生物制藥-第三章-基因工程制藥-基因工程藥物制造實(shí)例和質(zhì)量控制課件

1、第八節(jié)基因工程藥物制造實(shí)例 一、干擾素 二、人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子 三、人白細(xì)胞介素-2 四、美洲商陸抗病毒蛋白第八節(jié)基因工程藥物制造實(shí)例 一、干擾素 干擾素（interferon，IFN）是人體細(xì)胞分泌的一種活性蛋白質(zhì)，具有廣泛的抗病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)活性，是人體防御系統(tǒng)的重要組成部分。根據(jù)分子結(jié)構(gòu)和抗原性的差異分為、等4個(gè)類型。型干擾素在分為1b，2a ，2b等亞型，其區(qū)別表現(xiàn)在個(gè)別氨基酸的差異上。 干擾素（interferon，IFN）是人體細(xì)胞分一、基因工程菌的組建構(gòu)建干擾素工程菌流程圖一、基因工程菌的組建構(gòu)建干擾素工程菌流程圖一、干擾素基因工程菌的組建流程誘生的白細(xì)胞 提取全

2、RNA 通過寡dT-纖維素柱 蔗糖密度梯度 獲得寡A的mRNA 離心提取12s 的 mRNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA 雙鏈cDNA接上dT或dG尾 pBR322質(zhì)粒 pBR322質(zhì)粒加上dA或dC一、干擾素基因工程菌的組建流程 退火獲的雜交質(zhì)粒 轉(zhuǎn)化大腸桿菌 擴(kuò)增雜交質(zhì)粒 篩選抗青霉素但對(duì)氨芐 青霉素敏感細(xì)菌克隆用雜交翻譯法挑選含干擾素cDNA克隆 將干擾素cDNA克隆入表達(dá)載體 在大腸桿菌中進(jìn)行高效表達(dá)生物制藥-第三章-基因工程制藥-基因工程藥物制造實(shí)例和質(zhì)量控制課件二、基因工程干擾素的制備啟開種子 制備種子液 發(fā)酵培養(yǎng) 粗提精提 半成品制備 半成品檢定 分裝凍干 成品檢定 成品包裝制備基因工程干

3、擾素的工藝流程圖二、基因工程干擾素的制備制備基因工程干擾素的工藝流程圖三、人2b型干擾素(hIFN2b)工程菌株的組建過程應(yīng)用PCR的方法，從人的染色體片段制備人2b干擾素的cDNA，將其克隆到pRC23表達(dá)載體上，構(gòu)建成重組表達(dá)質(zhì)粒pMZI2B，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，組建成工程菌株。由于pMZI2B的2b基因5端起始密碼ATG上游編制了一段SD順序，與PL啟動(dòng)子上連接的SD順序組成雙SD順序，所以克隆基因的表達(dá)水平有明顯的提高。三、人2b型干擾素(hIFN2b)工程菌株的組建過程應(yīng)1. hIFN-2b基因的獲得 用于克隆的人2b干擾素基因是應(yīng)用PCR方法從帶有人2b干擾素基因的染色體片段獲

4、得的：模板DNA 4ng，引物為50pmol/L，各25L 4dNTP 4L，TaqDNA聚合酶2.5L，10PCR反應(yīng)緩沖液10L，補(bǔ)水使總反應(yīng)體積為100L。反應(yīng)條件：變性溫度為94 ，退火溫度為50，鏈延伸溫度為72 。共30個(gè)循環(huán)。1. hIFN-2b基因的獲得采用PCR技術(shù)擴(kuò)增的人2b干擾素基因片段，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離，其片段大小約相當(dāng)于0.55kb。將該片段插入質(zhì)粒pGEM-3的EcoR I和BamH I的位點(diǎn)上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，培養(yǎng)后提取質(zhì)粒DNA，用引物SP6和T7從兩端測(cè)定DNA順序。結(jié)果證明其順序與文獻(xiàn)報(bào)道的基因順序是一致的。采用PCR技術(shù)擴(kuò)增的人2b干擾素基因

