCR）相結(jié)合的技術(shù)。其原理是：提取組織或細胞中的總RNA，以其中的RNA作為模板，采用Oligo(dT)或隨機引物在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下反轉(zhuǎn)錄成cDNA。再以cDNA為模板進行PCR擴增，而獲得大量的cDNA。問題3：cDNA與DNA的區(qū)別答：cDNA就是由成熟mRNA經(jīng)過反轉(zhuǎn)錄過程而成反轉(zhuǎn)錄的DNA,與正常DNA相比區(qū)別是內(nèi)部無內(nèi)含子等結(jié)構(gòu)。 技術(shù)應(yīng)用RT-PCR引物隨機六聚體引物：對總RNA進行反轉(zhuǎn)錄Oligo(dT)：對mRNA進行反轉(zhuǎn)錄 操作RT-PCR以本實驗下丘腦c-fos mRNA表達測定為列。在微量EP管中加入以下反應(yīng)溶液：步驟1dT 引物dNTP 混合物處理過RNA酶的水 操作RT-PCR以本實驗下丘腦c-fos mRNA表達測定為列。反應(yīng)結(jié)束后在冰上急速冷卻，并加入以下試劑：步驟2得到cDNA引物 RNA 酶抑制劑反轉(zhuǎn)錄酶處理過RNA酶的水 技術(shù)應(yīng)用RT-PCR1 在實驗過程中要防止RNA的降解，保持RNA的完整性。在總RNA的提取過程中，注意避免mRNA的斷裂。2 防止DNA的污染，采用DNA酶處理RNA樣品。3. 防止蛋白質(zhì)的污染注意事項 技術(shù)應(yīng)用擴展QPCR在PC