章樂-細(xì)胞應(yīng)激課件

1、第四章 細(xì)胞應(yīng)激授課教師： 章樂 副教授個人簡歷 章樂，醫(yī)學(xué)博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，病理生理教研室主任，辦公室電話第一節(jié) 概 述第二節(jié) 細(xì) 胞 應(yīng) 激 反 應(yīng)第三節(jié) 細(xì)胞應(yīng)激的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和轉(zhuǎn)錄因子第四節(jié) 常見細(xì)胞應(yīng)激的類型及機制第一節(jié) 概述一、細(xì)胞應(yīng)激的基本概念二、細(xì)胞應(yīng)激原什么是應(yīng)激?應(yīng)激是否對人有利？同一個刺激因素，每個人的反應(yīng)是否一樣？Stress人胞一理 細(xì)胞是人體的基本組成單位。細(xì)胞的生存過程當(dāng)中不可避免的受到各種體內(nèi)外致?lián)p傷因素作用，造成細(xì)胞膜、細(xì)胞器、DNA等的損傷。細(xì)胞對損傷的反應(yīng)依據(jù)因素的強弱和細(xì)胞的類型而異。一、細(xì)胞應(yīng)激（cellular s

2、tress)概念：細(xì)胞處于不利環(huán)境和遇到有害刺激時所產(chǎn)生的防御或適應(yīng)性反應(yīng)稱為細(xì)胞應(yīng)激。二、細(xì)胞應(yīng)激原能使細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)的刺激或因素稱為細(xì)胞應(yīng)激原。種類： 1、物理因素（電離、輻射、冷熱、機械損傷） 2、化學(xué)因素(藥物、毒物、化學(xué)物質(zhì)) 3、因素（病毒、細(xì)菌、霉菌、寄生蟲）4、必需物質(zhì)缺乏（低氧、缺乏蛋白質(zhì)或維生素）5、內(nèi)環(huán)境失調(diào)（代謝產(chǎn)生活性氧、低滲高滲、酸堿失衡）第二節(jié) 細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)一、細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)有序性二、應(yīng)激激活的細(xì)胞胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及轉(zhuǎn)錄因子三、細(xì)胞應(yīng)激引發(fā)的生物效應(yīng)一、細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)的有序性1、應(yīng)激原啟動細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、調(diào)節(jié)靶蛋白活性、促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)提高轉(zhuǎn)錄活性2、轉(zhuǎn)錄因

3、子促進(jìn)應(yīng)激基因的快速表達(dá)，合成多種特異性和非特異性的對細(xì)胞具有保護(hù)作用的應(yīng)激蛋白質(zhì)3、應(yīng)激蛋白質(zhì)保護(hù)細(xì)胞免受損傷或修復(fù)已受損傷4、修復(fù)不成功啟動凋亡機制，犧牲個體利益保護(hù)組織整體利益二、細(xì)胞應(yīng)激激活的細(xì)胞胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及轉(zhuǎn)錄因子（一）主要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路：1、絲裂原活化的蛋白激酶的途徑（mitogen-activated protein kinase MAPK）2、激活多種磷脂酶的途徑3、DNA損傷激活的蛋白激酶途徑細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的典型過程配體與細(xì)胞膜受體的識別后結(jié)合跨膜信號傳遞細(xì)胞內(nèi)蛋白級聯(lián)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞反應(yīng)信號終止1、絲裂原活化的蛋白激酶的途徑（mitogen-activated prote

4、in kinase MAPK）2、激活多種磷脂酶的途徑3、DNA損傷激活的蛋白激酶途徑（一）主要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路： 不同的應(yīng)激原作用細(xì)胞后，通過不同反應(yīng)機制啟動信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。這個過程比較復(fù)雜可以是一個應(yīng)激原激活多條轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，也可以是一條轉(zhuǎn)導(dǎo)通路由多個應(yīng)激原啟動。轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和靶蛋白之間相互協(xié)調(diào)平衡，且存在多水平通路間相互交流，形成復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)體系。細(xì)胞最終的命運是多條通路共同作用的結(jié)果。1、絲裂原活化的蛋白激酶途徑（MAPK） （mitogen-activated protein kinase 參與介導(dǎo)細(xì)胞生長、分裂、分化、死亡以及細(xì)胞間的功能同步等多種生理過程。在細(xì)胞內(nèi)以MAPKKKMAPKKMAP

5、K為主干，再加上各種上游影響因子和下游作用底物，構(gòu)成了一個功能多樣、反應(yīng)靈敏的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)。這些細(xì)胞信號酶把細(xì)胞外信號從細(xì)胞表面?zhèn)鬟f到細(xì)胞核，導(dǎo)致基因表達(dá)發(fā)生變化。 （1）JNK/SAPK途徑 （2）p38途徑 （3）ERK途徑 MAPKKKMAPKKMAPKMAPK家族酶的激活機制都通過磷酸化的三級酶促級聯(lián)反應(yīng)酪氨酸蛋白激酶體系JNK途徑應(yīng)激原：紫外線、DNA損傷劑、活性氧、高滲狀態(tài)、促炎細(xì)胞因子 磷酸化級聯(lián)反應(yīng)是：MEKK1，2MKK4JNKKJNKSAPK活化的轉(zhuǎn)錄因子：cjun、ATF2（activated transcription factor 2cAMP反應(yīng)件結(jié)合蛋白）、P53、

