實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤學(xué)基本概念培訓(xùn)課件

1、實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤學(xué)基本概念實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤學(xué)基本概念腫瘤發(fā)生發(fā)展的一般過(guò)程正常細(xì)胞 癌細(xì)胞 原位癌 浸潤(rùn)癌 轉(zhuǎn)移癌 休 眠 預(yù)防 診斷 治療實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤學(xué)基本概念2腫瘤發(fā)生發(fā)展的一般過(guò)程正常細(xì)胞 癌細(xì)胞 原位癌 腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)特點(diǎn)自我滿足的生長(zhǎng)信號(hào) 對(duì)生長(zhǎng)抑制信號(hào)不敏感 逃避凋亡 無(wú)限增殖的潛能 血管生成 浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤學(xué)基本概念3腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)特點(diǎn)自我滿足的生長(zhǎng)信號(hào)實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤學(xué)基本概念3實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤模型的要求忠實(shí)地重現(xiàn)人類腫瘤的生物學(xué)特性實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤學(xué)基本概念4實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤模型的要求忠實(shí)地重現(xiàn)人類腫瘤的生物學(xué)特性實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤學(xué)基實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤學(xué)的研究方法實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤學(xué)基本概念5實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤學(xué)的研究方法實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤學(xué)基本概念5直接研究建立細(xì)

2、胞系建立動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤學(xué)基本概念6直接研究實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤學(xué)基本概念6細(xì)胞系的基本概念組織培養(yǎng)和細(xì)胞培養(yǎng)：模擬體內(nèi)環(huán)境在體外培養(yǎng)機(jī)體組織和細(xì)胞，使之生存和生長(zhǎng)。原代培養(yǎng)（primary culture）:從體內(nèi)取出組織和細(xì)胞的第一次培養(yǎng)。傳代（passage）：細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶后，細(xì)胞分成2-3瓶繼續(xù)培養(yǎng)。細(xì)胞系（cell line）:原代培養(yǎng)細(xì)胞首次傳代成功后的細(xì)胞，稱細(xì)胞系。Finite cell line, continuous cell line, established cell line細(xì)胞株(cell strain):通過(guò)選擇或克隆，從親代細(xì)胞系選出的帶有特定標(biāo)志的細(xì)胞群。瘤株：在動(dòng)物體

3、內(nèi)可傳代的腫瘤細(xì)胞系。ATCC American Type Culture Collection 美國(guó)模式培養(yǎng)物收集中心, 美國(guó)菌種保存中心實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤學(xué)基本概念7細(xì)胞系的基本概念組織培養(yǎng)和細(xì)胞培養(yǎng)：模擬體內(nèi)環(huán)境在體外培養(yǎng)機(jī)培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)方式貼附生長(zhǎng)型細(xì)胞：細(xì)胞附著于支持物表面生長(zhǎng)。 上皮細(xì)胞型：來(lái)源于外胚層和內(nèi)胚層的細(xì)胞，細(xì)胞為扁平多角形，細(xì)胞之間緊密相靠成片。 成纖維細(xì)胞型：來(lái)源于中胚層的細(xì)胞，細(xì)胞呈梭形，排列成漩狀、放射狀、柵欄狀。懸浮生長(zhǎng)型：造血系統(tǒng)的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤學(xué)基本概念8培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)方式貼附生長(zhǎng)型細(xì)胞：細(xì)胞附著于支持物表面生長(zhǎng)。培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)特點(diǎn)貼附生長(zhǎng)：支持物可為玻璃、塑料、膠原、

