單克隆抗體制備課件

1、關(guān)于單克隆抗體制備第1頁，共30頁，2022年，5月20日，2點2分，星期四免疫血清和單克隆抗體的制備第2頁，共30頁，2022年，5月20日，2點2分，星期四一、免疫血清的制備1. 原理： 機體具有多種B細(xì)胞克隆，將適當(dāng)?shù)目乖镔|(zhì)注入人或動物體內(nèi)后可被不同的B細(xì)胞克隆同時識別，經(jīng)過一定時間，受刺激的B細(xì)胞克隆針對抗原表位的多少而產(chǎn)生相應(yīng)的特異性抗體，每一抗原表位都能誘發(fā)相應(yīng)B細(xì)胞克隆產(chǎn)生單克隆抗體，此獲得的血清即為含多種單克隆抗體的混合物，稱之為多克隆抗體免疫血清，簡稱免疫血清。 優(yōu)質(zhì)免疫血清的產(chǎn)生，主要取決于抗原的純度和免疫原性，以及動物的免疫應(yīng)答能力。此外，尚需考慮免疫途徑、抗原劑量、注

2、射次數(shù)、時間間隔和有無佐劑等因素。第3頁，共30頁，2022年，5月20日，2點2分，星期四免疫原1.抗原種類 微生物抗原、組織抗原和免疫球蛋白抗原。2. 抗原純度 一般的抗原只要達(dá)到親合層析或SDSPAGE電 泳純即可。3. 抗原用量 在一定范圍內(nèi)與免疫應(yīng)答強度呈正相關(guān)。在應(yīng) 用完全弗氏佐劑時，蛋白質(zhì)類抗原劑量以0.5 1mg/kg體重為宜，加強免疫約為基礎(chǔ)劑量的 1/21/3。第4頁，共30頁，2022年，5月20日，2點2分，星期四4. 抗原的處理1）顆粒性抗原：紅細(xì)胞、菌體等制成懸液，不需佐 劑，直接免疫。菌體數(shù)11010個/ml 為宜。2）可溶性蛋白質(zhì)抗原（如人IgG）、病毒抗原、細(xì)

3、菌 可溶性抗原組分等，可以直接與弗氏完全佐劑 （1：1 V/V）混合、乳化。3）半抗原（多糖、多肽、激素、化學(xué)藥品）需與載 體偶聯(lián)。常用載體有牛血清白蛋白（BSA）、鑰 孔嘁血藍(lán)素(KLH)、雞血清蛋白（OA）；偶聯(lián)劑 有過碘酸鈉、戊二醛和碳化二亞胺等。KLH是最 常用的載體蛋白，碳化二亞胺是最常用的偶聯(lián) 劑。第5頁，共30頁，2022年，5月20日，2點2分，星期四佐 劑1. 概念 佐劑屬非特異性免疫增強劑，與抗原一起注射或預(yù)先注入機體時，可增強機體免疫應(yīng)答或改變免疫應(yīng)答的類型。2. 種類 1）卡介苗（BCG）、短小棒狀桿菌（CP）、脂 多糖（LPS）、細(xì)胞因子； 2）氫氧化鋁、明礬； 3）

4、雙鏈多聚肌苷酸：胞苷酸（poly I：C）和雙 鏈多聚腺苷酸：鳥苷酸（poly A：U）； 4）礦物油、脂質(zhì)體、免疫刺激復(fù)合物 （ISCOMs）、CPG寡核苷酸。第6頁，共30頁，2022年，5月20日，2點2分，星期四3. 弗氏完全佐劑 1）成分：羊毛脂、液體石蠟和滅活卡介苗。 2）配方：羊毛脂：液體石蠟 為1：2，也可1：1。 滅活卡介苗（2 20mg/ml）。4. 弗氏不完全佐劑，成分不含卡介苗，其他同弗氏佐 劑。5. 用法：佐劑與抗原等量混合，充分乳化。第7頁，共30頁，2022年，5月20日，2點2分，星期四動 物 選 擇對免疫動物的主要要求有：1. 應(yīng)選擇與抗原物質(zhì)親緣關(guān)系遠(yuǎn)的動物