6、Elk1和CREB (cAMP response element-binding protein)等作用：細(xì)胞增殖、分化和腫瘤轉(zhuǎn)化等過程起JNK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是1991年發(fā)現(xiàn)的一類MAPK通路。JNK蛋白激酶由3個基因編碼, jnk 1和jnk 2基因在全身廣泛表達(dá),而jnk 3呈限制性表達(dá),僅見于腦、心臟和睪丸。在未受刺激的細(xì)胞中, JNK主要存在于胞質(zhì)內(nèi),但核內(nèi)也有一定分布。在受到刺激后, JNK迅速而顯著地聚積于核內(nèi),并導(dǎo)致相應(yīng)基因表達(dá)改變. 損傷組織中JNK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活是一個級聯(lián)過程,具有一定時間規(guī)律性。 由于個體差異、損傷程度及損傷部位不同等原因,檢材中JNK的檢測可能會受到多種

7、因素影響。研究進(jìn)展 針對不同損傷類型及不同組織檢材的JNK表達(dá)進(jìn)行細(xì)致研究,可能對法醫(yī)學(xué)鑒定生前、死后傷(特別是瀕死傷),以及推斷生前損傷時間、判斷損傷程度具有重要意義,故JNK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在法醫(yī)學(xué)實踐中的應(yīng)用前景十分廣闊。（2）p38途徑 應(yīng)激原 ：高滲液、脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)、細(xì)胞因子和PKC的特異性激活劑PMA磷酸化級聯(lián)反應(yīng)是：MEKKsMKK6，MKK3p38 活化的轉(zhuǎn)錄因子：Elk、ATF-2和Max（磷酸化的Max能與Myc形成復(fù)合物）、與細(xì)胞周期阻滯的 CEBP（CCAATenhance binding proteins）家族的轉(zhuǎn)錄因子CEBP

8、；(即CHOPGADD153）作用：細(xì)胞周期阻滯（3）ERK（細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶）途徑 應(yīng)激原 ：多種應(yīng)激原激活 磷酸化級聯(lián)反應(yīng)是：RasRafMAPKK（MEK）ERK 活化的轉(zhuǎn)錄因子：c-Fos、c-myc、IL-6的核因子（nuclear factor forIL-6NF-IL6）、STAT 作用：促進(jìn)細(xì)胞的增殖和分化 靶蛋白 磷酸化受體TPKPGDPGTPMEKERKRaf靶基因 轉(zhuǎn)錄(extracellular signal regulated kinase，ERK)生長因子Grb2 SosRasTyrosine protein kinase-mediated signal tr

9、ansduction pathway 1、絲裂原活化的蛋白激酶的途徑（mitogen-activated protein kinase MAPK）2、激活多種磷脂酶的途徑3、DNA損傷激活的蛋白激酶途徑（一）主要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路：2、激活多種磷脂酶的途徑各種相應(yīng)的應(yīng)激原可以激活各種相應(yīng)的磷脂酶（磷脂酶C PLC和磷脂酶D PLD 、磷脂酶A2 PLA2 、鞘磷脂酶 SMase） 靶蛋白 磷酸化靶基因 轉(zhuǎn)錄1受體 AngII受體PIP2PKCCa2GqIP3DAGPLCPhospholipase C signal transduction pathway（1）磷脂酶C（PLC）和磷脂酶D （PLD

10、）磷脂酰肌醇二磷酸二酚甘油三磷酸肌醇具有拮抗細(xì)胞凋亡的作用。 PKC通路具有拮抗細(xì)胞凋亡的作用。致使細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度增高，這是炎癥細(xì)胞被激活的重要標(biāo)志。 (2)磷脂酶A2（PLA2）應(yīng)激原：TNF、凝血酶、緩激肽作用：炎癥反應(yīng)(3)鞘磷脂酶（SMase）應(yīng)激原：包括細(xì)胞因子（如TNF）、激素（如糖皮質(zhì)激素和維生素D。）、某些化療藥物、電離輻射、紫外線、熱休克、氧化應(yīng)激其信號通路被稱為鞘磷脂-神經(jīng)酰胺通路。SMase降解鞘磷脂產(chǎn)生神經(jīng)酰胺（ceramidc，CM）和磷酸膽堿（phosphocholine），（CM）是細(xì)胞內(nèi)重要的第二信使，能介導(dǎo)多種受體和環(huán)境應(yīng)激在細(xì)胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，具有復(fù)雜的作

11、用。中性SMase：分布于細(xì)胞膜上，與ERK通路及促進(jìn)細(xì)胞增殖、炎癥反應(yīng)的發(fā)生有關(guān)酸性SMase ：分布于溶酶體的前者，后者與SAPK通路及細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。 1、絲裂原活化的蛋白激酶的途徑（mitogen-activated protein kinase MAPK）2、激活多種磷脂酶的途徑3、DNA損傷激活的蛋白激酶途徑（一）主要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路：3、DNA損傷激活的蛋白激酶途徑（1）紫外線、電離輻射DNA損傷（2）激活DNA活化蛋白激酶、血管擴張共濟失調(diào)突變激酶（3） P53 、c-Jun 、c-Fos 、HSP90磷酸化或活性改變4其他的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路PI3 K-蛋白激酶 B（PKB）通路P

12、I3 KPKB通路具有促進(jìn)細(xì)胞生存和抗凋亡的作用，研究發(fā)現(xiàn)高滲處理酵母和猴COS-7細(xì)胞通過激活該通路而保護(hù)上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等免于因紫外線照射、去除培養(yǎng)液中的血清或生長因子等所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。1、絲裂原活化的蛋白激酶的途徑（mitogen-activated protein kinase MAPK）2、激活多種磷脂酶的途徑3、DNA損傷激活的蛋白激酶的途徑4其他的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路（一）主要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路：第三節(jié) 應(yīng)激引發(fā)的生物效應(yīng) 產(chǎn)生非特異性防御反應(yīng) 產(chǎn)生特異性防御反應(yīng) 對細(xì)胞增殖的影響 誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡應(yīng)激引發(fā)的生物效應(yīng)產(chǎn)生非特異性防御反應(yīng)（HSP) DNA損傷 基因毒應(yīng)激產(chǎn)生特異性防御反應(yīng)