4、其他細(xì)胞等。 停泊或貼壁依賴性細(xì)胞（anchorage-dependent cell)接觸抑制(contact inhibition)：正常細(xì)胞相互接觸后，細(xì)胞將向另一個(gè)方向移動(dòng)，從而使細(xì)胞不會(huì)重疊生長(zhǎng)。密度抑制(density inhibition)：正常細(xì)胞匯合成片后細(xì)胞分裂停止，在靜止?fàn)顟B(tài)下細(xì)胞存活一段時(shí)間 匯合 confluent實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤學(xué)基本概念9培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)特點(diǎn)貼附生長(zhǎng)：支持物可為玻璃、塑料、膠原、其他培養(yǎng)條件基本營(yíng)養(yǎng)成分 RPMI1640 DMEM (Dulbeccos modified Eagle medium) 谷氨酰胺生長(zhǎng)因子 小牛血清 胎牛血清 滅活補(bǔ)體 56 30mi

5、n 環(huán)境 37 pH 7.2-7.4 滲透壓 無(wú)污染無(wú)毒 細(xì)菌、支原體 實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤學(xué)基本概念10培養(yǎng)條件基本營(yíng)養(yǎng)成分 RPMI1640 DMEM (Du體外培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：1.活細(xì)胞， 2.對(duì)象均勻，易控制實(shí)驗(yàn)條件，易于觀察和紀(jì)錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果 3.易研究單個(gè)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能，易于進(jìn)行分子生物學(xué)水平研究， 4.實(shí)驗(yàn)周期短，成本低，細(xì)胞系可長(zhǎng)期保存。實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤學(xué)基本概念11體外培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：1.活細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤學(xué)基本概念11體外培養(yǎng)的缺點(diǎn) 1.在體外細(xì)胞生物學(xué)行為與在體內(nèi)不完全一樣， G1 G0 終末分化腫瘤細(xì)胞 M S介質(zhì)細(xì)胞 G2實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤學(xué)基本概念12體外培養(yǎng)的缺點(diǎn) 1.在體外細(xì)胞生物學(xué)行為與在體內(nèi)

6、不完全一樣，2.轉(zhuǎn)化（transformation）: 在體外培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)胞的遺傳性狀發(fā)生變化。分為一般轉(zhuǎn)化和惡性轉(zhuǎn)化。 一般轉(zhuǎn)化：指細(xì)胞獲得不死性。 惡性轉(zhuǎn)化：指出現(xiàn)在軟瓊脂培養(yǎng)基中浸 潤(rùn)生長(zhǎng)；在動(dòng)物體內(nèi)成瘤；血清依賴性降低；生長(zhǎng)密度依賴性降低。3. 體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果不能外推到體內(nèi)實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤學(xué)基本概念132.轉(zhuǎn)化（transformation）: 在體外培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)胞培養(yǎng)的應(yīng)用研究細(xì)胞與環(huán)境的相互作用細(xì)胞間的相互作用細(xì)胞內(nèi)胞質(zhì)活動(dòng)細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核之間的流動(dòng)實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤學(xué)基本概念14細(xì)胞培養(yǎng)的應(yīng)用研究細(xì)胞與環(huán)境的相互作用實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤學(xué)基本概念14建立細(xì)胞系的基本要求細(xì)胞在體外培養(yǎng)半年以上，生長(zhǎng)穩(wěn)定，保持細(xì)

7、胞特征并能傳代。實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤學(xué)基本概念15建立細(xì)胞系的基本要求細(xì)胞在體外培養(yǎng)半年以上，生長(zhǎng)穩(wěn)定，保持細(xì)建系方法1.原代培養(yǎng)：無(wú)菌操作， 取腫瘤組織，切成小片，小于0.5毫米，進(jìn)行培養(yǎng)， 或用胰酶、膠原酶消化成單細(xì)胞懸液，血清滅活酶，培養(yǎng)2.傳代：待細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶，胰酶消化，按1：2-3傳代3.去除雜細(xì)胞4.凍存細(xì)胞 10%DMFO+90%胎牛血清， 4 30min, -20 2hrs, -70 過(guò)夜, 液氮，長(zhǎng)期保存。登記，定期復(fù)蘇細(xì)胞。復(fù)蘇：37 水浴，加培養(yǎng)基洗一次，培養(yǎng) 5.鑒定實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤學(xué)基本概念16建系方法1.原代培養(yǎng)：無(wú)菌操作， 取腫瘤組織，切成小片，小于鑒 定細(xì)胞形態(tài)觀察 癌細(xì)胞多角型