5、，特別是在制 備抗免疫球蛋白血清時更要注意?？乖镔|(zhì)的來源 生物與被免疫動物親緣關(guān)系越遠(yuǎn)，免疫應(yīng)答能力越 強，抗體產(chǎn)生水平越高，抗體親和力也越強。2. 動物生理狀態(tài)正常，發(fā)育成熟，體重符合規(guī)定。家 兔初始免疫體重通常在22.5kg。3. 性別上以雄性成年動物較常用，也可采用雌性非妊 娠動物。不能應(yīng)用患病或剛剛病愈、有免疫缺陷或 應(yīng)用免疫抑制劑的動物。第8頁，共30頁，2022年，5月20日，2點2分，星期四免疫方法1. 免疫途徑 1）注射方法：靜脈、腹腔、肌肉、皮下、皮內(nèi)和 淋巴結(jié)等。 2）免疫方法：小劑量、多點、多途徑方法。 3）顆粒性抗原（細(xì)菌懸液、紅細(xì)胞懸液）采用小 鼠腹腔注射。 4）可

6、溶性抗原（如IgG）采用弗氏完全佐劑的乳 劑（油包水型），家兔背部多點皮下注射法。第9頁，共30頁，2022年，5月20日，2點2分，星期四2. 可溶性抗原免疫 1）方法：基礎(chǔ)免疫（初次免疫）后三周左右，進行 加強免疫，以后每隔2周加強免疫一次。 2）加強免疫次數(shù)取決于試血結(jié)果。家兔耳緣靜脈、 小鼠眶靜脈少量采血，分離血清，免疫雙擴實驗 測定血清效價1：32或ELISA法測定抗體效價 1：10 000，表明抗體效價較高，可采兔頸動脈 或心臟全部血液，分離血清。 4）如抗體效價較低，繼續(xù)加強免疫，一般需45 次。若仍不能達(dá)到抗體效價要求，應(yīng)考慮重新免 疫。 3. 顆粒性抗原免疫 第一周注射2次，

7、隨后每周加強免疫1次，45天 試血。第10頁，共30頁，2022年，5月20日，2點2分，星期四3. 操作程序 1）健康雄性家兔體重2.5 3 kg，背部皮下多點注射。2）基礎(chǔ)免疫：抗原完全佐劑 (抗原劑量4mg/只) 2ml (1:1V/V) 吸入兩支注射器內(nèi)，三通連接， 反復(fù)推拉混合至乳化懸液。3）加強免疫：抗原不完全佐劑 (抗原劑量2.5mg/只)， 間隔710天加強一次。約23次。4）試 血：末次注射后第7天取少量靜脈血，免疫雙 擴試驗血清檢測，抗血清效價1：32（或 ELISA法檢測抗體效價1：10，000）時頸 動脈放血，分離血清，分裝，保存。第11頁，共30頁，2022年，5月2

8、0日，2點2分，星期四二 單克隆抗體的制備 1975年 Kohler和Milstein發(fā)現(xiàn)將小鼠骨髓瘤細(xì)胞與和綿羊紅細(xì)胞免疫的小鼠脾細(xì)胞進行融合，形成的雜交瘤細(xì)胞既可產(chǎn)生抗體，又可無性繁殖，從而創(chuàng)立了單克隆抗體雜交瘤技術(shù)，這項技術(shù)上的突破使血清學(xué)的研究進入了一個高度準(zhǔn)確的新紀(jì)元。第12頁，共30頁，2022年，5月20日，2點2分，星期四 1. 原理 根據(jù)致敏的單一B細(xì)胞克隆具有分泌特異性抗體和骨髓瘤細(xì)胞在體外長期增殖的特性，采用細(xì)胞融合技術(shù)在體外可將上述兩種細(xì)胞融合形成雜交瘤細(xì)胞。雜交瘤細(xì)胞因具備了B細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞的雙重特性，即可分泌抗體，又能在HAT培養(yǎng)基中長期存活。因此，可通過HAT選

9、擇性培養(yǎng)，篩選出克隆化目的雜交瘤細(xì)胞株，再利用雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清或雜交瘤細(xì)胞接種小鼠產(chǎn)生的腹水，獲取大量的來源于雜交瘤細(xì)胞分泌的單克隆抗體（monoclonal antibody, mAb）。 第13頁，共30頁，2022年，5月20日，2點2分，星期四 2. 試劑與器材（1）細(xì)胞融合劑：聚乙二醇（PEG）（2）0.2mol/L L-谷氨酰胺貯存液（3）200雙抗（青、鏈霉素）溶液（4）RPMI-1640培養(yǎng)液（5）15%胎牛血清RPMI-1640培養(yǎng)液（6）100氨基蝶呤（A）貯存液（7）100次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷貯存液（8）1 HAT培養(yǎng)液（9）1HT培養(yǎng)液（10）100 8-雜氮鳥嘌呤