13、缺氧 缺氧性應(yīng)激 活性氧、自由基 氧化性應(yīng)激 促進(jìn)細(xì)胞增殖對細(xì)胞增殖的影響 抑制細(xì)胞增殖誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡（一）非特異性防御反應(yīng) 熱休克反應(yīng) 熱休克蛋白及其種類 熱休克蛋白表達(dá)機制 Cell-humour responses to stress 急性期反應(yīng)蛋白（Acute phase protein, APP） 熱休克蛋白（Heat shock protein, HSP） 細(xì)胞反應(yīng)蛋白 【負(fù)急性期反應(yīng)蛋白】 少數(shù)蛋白在急性期反應(yīng)時減少，如白蛋白、前白蛋白、運鐵蛋白等，稱為負(fù)急性期反應(yīng)蛋白。 【Acute phase protein】 急性期反應(yīng)時血漿中某些蛋白質(zhì)濃度迅速升高，稱為APP。 1、 急性

14、期反應(yīng)蛋白（Acute phase protein, APP） 【Acute phase response】 許多疾病，尤其是傳染性疾病、外傷性疾病、炎癥和免疫性疾病時，于短時間內(nèi)（數(shù)小時至數(shù)天），機體發(fā)生的以防御反應(yīng)為主的非特異性反應(yīng)。軀體應(yīng)激原作用 （2）APP分類（Classification of APP） 蛋白酶抑制蛋白 1抗胰蛋白酶 凝血與纖溶相關(guān)蛋白 應(yīng)激 凝血酶原、纖溶酶原、纖維蛋白原、因子 補體成分 轉(zhuǎn)運蛋白（血漿銅藍(lán)蛋白、血紅素結(jié)合蛋白、結(jié)合珠蛋白等） 其他蛋白質(zhì)（CRP、FN、血清淀粉樣A蛋白、1酸性糖 蛋白等） （ 1）APP來源（Origin of APP） APP由

15、肝臟合成。 APP是分泌性蛋白，應(yīng)激時明顯增加。Stress（3）APP生物學(xué)功能（Function of APP）減輕組織損傷 蛋白酶抑制蛋白 減輕組織損傷阻止病原體擴散 炎癥區(qū)組織間隙中Fln 阻止病原體、毒性擴散 促進(jìn)吞噬細(xì)胞功能 血清炎癥因子CRP + 細(xì)菌壁結(jié)合 吞噬細(xì)胞功能清除壞死組織的作用 抑制血小板磷脂酶 炎癥介質(zhì) 壞死組織清除 血清淀粉樣A蛋白可促使損傷細(xì)胞修復(fù)。Stress 2、熱休克蛋白（Heat shock protein, HSP） 【HSP定義】 細(xì)胞在應(yīng)激原特別是環(huán)境高溫誘導(dǎo)下所生成的一組蛋白質(zhì)。 HSP are produced by cells in resp

16、onse to a variety of insults. Cells respond to a variety of stressful stimuli by increasing the synthesis of HSP. （1）功能與分類（Funcation and classification of HSP） HSP：HSP110、HSP90、HSP70、HSP60和小分子HSP等。 誘生性HSP 由各種應(yīng)激原誘導(dǎo)生成，參與受損蛋白質(zhì)的修復(fù)或移除，保護(hù) 細(xì)胞免受嚴(yán)重?fù)p傷，加速修復(fù)；提高細(xì)胞對應(yīng)激原的耐受性。 結(jié)構(gòu)性HSP 為細(xì)胞的結(jié)構(gòu)蛋白,正常時即存在于細(xì)胞內(nèi)，幫助新生的蛋白質(zhì)進(jìn)行正確

17、的折疊、移位、降解，稱為“Molecular chaperone”。 （2）HSP的基本結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系Relation between basic structure and function of HSP HSP70的結(jié)構(gòu)示意圖ATP酶結(jié)構(gòu)域（高度保守） 基質(zhì)識別區(qū)域（可變區(qū)）蛋白酶敏感位點N- 450氨基酸殘基 200氨基酸殘基 -CN端：具有ATP酶活性的高度保守序列；C端：具有相對可變的基質(zhì)識別序列，與受損蛋白的疏水區(qū)結(jié)合。 受損蛋白恢復(fù)正確折疊消耗ATPStress HSP功能 修復(fù)損傷的蛋白，使細(xì)胞維持正常的生理功能，提高細(xì)胞對應(yīng)激原的耐受性。(誘生性HSP70 ) 調(diào)節(jié)Na+-

18、K+-ATP酶活性。與HSPF單體結(jié)合，抑制HSPF三聚體形成，抑制HSP生成。 （3）HSP基因表達(dá)調(diào)控應(yīng)激HSPHSFHSEHSF：熱休克轉(zhuǎn)錄因子； HSE：熱休克元件HSF三聚體protein HSPproteinStress 無刺激因素存在時，這3個序列在HSF內(nèi)部形成穩(wěn)定的卷曲螺旋結(jié)構(gòu)，以維持HSF無活性的單體狀態(tài); 當(dāng)細(xì)胞受到刺激時， HSF單體通過三聚體結(jié)構(gòu)域結(jié)合形成具有活性的三聚體。HSF三聚體靠其DNA結(jié)合域與熱休克基因上游的一段特殊的DNA序列即HSE結(jié)合。 在多種應(yīng)激原的作用下，蛋白質(zhì)（特別是合成中的蛋白和正在穿膜過程中的蛋白）變性，變性蛋白與HSP70結(jié)合使HSF游離并