5、片段，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠2重組表達(dá)質(zhì)粒pMZI2B的構(gòu)建 pGEM-32bB質(zhì)粒經(jīng)EcoR I和BamH I雙酶解，切下2b-B片段，純化后克隆到質(zhì)粒pRC23的EcoR I和BamH I位點(diǎn)上，構(gòu)建成重組表達(dá)質(zhì)粒pMZI2B(見圖)。2重組表達(dá)質(zhì)粒pMZI2B的構(gòu)建3人2b型干擾素工程菌株的形成與基因的表達(dá) 將重組表達(dá)質(zhì)粒pMZI2B轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a形成工程菌。經(jīng)37 搖床培養(yǎng)后進(jìn)行抗病毒活性檢測(cè)。3人2b型干擾素工程菌株的形成與基因的表達(dá)結(jié)果表明，具有雙SD序列的pMZI2B的抗病毒活性(1.69x104IUmL)，與僅具有單SD序列的pMZI2A(其組建過程同上)的抗病毒活性(3.46

6、xl03IUmL)相比，有顯著的提高。這是因?yàn)榛虻谋磉_(dá)水平與轉(zhuǎn)錄和翻譯兩個(gè)主要環(huán)節(jié)密切相關(guān)，而SD序列在蛋白質(zhì)翻譯中是核糖體的識(shí)別和結(jié)合部位，因此，增加SD序列，即增加了蛋白質(zhì)翻譯時(shí)核糖體的識(shí)別和結(jié)合機(jī)率。結(jié)果表明，具有雙SD序列的pMZI2B的抗病毒活性(1.692b干擾素的生產(chǎn)4.發(fā)酵 工程菌：SW-IFN-2b/E.coli DH5，質(zhì)粒用PL啟動(dòng)子，含氨芐青霉素抗性基因。培養(yǎng)基含1%蛋白胨、0.5%酵母提取物、0.5%NaCl。搖床培養(yǎng)30，10h，培養(yǎng)發(fā)酵罐種子。15L發(fā)酵罐培養(yǎng)， 30 ，8h。然后42 ，2-3h即可完成發(fā)酵。每隔2h取樣測(cè)OD或離心去上清稱量菌體濕重。2b干擾

7、素的生產(chǎn) 4.產(chǎn)品的提取與純化 4,000r/min離心30分鐘，去上清，得濕菌泥。 濕菌超聲破碎，離心，取沉淀部分，溶液處理，離心取上清液，上清超濾濃縮， Sephadex G50 分離。 經(jīng)SDS檢查。 再經(jīng)DE-52柱純化人干擾素2b。 4.產(chǎn)品的提取與純化質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)和要求 半成品檢定干擾素效價(jià)測(cè)定蛋白質(zhì)含量測(cè)定比活性純度測(cè)定相對(duì)分子量測(cè)定殘余外源性DNA含量測(cè)定殘余血清IgG含量測(cè)定質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)和要求 半成品檢定殘余抗生素活性測(cè)定紫外光譜掃描肽圖測(cè)定等電點(diǎn)測(cè)定除菌半成品應(yīng)做干擾素效價(jià)測(cè)定、無(wú)菌試驗(yàn)、熱原質(zhì)試驗(yàn)。 殘余抗生素活性測(cè)定 成品檢定物理性狀鑒別試驗(yàn)水分測(cè)定無(wú)菌試驗(yàn)熱原試驗(yàn)干擾

8、素效價(jià)測(cè)定安全試驗(yàn) 美洲商陸 成品檢定物理性狀第九節(jié) 基因工程藥物的質(zhì)量控制基因工程藥物與傳統(tǒng)意義上的一般藥品的生產(chǎn)不同，首先它是利用活的細(xì)胞作為表達(dá)系統(tǒng)，所獲蛋白質(zhì)產(chǎn)品往往相對(duì)分子質(zhì)量較大，并具有復(fù)雜的結(jié)構(gòu)；許多基因工程藥物還是參與人體一些生理功能精密調(diào)節(jié)所必需的蛋白質(zhì)，極微量就可產(chǎn)生顯著效應(yīng)(每劑量的用量：白介素-12僅0.1 g， 干擾素也只有1030 g)，任何藥物性質(zhì)或劑量上的偏差，都可能貽誤病情甚至造成嚴(yán)重危害。第九節(jié) 基因工程藥物的質(zhì)量控制基因工程藥物與傳統(tǒng)意義上的一基因工程藥物需要在宿主細(xì)胞中表達(dá)的外源基因，在轉(zhuǎn)錄或翻譯、精制、工藝放大過程中，都有可能發(fā)生變化，所以從原料制備過