10、貯存液第14頁，共30頁，2022年，5月20日，2點2分，星期四（11）細(xì)胞凍存液：90ml含30%FCS的RPMI-1640培養(yǎng) 液+10ml DMSO （12）0.2M pH 7.4 磷酸鹽緩沖液（13）主要儀器設(shè)備：CO2培養(yǎng)箱、超凈工作臺、倒置 顯微鏡、精密天平、低溫和普通冰箱、液氮罐、 離心機、高壓滅菌器、烤箱、水浴鍋、除菌濾 器、酶聯(lián)免疫測定儀等。（14）常規(guī)實驗器材：血細(xì)胞記數(shù)板、各種吸管、離心 管、細(xì)胞培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、24孔和96孔培養(yǎng)板、 細(xì)胞凍存管、注射器、微量移液器等。（15）抗體純化器材與試劑。（16）小鼠實驗器材：手術(shù)剪刀、鑷子等解剖器材。（17）骨髓瘤細(xì)胞：小鼠骨

11、髓瘤細(xì)胞系SP2/0或NS-1。第15頁，共30頁，2022年，5月20日，2點2分，星期四3. 實驗流程（1）實驗動物免疫：BALB/c小鼠，雌性，68W。 常規(guī)免疫方案：0、15、30天，72 h后制備脾細(xì) 胞懸液。基礎(chǔ)免疫：10100g抗原 (可溶性抗原)完全佐劑 0.2ml (1:1V/V) ，背部皮下多點注射。加強免疫：同量抗原不完全佐劑，間隔710天一 次。約23次，皮下或腹腔注射。 試 血：取靜脈血，ELISA法檢測血清中抗體滴度， 當(dāng)效價達(dá)到 1：400以上時，進行加強免疫。 弱免疫原免疫方案：0天、30天、45天、60天、75天。第16頁，共30頁，2022年，5月20日，2

12、點2分，星期四（2）免疫動物脾細(xì)胞懸液的制備 ： 將末次免疫后3天BALB/c小鼠處死，消毒，無菌取出脾臟，置入無菌PBS或培養(yǎng)液中。在100目的鋼網(wǎng)上研磨脾臟。收集細(xì)胞于50ml離心管中，1500rpm離心5分，去上清。加入10ml PBS用吸管輕微混勻，1500rpm離心5分，去上清，用10ml RPMI培養(yǎng)液懸浮。 細(xì)胞計數(shù)（細(xì)胞數(shù)/ml=N/4 104 稀釋倍數(shù)） 用1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度至1108 /ml 第17頁，共30頁，2022年，5月20日，2點2分，星期四（3）飼養(yǎng)細(xì)胞制備 在組織培養(yǎng)中，單個或少數(shù)分散的細(xì)胞不易生長繁殖，若加入其他活細(xì)胞則可促進這些細(xì)胞生長繁殖，所加入

13、的細(xì)胞稱飼養(yǎng)細(xì)胞。常用的是小鼠腹腔巨噬細(xì)胞。 將正常BALB/c小鼠腹部消毒后，注射預(yù)冷的無血清培養(yǎng)液5ml，輕揉腹部數(shù)次，于腹部左下處剪開腹膜，吸取細(xì)胞懸液，反復(fù)23次，用培養(yǎng)液離心洗滌2次。用15%FCS-RPMI-1640調(diào)細(xì)胞濃度為2105/ml，將細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，100l/孔。 第18頁，共30頁，2022年，5月20日，2點2分，星期四（4）骨髓瘤細(xì)胞的準(zhǔn)備 復(fù)蘇骨髓瘤細(xì)胞用10FCS-RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)1周，23天換液一次，依細(xì)胞生長情況34天傳代一次，適宜密度3105/ml。融合之前3天，每天換一半培養(yǎng)液，使細(xì)胞保持在對數(shù)生長期。取對數(shù)生長骨髓瘤細(xì)胞離心，用無

14、血清培養(yǎng)液洗2次，調(diào)細(xì)胞濃度為12 107 / ml備用。 第19頁，共30頁，2022年，5月20日，2點2分，星期四（5）細(xì)胞融合1）將骨髓瘤細(xì)胞與脾臟細(xì)胞按1：10或1：5的比例混 合，在50ml離心管中用無血清培養(yǎng)液洗1次，離心 棄上清； 2）1min內(nèi)加入37預(yù)溫的1ml 50PEG溶液，邊加邊 搖37水浴1min； 3）加37預(yù)溫的不完全培養(yǎng)液以終止PEG作用，每隔 2min分別加入1ml、2ml、3ml、4ml、5ml和6ml； 4）離心，棄上清，用含20小牛血清HAT選擇培養(yǎng)液 重懸； 5）將上述細(xì)胞加入已有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔培養(yǎng)板內(nèi)， 每孔100 l ，放入37 5CO2培養(yǎng)箱