19、活化，HSF形成有活性的三聚體并轉(zhuǎn)位到核內(nèi)，與熱休克基因上游的熱休克元件（heat shock element，HSE）5/-n-GAA-nn-TTC-n-3高效、快速結(jié)合，增加HSP70水平。直至HSP70的水平足夠結(jié)合HSF，則使HSF活性降低，而關(guān)閉熱休克基因的表達(dá)。 活化的HSF由單體向三聚體轉(zhuǎn)換。首先，HSF的卷曲螺旋結(jié)構(gòu)打開，相鄰的七價氨基酸重復(fù)序列之間相互作用, 形成分子間的卷曲螺旋。每3個HSF單體借助于分子間的卷曲螺旋即三聚體域，而結(jié)合形成一個三聚體。 HSF單體形成三聚體后, 與HSE的親和力大大增強，有結(jié)果顯示，熱休克時HSF與HSE的結(jié)合很快增加, 5min內(nèi)可達(dá)最高峰

20、, 大約為熱休克前的 1020倍。（4）誘導(dǎo)HSP產(chǎn)生因素（Factor of induced HSP production ）【HSP具有的顯著生物學(xué)特點】 誘導(dǎo)的非特異性 存在的廣泛性 結(jié)構(gòu)的保守性Stress 在人體內(nèi), 不同種類的HSF雖然結(jié)構(gòu)上很相似, 但功能上卻存在不同程度的差異。研究表明，HSF1在應(yīng)激如熱休克刺激下調(diào)控HSP70的表達(dá)，HSF2則在生理狀態(tài)如發(fā)育和分化下，調(diào)控HSP70的表達(dá)。 HSF2對熱刺激信號耐受，而對代表生長、發(fā)育、分化的信號更為敏感。研究進(jìn)展 新發(fā)現(xiàn)的HSF4似乎能減少HSE結(jié)合位點，發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用, 其生物學(xué)意義至少在于控制應(yīng)激反應(yīng)的動態(tài)平衡。然而就

21、目前所知，HSF在各種傷害性刺激下，其主要生物學(xué)功能至少是通過調(diào)控HSP的表達(dá)來實現(xiàn)的。 （二）產(chǎn)生特異性防御反應(yīng) 各種應(yīng)激原除了能產(chǎn)生HSP之外，還能產(chǎn)生各種應(yīng)激原相對應(yīng)的各種不同的特異性蛋白，對細(xì)胞起到特異性保護(hù)作用。如：缺氧性應(yīng)激，氧化性應(yīng)激，和基因毒應(yīng)激都會產(chǎn)生特異性蛋白來保護(hù)細(xì)胞。產(chǎn)生特異性防御作用。 DNA損傷 基因毒應(yīng)激產(chǎn)生特異性防御反應(yīng) 缺氧 缺氧性應(yīng)激 活性氧、自由基 氧化性應(yīng)激 （三）對細(xì)胞增殖的影響1、促進(jìn)細(xì)胞的增殖 已經(jīng)證實多種應(yīng)激原能激活的通路，可以促進(jìn)細(xì)胞的生長，增強細(xì)胞的增殖。 如：心肌細(xì)胞由于心臟負(fù)荷過大而導(dǎo)致肥大正是由于啟動了MAPK家族的多條通路而形成的。2

22、、抑制細(xì)胞增殖 紫外線、電離輻射、活性氧、病毒感染激活JNK和P38途徑，活化P53等轉(zhuǎn)錄因子細(xì)胞增殖周期阻滯和細(xì)胞生長增殖抑制（四）誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡 多種應(yīng)激原激活JNK和P38途徑、神經(jīng)酰胺信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、P53旁路途徑抑制細(xì)胞增殖誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。一、基因毒應(yīng)激二、缺氧性應(yīng)激三、氧化應(yīng)激 四、其他熱應(yīng)激，細(xì)菌毒素引起的炎細(xì)胞反應(yīng)屬于細(xì)胞應(yīng)激 第四節(jié) 常見細(xì)胞應(yīng)激的類型與機 制（特異性應(yīng)激反應(yīng)）一、基因毒應(yīng)激 基因毒應(yīng)激（genotoxic stress）廣泛存在于從原核細(xì)胞到高等動物如人的細(xì)胞中，是由DNA損傷引起的細(xì)胞應(yīng)激。 DNA損傷即是指在生物體生命過程中DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)發(fā)生的任何改變（在復(fù)

23、制過程中發(fā)生的DNA突變）稱為（DNA damage）DNA損傷大體上可以分為兩類：單個堿基改變和結(jié)構(gòu)扭曲。突變的意義（1）突變是進(jìn)化、分化的分子基礎(chǔ) 自發(fā)突變/自然突變 （ 2）突變導(dǎo)致基因型改變 沒有可察覺的表型改變 個體之間基因型的差別稱為多態(tài)性（polymophism）（3）突變導(dǎo)致死亡（4）突變是某些疾病的發(fā)病基礎(chǔ)（）、DNA損傷的原因和類型 紫外線、 電離輻射、 病毒感染、 應(yīng)激原 化學(xué)誘變劑 1、自發(fā)性損傷（1） 復(fù)制中的損傷復(fù)制中的損傷指復(fù)制過程中堿基配對時發(fā)生的誤差再經(jīng)過DNA聚合酶“校讀”和單鏈結(jié)合蛋白等綜合因素作用下仍然存在的DNA損傷。正常情況下，大腸桿菌復(fù)制過程中的錯

