設(shè)計(jì)引物遵循原則、引物保存和各種PCR的引物設(shè)計(jì)

1、設(shè)計(jì)引物遵循原則、引物保存和各種PCR的引物設(shè)計(jì)一設(shè)計(jì)引物應(yīng)遵循以下原則1、引物長(zhǎng)度：15-30bp，常用為20bp左右。2、引物擴(kuò)增跨度：以200-500bp為宜，特定條件下可擴(kuò)增長(zhǎng)至10kb 的片段。3、引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴(kuò)增效果不佳，G+C過(guò) 多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC最好隨機(jī)分布，避免5個(gè)以上的嘌吟或嘧啶 核苷酸的成串排列。上下游引物的GC含量不能相差太大。附加序列(RT site, Promoter sequence)加到5端，在算Tm值時(shí)不算,但在檢測(cè)互補(bǔ) 和二級(jí)結(jié)構(gòu)是要加上它們.引物對(duì)的Tm差異不超過(guò)5C，設(shè)計(jì)時(shí)溫度 和GC含量是個(gè)主要的參數(shù)，做

2、復(fù)合擴(kuò)增時(shí)更要設(shè)計(jì)成相近的溫度，而 且引物加個(gè)尾影響不大。但要切記BLAST，包括查閱文獻(xiàn)的引物.如果 兩個(gè)引物Tm不同，將退火溫度設(shè)定為比最低的Tm低5C,或者為了提高 特異性，可以在根據(jù)較高Tm設(shè)計(jì)的退火溫度先進(jìn)行5個(gè)循環(huán)，然后在根 據(jù)較低Tm設(shè)計(jì)的退火溫度進(jìn)行剩余的循環(huán)。4、避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級(jí)結(jié)構(gòu)，避免兩條引物間互補(bǔ)，特別是3端 的互補(bǔ)，否則會(huì)形成引物二聚體，產(chǎn)生非特異的擴(kuò)增條帶。引物序列 在模板內(nèi)應(yīng)當(dāng)沒(méi)有相似性較高，尤其是3端相似性較高的序列，否則 容易導(dǎo)致錯(cuò)配。引物二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu)的能值過(guò)高(超過(guò)4.5kcal/mo l)易導(dǎo)致產(chǎn)生引物二聚體帶，并且降低引物有效濃度而使PCR反應(yīng)不

3、 能正常進(jìn)行。5、引物3端的堿基，特別是最末及倒數(shù)第二個(gè)堿基，應(yīng)嚴(yán)格要求配 對(duì)，以避免因末端堿基不配對(duì)而導(dǎo)致PCR失敗。6、引物中有或能加上合適的酶切位點(diǎn)，被擴(kuò)增的靶序列最好有適宜 的酶切位點(diǎn)，這對(duì)酶切分析或分子克隆很有好處。引物5端引入酶 切位點(diǎn)得黏性末端，隨意加入3個(gè)保護(hù)性堿基，但是要注意不要形成引 物二聚體，而且以A或G開(kāi)頭為好。7、引物的特異性：引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)的其它序列無(wú)明顯同源 性。引物量：每條引物的濃度0.1lumol或10100pmol，以最低引 物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好，引物濃度偏高會(huì)引起錯(cuò)配和非特異性擴(kuò) 增，且可增加引物之間形成二聚體的機(jī)會(huì)。8、引物酶切：除非產(chǎn)物非常

4、特異，直接酶切PCR產(chǎn)物效果有時(shí)不是很 好，還有一般PCR體系里過(guò)量的dNTPs會(huì)影響酶切效果。酶切后，可以 用標(biāo)準(zhǔn)得乙醇沉淀法沉淀酶切產(chǎn)物，獲得高純度得酶切產(chǎn)物，也即是 你的黏性目斷片斷供后邊得試驗(yàn)。9、設(shè)計(jì)軟件： 最好學(xué)會(huì)使用一種design software. PP5,Oligo6,DN Astar, Vector NTI, Online desgin et al.二引物保存 定制引物以干粉形式運(yùn)輸。最好在TE重溶引物，使其最終濃度為100 mMo TE比去離子水好，因?yàn)樗膒H經(jīng)常偏酸，會(huì)引起寡核苷的水解。引物的穩(wěn)定性依賴于儲(chǔ)存條件。應(yīng)將干粉和溶解的引物儲(chǔ)存在-20C。 以大于10mM

5、濃度溶于TE的引物在-20C可以穩(wěn)定保存6個(gè)月，但在室 溫（15C到30C ）僅能保存不到1周。干粉引物可以在-20C保存至少1 年，在室溫（15C到30C ）最多可以保存2個(gè)月三 各種PCR的引物設(shè)計(jì)1、長(zhǎng)距離PCR：標(biāo)準(zhǔn)PCR的擴(kuò)增長(zhǎng)度在12kb間，不能滿足中大型基因的擴(kuò)增。在此背 景下產(chǎn)生了長(zhǎng)距離PCR。其引物設(shè)計(jì)原則在標(biāo)準(zhǔn)PCR的基礎(chǔ)上還要注意 一下幾點(diǎn)：a、長(zhǎng)度一般在2530bp間；b、兩條引物的解鏈溫度趨向相等是非常 重要的。如果兩條引物的解鏈溫度的差異大于1度，就可能造成錯(cuò)誤引 導(dǎo)以及一條鏈的優(yōu)勢(shì)擴(kuò)增等問(wèn)題。2、反相PCR：標(biāo)準(zhǔn)PCR應(yīng)用于已知片斷的擴(kuò)增。而反相PCR應(yīng)用于擴(kuò)增已

6、知片斷相鄰 的未知片斷，主要應(yīng)用于a，產(chǎn)生探針；b，從總RNA中克隆未知cDNA序 列；c、研究病毒序列、轉(zhuǎn)基因和轉(zhuǎn)座子的整合點(diǎn)位區(qū)域的序列。其引物設(shè)計(jì)除了要注意在模板分子上的設(shè)置方向外，其它同標(biāo)準(zhǔn)原則。3、差異顯示PCR （DD-PCR）: 次技術(shù)的應(yīng)用在于顯示細(xì)胞的全部mRNA，通過(guò)比較兩種細(xì)胞或者不同 環(huán)境中的同種細(xì)胞的cDNA擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳條帶譜來(lái)鑒定基因表達(dá)圖譜 的差異。其引物有兩套，一為錨定引物，一為隨機(jī)引物。錨定引物是由12個(gè)不 同引物組成的庫(kù)，序列是5TTTTTTTTTTTTXY3其中X可以是AGC中的任 一個(gè)，Y可以是ATGC中的任一個(gè)。隨機(jī)引物是由15個(gè)不同的，長(zhǎng)度為10 mer的引物組成。它們的序列都是隨機(jī)形成的，都應(yīng)改包含幾乎相等的 四種單核苷酸，G與C堿基的平衡分布以及具有低自發(fā)形成穩(wěn)定二級(jí)結(jié) 構(gòu)的傾向。4、多重PCR:多重PCR就是在PCR中使用一對(duì)以上的引物同時(shí)擴(kuò)增目的DNA的幾個(gè)片斷， 以節(jié)省模板、節(jié)約時(shí)間和減少費(fèi)用。引物設(shè)計(jì)在遵守標(biāo)準(zhǔn)PCR引物設(shè)計(jì) 的規(guī)則外還要保證反應(yīng)中所有的引物有相近的熔解溫度，引物之間不 會(huì)發(fā)生相互作用，擴(kuò)增