9、程產(chǎn)品的每一步都必須嚴(yán)格控制條件和鑒定質(zhì)量，確保產(chǎn)品符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、安全有效。基因工程藥物需要在宿主細(xì)胞中表達(dá)的外源基因，在轉(zhuǎn)錄或翻譯、精一、原材料的質(zhì)量控制 原材料的質(zhì)量控制是要確保編碼藥品的DNA序列的正確性，重組微生物來(lái)自單一克隆，所用質(zhì)粒純而穩(wěn)定，以保證產(chǎn)品質(zhì)量的安全性和一致性。一、原材料的質(zhì)量控制應(yīng)該了解：需要明確目的基因的來(lái)源、克隆經(jīng)過、限制性內(nèi)切酶酶切圖譜、核苷酸序列；應(yīng)提供表達(dá)載體的名稱、結(jié)構(gòu)、遺傳特性及其各組成部分(如復(fù)制子、啟動(dòng)子)的來(lái)源與功能，構(gòu)建中所用位點(diǎn)的酶切圖譜，抗生素抗性標(biāo)志物；應(yīng)提供宿主細(xì)胞的名稱、來(lái)源、傳代歷史、檢定結(jié)果及其生物學(xué)特性等；應(yīng)該了解：需闡明載體引人

10、宿主細(xì)胞的方法及載體在宿主細(xì)胞內(nèi)的狀態(tài)，如是否整合到染色體內(nèi)及在其中的拷貝數(shù)、宿主細(xì)胞與載體結(jié)合后的遺傳穩(wěn)定性；提供插入基因與表達(dá)載體兩側(cè)端控制區(qū)內(nèi)的核苷酸序列，在生產(chǎn)過程中，啟動(dòng)與控制克隆基因在宿主細(xì)胞中表達(dá)的方法及水平等。需闡明載體引人宿主細(xì)胞的方法及載體在宿主細(xì)胞內(nèi)的狀態(tài)，如是二、培養(yǎng)過程的質(zhì)量控制 在工程菌菌種貯存中，要求種子克隆純而穩(wěn)定；在培養(yǎng)過程中，要求工程菌所含的質(zhì)粒穩(wěn)定，始終無(wú)突變；在重復(fù)生產(chǎn)發(fā)酵中，工程菌表達(dá)穩(wěn)定；始終能排除外源微生物污染。二、培養(yǎng)過程的質(zhì)量控制 三、純化工藝過程的質(zhì)量控制 產(chǎn)品要有足夠的生理和生物學(xué)試驗(yàn)數(shù)據(jù)，確證提純物分子批間保持一致性；外源蛋白質(zhì)、DNA與

11、熱原質(zhì)都控制在規(guī)定限度以下。在精制過程中避免宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)、核酸、糖類、病毒、培養(yǎng)基成分等的污染，并用相應(yīng)的方法進(jìn)行檢測(cè)。 三、純化工藝過程的質(zhì)量控制四、目標(biāo)產(chǎn)品的質(zhì)量控制需要綜合利用生物化學(xué)、免疫學(xué)、微生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)等多門學(xué)科的理論與技術(shù)所建立起來(lái)的鑒定方法，以保證基因工程藥品安全有效。四、目標(biāo)產(chǎn)品的質(zhì)量控制1、產(chǎn)品的鑒定肽圖分析氨基酸成分分析部分氨基酸序列分析重組蛋白質(zhì)的濃度和相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定蛋白質(zhì)二硫鍵分析1、產(chǎn)品的鑒定重組蛋白質(zhì)藥物產(chǎn)品常用的鑒定方法重組蛋白質(zhì)藥物產(chǎn)品常用的鑒定方法2純度分析純度分析是基因工程藥物質(zhì)量控制的關(guān)鍵項(xiàng)目，它包括目的蛋白質(zhì)含量測(cè)定和雜質(zhì)限量分析