24、配率為1010左右。影響復(fù)制過程諸因素中的某一環(huán)節(jié)出現(xiàn)問題，錯配率就會增高，如DNA本身功能和底物的改變，二價陽離子的改變等。（2）堿基的自發(fā)性化學(xué)改變這類損傷包括互變異構(gòu)、堿基的脫氨基作用、自發(fā)的脫嘌呤和脫嘧啶、以及細(xì)胞代謝產(chǎn)物對DNA的損傷。例如，腺嘌呤的互變異構(gòu)體（A）可以與胞嘧啶配對，模板鏈上存在這些異構(gòu)體的時候，子代鏈上就可能發(fā)生錯誤，形成損傷。細(xì)胞呼吸的副產(chǎn)物O2和H2O2都能造成DNA的氧化損傷。2、應(yīng)激原損傷DNA 在細(xì)胞的生長過程中，不僅有自發(fā)的DNA損傷產(chǎn)生，而且也不可避免地受到各種應(yīng)激原如紫外線、電離輻射、病毒感染、化學(xué)誘變劑等的作用，導(dǎo)致DNA損傷。這些應(yīng)激原損傷DNA

25、的機制如下 （ l）紫外線照射 波長分為 直接被 DNA分子吸收，使 DNA形成嘧啶二聚體，結(jié)果使其不能與嘌呤配對而致DNA損傷。UVB（290320 urnUVC（240290 urn）UVA（320400urn）主要通過其他分子產(chǎn)生活性氧間接損傷 DNA的單個堿基； 物理因素：紫外線和各種輻射（2）電離輻射 X射線B射線解離細(xì)胞內(nèi)的水活性氧和自由基與DNA共價結(jié)合DNA堿基的損傷、鏈斷裂（3）化學(xué)因素引起的DNA損傷1）烷化劑對DNA的損傷烷化劑是一類親電子的化合物，極容易與生物體內(nèi)的有機物大分子的親核位點起反應(yīng)，烷化劑與核DNA作用時，就可以將烷基加到核酸的堿基上去。DNA鏈上的磷酸二酯

26、鍵被烷化則形成不穩(wěn)定的磷酸三酯鍵，可能在糖與磷酸間發(fā)生水解作用，導(dǎo)致DNA鏈的斷裂。 化學(xué)誘變劑 烷化劑是一類有烷化作用的化學(xué)性 質(zhì)活潑、極不穩(wěn)定且易于分解的有機物分子甲基甲磺醇(MMS)、芥子氣、氮芥、環(huán)磷酰 胺其生物學(xué)特性類似于X射線，素有“化學(xué)射線”之稱。烷化劑將烷基加到DNA 堿基上的烷基化修飾是誘發(fā)基因突變的機制之一； 化學(xué)因素：常見的化學(xué)誘變劑化合物類別分子改變堿基類似物 (如：5-BU)A5-BU G羥胺類 (NH2OH)T C亞硝酸鹽 (NO2-)C U烷化劑 (如：氮芥類)G mG2） 堿基類似物對DNA的損傷堿基類似物是一類結(jié)構(gòu)與堿基相似的人工合成的化合物，它們進(jìn)入細(xì)胞以后

27、，便能替代正常的堿基而摻入到DNA鏈中，干擾了DNA的正常合成。最常見的堿基類似物是5-溴尿嘧啶（5-BU）。堿基類似物是一類結(jié)構(gòu)與堿基相似的 人工合成化合物如5溴尿嘧啶、2氨基嘌呤，由于其結(jié)構(gòu)與堿基相似，能替代正常的堿 基而干擾DNA正常合成。（4）病毒感染 病毒感染細(xì)胞后，其基因組的全部或一部分能夠整合到宿主細(xì)胞的染色體中，使宿主的基因結(jié)構(gòu)改變而導(dǎo)致基因突變。 蛋白激酶識別DNA損傷后激活P53等通路細(xì)胞周期停滯，同時啟動DNA損傷修復(fù)系統(tǒng)中某些蛋白的轉(zhuǎn)錄表達(dá)促進(jìn)損傷DNA的修復(fù)。 （二）DNA損傷激活的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和靶蛋白（二）DNA損傷激活的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和靶蛋白1DNA損傷激活的信號轉(zhuǎn)

28、導(dǎo)通路 （ 1）DNA活化的蛋白激酶（DNAPK）（2）ATM激酶 （3）聚腺苷二磷酸核糖基聚合酶（poly ADPribose polymerase，PARP）2 DNA損傷激活的其他信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路（1）NF-KB NF-kB是紫外線和電離輻射活化的一個主要轉(zhuǎn)錄因子。 （2） AP1 AP(急性反應(yīng)蛋白)主要在肝臟合成（ 1）DNA活化的蛋白激酶（DNAPK） 是位于細(xì)胞核內(nèi)的絲蘇氨酸蛋白激酶由 3個亞基組成：調(diào)節(jié)亞基2個相對分子質(zhì)量為70000 和 80000,2個亞基組成異二聚 體催化亞基相對分子質(zhì)量350000的亞基 DNAPKCS。 1 DNA損傷激活的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路 DNA雙連斷裂調(diào)節(jié)