15、培養(yǎng)。 第20頁，共30頁，2022年，5月20日，2點2分，星期四（6）融合細(xì)胞觀察、換液及雜交瘤抗體檢測 細(xì)胞培養(yǎng)3天后，使用HAT培養(yǎng)液換液；3天后，再次使用HAT培養(yǎng)液換液。 當(dāng)細(xì)胞克隆集落大于3mm時，利用間接ELISA法篩選分泌單克隆抗體的陽性雜交瘤細(xì)胞克隆。第21頁，共30頁，2022年，5月20日，2點2分，星期四（7）雜交瘤細(xì)胞克隆化 將分泌單克隆抗體陽性的雜交瘤細(xì)胞克隆按有限稀釋法稀釋細(xì)胞（用HAT培養(yǎng)液稀釋細(xì)胞），于96孔培養(yǎng)板中加入0.1ml/孔，培養(yǎng)2周，利用間接ELISA法挑選單個陽性雜交瘤細(xì)胞克隆孔并再次進行亞克隆，直至亞克隆時全部克隆孔細(xì)胞培養(yǎng)上清中抗體檢出陽性

16、率為100%為止。第22頁，共30頁，2022年，5月20日，2點2分，星期四（8）雜交瘤細(xì)胞凍存與復(fù)蘇 將陽性細(xì)胞克隆在培養(yǎng)板或培養(yǎng)瓶中擴大培養(yǎng)，收集細(xì)胞，離心1000轉(zhuǎn)、5分，棄上清，加入細(xì)胞凍存液，移至凍存管，-70冰箱過夜，然后液氮長期保存。 將凍存管從液氮中取出，立即放入37水浴中，使之迅速融化。用培養(yǎng)液洗滌1次后，加入培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。第23頁，共30頁，2022年，5月20日，2點2分，星期四（9）單克隆抗體的大量制備 BALB/c雌性小鼠接種雜交瘤細(xì)胞前12周，腹腔注射降植烷預(yù)處理。用無血清培養(yǎng)液洗滌雜交瘤細(xì)胞23次，調(diào)細(xì)胞濃度12106/ml，每只小鼠腹腔注射0.51ml細(xì)胞懸

17、液。待小鼠腹部明顯膨大時，收集腹水，離心，收集上清，分裝，-80保存。第24頁，共30頁，2022年，5月20日，2點2分，星期四（10）單克隆抗體純化鹽析法 腹水10ml等量生理鹽水混勻，在電磁攪拌下逐滴緩慢加入飽和硫酸胺20ml，4放置0.5h以上或過夜。離心（3000rpm）30min，棄上清。沉淀加生理鹽水20ml溶解后，再次加入飽和硫酸胺10 ml，4放置0.5h或過夜。離心（3000rpm）30min，棄上清。沉淀加盡量少生理鹽水溶解，裝入透析袋中，用流動自來水透析40min，再用生理鹽水透析24h，中間換液34次，檢測無NH4離子存在即可。-20備用。第25頁，共30頁，2022

18、年，5月20日，2點2分，星期四凝膠柱層析 實驗原理： 凝膠本身是多孔的分子篩，在交聯(lián)劑作用下形成三維空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，蛋白質(zhì)溶液流經(jīng)凝膠柱時，根據(jù)蛋白質(zhì)分子量的大小不同，由大到小洗脫而進行分離。（大分子蛋白質(zhì)不能進入凝膠粒內(nèi)部，在膠粒間隙隨洗脫液最先流出。而小分子蛋白質(zhì)進入膠粒內(nèi)部洗脫較慢。） 關(guān)鍵點：1. 裝柱切忌有氣泡和斷層，有斷層要重裝柱；2. 加樣時緩沖液面恰好在濾紙片上，及時加樣避免柱 干涸，干涸凝膠不能繼續(xù)使用；3. 因操作時間長，宜在4操作，防止影響免疫球蛋白 活性。第26頁，共30頁，2022年，5月20日，2點2分，星期四（11）單克隆抗體免疫學(xué)性質(zhì)檢定 1）單克隆抗體特異性測定； 2）單克隆抗體亞類測定； 3）單克隆抗體效價測定； 4）親