12、兩個(gè)方面的內(nèi)容。(1)目的蛋白質(zhì)含量測(cè)定 測(cè)定蛋白質(zhì)含量的方法可根據(jù)目的蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)和生物學(xué)特性來(lái)設(shè)計(jì)。通常采用的方法有還原性及非還原性SDS、等電點(diǎn)聚焦、各種HPLC、毛細(xì)管電泳(CE)等。2純度分析(2)雜質(zhì) 基因工程產(chǎn)物的雜質(zhì)包括蛋白質(zhì)和非蛋白質(zhì)兩類。通常需要檢測(cè)的雜質(zhì)及其檢測(cè)方法見下表。(2)雜質(zhì) 基因工程產(chǎn)物的雜質(zhì)包括蛋白質(zhì)和非蛋白質(zhì)兩類?；蚬こ坍a(chǎn)物中常見雜質(zhì)和污染物及其檢測(cè)方法基因工程產(chǎn)物中常見雜質(zhì)和污染物及其檢測(cè)方法3生物活性測(cè)定 生物活性測(cè)定是保證基因工程藥物產(chǎn)品有效性的重要手段，往往需要進(jìn)行動(dòng)物體內(nèi)試驗(yàn)和通過細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)行體外效價(jià)測(cè)定。3生物活性測(cè)定4穩(wěn)定性檢驗(yàn)藥品的穩(wěn)定

13、性是評(píng)價(jià)藥品有效性和安全性的重要指標(biāo)之一，也是確定藥品貯藏條件和使用期限的主要依據(jù)。采用恰當(dāng)?shù)奈锢砘瘜W(xué)、生物化學(xué)和免疫化學(xué)技術(shù)對(duì)其活性成分的性質(zhì)進(jìn)行全面鑒定，要準(zhǔn)確檢測(cè)在貯藏過程中由于脫氨、氧化、磺?；?、聚合或降解等造成的分子變化。4穩(wěn)定性檢驗(yàn)5產(chǎn)品一致性的保證 以重組DNA技術(shù)為主的生物制藥是一個(gè)十分復(fù)雜的過程，生產(chǎn)周期可達(dá)一個(gè)月甚至更長(zhǎng)，影響因素較多。需要對(duì)原料生產(chǎn)產(chǎn)品的每一環(huán)節(jié)都進(jìn)行嚴(yán)格的控制和質(zhì)量檢定，才能確保各批最終產(chǎn)品都是安全有效、含量和雜質(zhì)限度一致并符合標(biāo)準(zhǔn)。5產(chǎn)品一致性的保證五、產(chǎn)品的保存1、液態(tài)保存（1）、低溫保存（2）、穩(wěn)定pH條件下保存（3）、高濃度保存（4）、加保護(hù)劑保存五、產(chǎn)品的保存蛋白質(zhì)的穩(wěn)定劑有糖類、脂肪類、蛋白質(zhì)類、多元醇、有機(jī)溶劑等；有些蛋白質(zhì)在高離子強(qiáng)度的極性環(huán)境下才能保持其活性，加入中性鹽可穩(wěn)定這些蛋白質(zhì)；某些蛋白質(zhì)表面或內(nèi)部含有半胱氨酸巰基，容易被空氣中的氧緩慢氧化為次磺酸或二硫化物，使蛋白質(zhì)的電荷或構(gòu)象發(fā)生改變而失活，可加入-巰基乙醇、二硫蘇糖醇等，在真空或惰性氣體中密閉保存。蛋白質(zhì)的穩(wěn)定劑有糖類、脂肪類、蛋白質(zhì)類、多元醇、有機(jī)溶劑等；2、固態(tài)保存 固態(tài)蛋白質(zhì)比液態(tài)穩(wěn)定，一般蛋白質(zhì)含水量降到5