29、亞基識別并結(jié)合與斷裂末端與催化亞基結(jié)合并激活磷酸化轉(zhuǎn)錄因子P53、c-Jun、c-fos （2）ATM激酶 ATM激酶是另一個與DNA損傷監(jiān)控有關(guān)的激酶，已知它在細(xì)胞周期檢查點的作用位于P53蛋白的上游。 ATM基因長約150 kb，若ATM激酶失活，能導(dǎo)致DNA損傷的修復(fù)機制受損，使損傷DNA不能進(jìn)行修復(fù)或修復(fù)效率下降，容易發(fā)生基因突變。如毛細(xì)血管擴張共濟失調(diào)（AT） 患者 ATM激酶就有缺陷，使 AT患者易患腫瘤。ATM激酶DNA損傷監(jiān)控（150kb)檢查點P53上游ATM激酶失活DNA損傷修復(fù)機制受損(2)ATM激酶 DNA損傷監(jiān)控有關(guān)的激酶（3）聚腺苷二磷酸核糖基聚合酶（poly AD

30、Pribose polymerase，PARP） PARP是廣泛存在于有核細(xì)胞中的DNA損傷感應(yīng)及監(jiān)測分子，在細(xì)胞損傷修復(fù)或凋亡中有重要的調(diào)控作用。 PARP與DNAPK（ DNA活化的蛋白激酶）在功能上非常相近，但PARP對DNA單、雙鏈斷裂均能識別，而 DNAPK主要識別雙鏈斷裂。DNA損傷ATM激酶DNAPKP53蛋白P53蛋白的Ser15 5磷酸化削弱P53與癌基因蛋白Mdm2蛋白的結(jié)合來延長 P53蛋白的半衰期，導(dǎo)致P53蛋白水平增加及活性增強研究發(fā)現(xiàn)阻斷P53和Mdm2蛋白的結(jié)合可提高P53的蛋白水平及增強其活性。DNA損傷誘導(dǎo)P53蛋白的C末端Lys382的乙酸化或Ser392磷

31、酸化增強DNA結(jié)合活性。P53蛋白的靶蛋白有 p21、wafl 、P53可通過P21 誘導(dǎo)細(xì)胞周期G1期阻滯，進(jìn)行損傷 DNA的修復(fù)如果 DNA的損傷無法修復(fù)，則啟動細(xì)胞凋亡。DNA損傷通過ATM激酶或DNAPK而激活抑癌基因p53的編碼產(chǎn)物P53蛋白ATM激酶或DNA-PKP53蛋白的Ser15磷酸化削弱P53與癌基因蛋白-Mdm2蛋白的結(jié)合延長P53蛋白的半衰期，P-53蛋白水平增加及活性增強P21/WAF1和GADD45P21WAFl是細(xì)胞周期的負(fù)調(diào)控蛋白之一，GADD45抑制細(xì)胞進(jìn)入S期P53可通過P21和GADD45誘導(dǎo)細(xì)胞周期G1期阻滯，進(jìn)行損傷DNA的修復(fù)；如果DNA的損傷無法修

32、復(fù)，則啟動細(xì)胞凋亡。Wild type p53 activated fragment-1Growth arrest and DNA damage DNA損傷絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族的蛋白激酶，如 ERK(細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶)、SAPKJNK和 P38，它們激活后可活化轉(zhuǎn)錄因子 NFKB、APl、ATF2、NFIL6和 CMyC等。2 DNA損傷激活的其他信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路（1）NF-KB NF-kB是紫外線和電離輻射活化的一個主要轉(zhuǎn)錄因子。 （2） AP1 AP-1由c-fos和c-Jun基因產(chǎn)物的同源和異源二聚體組成。 AP(急性反應(yīng)蛋白)主要在肝臟合成，少量在內(nèi)皮細(xì)胞和單核細(xì)胞中合

33、成 ，具有對應(yīng)激機體的保護(hù)作用，根據(jù)合成的誘導(dǎo)因子可分成I、II型。 若DNA損傷能修復(fù)則使細(xì)胞周期阻滯，進(jìn)行損傷DNA的修復(fù)。若DNA損傷嚴(yán)重而修復(fù)無望時，則誘導(dǎo)凋亡。（三）DNA損傷引發(fā)的細(xì)胞反應(yīng) l、細(xì)胞周期阻滯、 DNA 修復(fù)（1）G1期阻滯 （2） G2期阻滯 （3）DNA修復(fù) 2細(xì)胞凋亡（三）DNA損傷引發(fā)的細(xì)胞反應(yīng)細(xì)胞周期根據(jù)細(xì)胞周期不同時相的特點，可將細(xì)胞周期順序分為4個連續(xù)階段，即G1期(gap phase 1) S期(synthesis phase) G2期(gap phase 2) M期(mitotic phase)間期（Interphase）是指上一次有絲分裂的終了到本

34、次有絲分裂的開始的時間間隔。細(xì)胞周期的特點有：單向性 階段性G0期是指分裂后相對穩(wěn)定的一段時間，也稱靜止期， G0期不包括在細(xì)胞周期之內(nèi)。（一）G1期 G1期是指從上一次有絲分裂完成到本次DNA復(fù)制之前的過程，持續(xù)時間一般為612小時。 G1期細(xì)胞的主要任務(wù)是積累能量和原料，為DNA的復(fù)制做準(zhǔn)備，故又稱DNA合成前期（二）S期 S期即DNA合成期，持續(xù)時間一般為68小時。 S期DNA復(fù)制時，以復(fù)制叉的延伸方式向兩側(cè)推進(jìn)，與相鄰的復(fù)制子相遇而終止。 S期DNA的復(fù)制極其準(zhǔn)確，每一段DNA只復(fù)制一次，從而保證分裂后子細(xì)胞的遺傳物質(zhì)平均分配。 真核細(xì)胞DNA復(fù)制是多點起始、雙向復(fù)制。（三）G2期 G

35、2期是指從DNA復(fù)制完成到有絲分裂開始的時間區(qū)間，持續(xù)時間一般為34小時。只有完成了所有DNA復(fù)制后，細(xì)胞才進(jìn)入G2期，故G2期又稱DNA合成前期或絲裂前期。 在G2期RNA和蛋白質(zhì)合成活躍，有絲分裂所需的蛋白質(zhì)、微管蛋白是在G2期合成的，此外在G2期還進(jìn)行線粒體的復(fù)制。（四）M期 M期即有絲分裂期，細(xì)胞進(jìn)行分裂，一般持續(xù)時間為1小時。 在M期，RNA合成停止，蛋白質(zhì)合成減少，染色體高度螺旋化，繼之通過極其復(fù)雜的活動，細(xì)胞一分為二，一次細(xì)胞周期即告結(jié)束。l、細(xì)胞周期阻滯、 DNA 修復(fù)（1）G1期阻滯 DNA損傷（插入、缺失、錯配損傷） P53蛋白很快升高靶蛋白P21Wafl和GADD45蛋白

36、介導(dǎo)細(xì)胞周期G1期阻滯細(xì)胞不能進(jìn)人S期，為損傷DNA的修復(fù)提供足夠的時間，DNA修復(fù)好后仍可繼續(xù)進(jìn)人S期。 高水平的p21蛋白能與控制G1S細(xì)胞周期檢查點的周期蛋白依賴的蛋白激酶（CDK）結(jié)合抑制 CDK活性 p21蛋白抑制增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）活性， CDK和 PCNA都是S期起 始的必需條件(2) G2期阻滯 DNA損傷通過一系列磷酸化反應(yīng)控制G2M細(xì)胞周期檢查點的Cdc2不能被激活 G2檢查點阻滯細(xì)胞不能進(jìn)入M期。機制：是DNA損傷激活Chk1（檢查點激酶1），Chk1與 Cdc25結(jié)合使Cdc25的 Ser216磷酸化而滅活Cdc25。 Cdc25的Ser216的磷酸化通過與143

37、3（一組蛋白質(zhì)）結(jié)合而失活。 CdC25的失活使CdC2不能被激活，發(fā)生G2期阻滯。 最近的研究表明DNA損傷引起細(xì)胞G2期阻滯也必須有P53蛋白的參與。若沒有P53，則受損細(xì)胞不能發(fā)生G2期阻滯。（3）DNA修復(fù) P53蛋白在DNA的損傷修復(fù)中不僅能吸引及活化一些DNA損傷修復(fù)蛋白、促進(jìn)DNA的修復(fù)，還能激活P53R2基因而生成P53R2蛋白，通過它催化核糖核酸轉(zhuǎn)變?yōu)槊撗鹾颂呛怂醖NTPS，用于損傷DNA的修復(fù)。 p53R2基因是 Tanaka等人在人體內(nèi)分離到的一種 P53誘導(dǎo)基因，該基因與人核糖核苷酸還原酶（RNR）的R亞單位有80的相似性，故稱為P53R2基因。P53R2基因由9個外顯

38、子組成，在內(nèi)含子1上有P53蛋白的DNA結(jié)合序列，因此，P53R2基因是P53蛋白的一個直接靶基因，其轉(zhuǎn)錄活性受P53蛋白的調(diào)控。2細(xì)胞凋亡凋亡的機制包括P53依賴和非依賴的機制。 (1)P53誘導(dǎo)的凋亡 P53蛋白：抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。 野生型 P53蛋白在活性氧、電離輻射、紫外線、化學(xué)物質(zhì)等多種應(yīng)激原誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中起重要作用。 P53蛋白介導(dǎo)凋亡不需要P21的參與，機制：上調(diào)Bcl2家族的促凋亡成員Bax下調(diào)抗凋亡成員Bcl2和BclXl。Bax促進(jìn)細(xì)胞色素C(Cyt C)的釋放，通過與procaspase 9結(jié)合而最終激活死亡執(zhí)行器的 caspase3導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。Bcl2和B

39、clXl抑制CytC釋放，從而抑制凋亡。 (2) p53非依賴的凋亡 電離輻射、紫外線、熱休克等多種應(yīng)激原通過激活鞘磷脂酶而快速生成神經(jīng)酰胺，之后激活SAPK-JNK而誘導(dǎo)凋亡。 單純性缺氧作用于細(xì)胞上的氧感受器啟動細(xì)胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活作為轉(zhuǎn)錄因子的缺氧誘導(dǎo)因子-1或HIF-1a樣因子與低氧敏感基因結(jié)合后促進(jìn)基因表達(dá)產(chǎn)生紅細(xì)胞生成增多、血管增生。血管舒張以及無氧酵解增強等效應(yīng)。二缺氧性應(yīng)激（一）缺氧的識別及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路細(xì)胞周圍環(huán)境的氧濃度變化細(xì)胞表面的氧感受器。氧感受器是一種血紅素蛋白，其功能類似血紅蛋白，包括血紅蛋白、細(xì)胞色素P450及含細(xì)胞色素b558的輔酶II氧化酶）研究顯示輔酶II

40、氧化酶（NADPH氧化酶）是最可能的氧感受器。是一種膜結(jié)合蛋白，普遍存在于多種細(xì)胞中。 NADPH氧化酶可把細(xì)胞周圍環(huán)境中的O2。轉(zhuǎn)變?yōu)镠2O2。氧濃度高時，H2O2濃度升高，低氧時H202則降低。 H2O2的還原型谷胱甘肽(GSH)的濃度蛋白質(zhì)的一些巰基處于還原狀態(tài)。 在低氧的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中，Ca2+、NO和CO等可能在不同程度上發(fā)揮作用。 低氧時細(xì)胞內(nèi)Ca2+激活與鈣相關(guān)的信號通路，增強低氧敏感基因酪氨酸羥化酶(TH) 的轉(zhuǎn)錄。 低氧抑制血紅素加氧酶及NO合酶的活性NO和CO產(chǎn)生 而NO、CO抑制HIF-1的活化促進(jìn)低氧敏感基因的表達(dá)。 總之，低氧的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)不是一條通路，而是多條通路，比較

41、復(fù)雜。 1HIF-1的結(jié)構(gòu) HIF-1由相對分子質(zhì)量為120 000的亞基和相對分子質(zhì)量為9100094000的亞基組成異二聚體。(二)缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1及其 生物學(xué)效應(yīng) HIF-1是低氧誘導(dǎo)的， 誘導(dǎo)包括增加HIF-1的蛋白水平和HIF-1 DNA結(jié)合活性兩方面，且這兩方面隨氧濃度從20下降到6呈緩慢增加，隨氧濃度從6下降到零而呈指數(shù)增加HIF-1是芳香烴受體核轉(zhuǎn)位蛋白ARNT基因的產(chǎn)物，屬組成性表達(dá)不受低氧誘導(dǎo)。2HIF-1的誘導(dǎo)HIF-1蛋白通過泛素-蛋白酶體途徑降解由HIF-1的ODD（氧依賴的降解oxygen dependent degradation)結(jié)構(gòu)域來控制，對控制HIF

42、-1活性起核心作用。. 正常氧濃度時HIF-1半衰期很短1 min，而低氧時穩(wěn)定性大大提高，半衰期可長達(dá)2-3 h，就是因為低氧時通過ODD降低HIF-1泛素化而減少降解，從而增加HIF-1蛋白水平。 3HIF-1的降解 HIF-1與HIF-1結(jié)合后才能在核中穩(wěn)定存在，才能與DNA結(jié)合，所以HIF-1的DNA結(jié)合活性主要決定于HIF-l蛋白水平，HIF1的2個轉(zhuǎn)錄激活區(qū)域之間的抑制區(qū)域可降低轉(zhuǎn)錄活性，特別是在正常氧濃度時該作用更明顯。缺氧時HIF -1活性增強，不僅由于HIF-1水平升高，而且HIF-1轉(zhuǎn)錄激活區(qū)域的活性也增加。4HIF-1的活性 低氧時HIF-1蛋白水平增加、入核、二聚化，與

43、靶基因低氧反應(yīng)元件(hypoxia response element，HRE)中的HIF-1結(jié)合位點結(jié)合，促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄，引起一系列細(xì)胞對缺氧的反應(yīng)。 低氧敏感基因表達(dá)，僅有HIF-l活化還不夠，還需一系列相互作用的轉(zhuǎn)錄因子的組合。5HIF-1的生物效應(yīng)及作用機制促紅細(xì)胞生成素(EPO)基因： 低氧活化HIF-1誘導(dǎo)CBPp300入核與HIF-1、肝核因子-4(HNF4)結(jié)合形成大分子復(fù)合物信號傳遞給EPO基因的啟動子保證其高水平轉(zhuǎn)錄。這一過程可能也適用于其他低氧敏感基因。6、 HIF-1的靶基因主要包括以下幾種：促紅細(xì)胞生成素（EPO）基因；血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）基因；葡萄糖轉(zhuǎn)運子-l（

44、glucose transporter-1，GLUT-1）和糖酵解酶基因（包括醛縮酶A、烯醇化酶1、乳酸脫氫酶A、磷酸果糖激酶l、磷酸甘油酸激酶1和3一磷酸甘油醛脫氫酶的基因） 血紅素加氧酶（heme oxygenase-l，HO-1） 和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）基因。 這些基因的啟動子或增強子都有一個小于100 bp的 HRE，它由 HIF-l的結(jié)合位點和兩側(cè)的功能序列構(gòu)成。缺氧條件下，增加的HIF-1與上述低氧敏感基因結(jié)合，相應(yīng)地產(chǎn)生下列效應(yīng)：EP0增加，導(dǎo)致紅細(xì)胞增多；VEGF增多，促進(jìn)組織中血管形成，使血液到達(dá)缺氧部

45、位；GLUTI和糖酵解酶的合成增加，增強糖酵解，以滿足機體對能量的需要； iNOS合成增多使NO產(chǎn)生增多，舒張血管，增加血流量； HO-1增多，催化產(chǎn)生的CO作為信使激活鳥昔酸環(huán)化酶，提高cGMP水平，使血管平滑肌松弛，增加血流量和血管通透性，從而增加組織供氧。這些都是重要的缺氧代償方式。 HIF-l結(jié)合位點對于HRE（與靶基因低氧反應(yīng)元件）的功能是必須的，HIF-l結(jié)合位點的突變導(dǎo)致對缺氧的反應(yīng)丟失。但HIF-1只有和兩側(cè)的功能序列聯(lián)合作用，才能引起靶基因的表達(dá)增加。如缺氧使VEGF的表達(dá)量增加，短時間的缺氧(3 h)時增加 34倍，持續(xù)缺氧(15 h)增加 810倍。 HIF-l在缺氧細(xì)胞的凋亡中也起重要作用HIF-l誘導(dǎo)凋亡的機制可能是HIF-l與P53蛋白結(jié)合，增強其穩(wěn)定性，使P53蛋白增多，從而誘導(dǎo)凋亡。 HIF-l樣因子（HLF-l like factor，HLF）也可介導(dǎo)缺氧應(yīng)激反應(yīng)。 生物體的氧化應(yīng)激（oxidative stress）是由活性氧（rea