8、，重疊生長(zhǎng)， 核漿比例失調(diào)，多核巨細(xì)胞染色體分析 數(shù)量和核型、核帶，標(biāo)記染色體細(xì)胞生長(zhǎng)曲線和細(xì)胞周期集落形成率動(dòng)物接種 成瘤， 組織形態(tài)學(xué)與原發(fā)腫瘤相似污染 無(wú)病毒、支原體污染、細(xì)胞間交叉污染 Hela cell: 1951年 Henrietta Lack 宮頸癌 實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤學(xué)基本概念17鑒 定細(xì)胞形態(tài)觀察 癌細(xì)胞多實(shí)驗(yàn)動(dòng)物基礎(chǔ)知識(shí)實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤學(xué)基本概念18實(shí)驗(yàn)動(dòng)物基礎(chǔ)知識(shí)實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤學(xué)基本概念18法 規(guī)1988年 中華人民共和國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例1989年 醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理實(shí)施細(xì)則1994年 關(guān)于在全國(guó)醫(yī)療衛(wèi)生系統(tǒng)實(shí)行實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證制度得通知 （醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證書，醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物環(huán)境設(shè)施合格證書，醫(yī)學(xué)實(shí)

9、驗(yàn)動(dòng)物全價(jià)營(yíng)養(yǎng)飼料合格證書，醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼料生產(chǎn)條件合格證書）1988年 廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理辦法實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤學(xué)基本概念19法 規(guī)1988年 中華人民共和國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例基本概念 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物（laboratory animal）:指人工培育的、對(duì)其攜帶微生物實(shí)行控制、來(lái)源清楚、遺傳背景清晰、可用于科學(xué)實(shí)驗(yàn)得動(dòng)物。 實(shí)驗(yàn)用動(dòng)物（animal for research）:能用于科學(xué)實(shí)驗(yàn)的動(dòng)物，包括實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、野生動(dòng)物、經(jīng)濟(jì)動(dòng)物和觀賞動(dòng)物。 標(biāo)準(zhǔn)化實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：有明確的遺傳背景、繁殖方法、飼養(yǎng)環(huán)境、飼料成分均達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。在科學(xué)研究中必須使用標(biāo)準(zhǔn)化實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤學(xué)基本概念20基本概念 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物（lab

10、oratory animal實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的分類(遺傳背景)近交系（純系）：連續(xù)20代以上兄妹交配或親子交配 而獲得的遺傳上達(dá)到一致的動(dòng)物群。如BLAB/c小鼠。雜交群: 兩個(gè)近交系動(dòng)物間有計(jì)劃進(jìn)行交配獲得的第一代動(dòng)物。封閉群：由同一血緣品系進(jìn)行自由交配，在固定場(chǎng)所保存繁殖5年以上得動(dòng)物群，如Wistar 大鼠、SD大鼠。突變系：正常染色體基因突變導(dǎo)致遺傳缺陷的動(dòng)物，如裸鼠實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤學(xué)基本概念21實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的分類(遺傳背景)近交系（純系）：連續(xù)20代以上兄妹按微生物控制分類一級(jí)：普通動(dòng)物，不攜帶人畜共患疾病病原體的動(dòng)物。二級(jí)：清潔動(dòng)物，不攜帶人畜共患疾病病原體和動(dòng)物傳染病病原體的動(dòng)物。三級(jí)：無(wú)特定病原體

11、的動(dòng)物（specific pathogen free,SPF）, 動(dòng)物體內(nèi)不存在特定病原微生物和寄生蟲的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。四級(jí)：無(wú)菌動(dòng)物，不存在微生物和寄生蟲的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。 一級(jí)動(dòng)物只能用于教學(xué)和某些研究的預(yù)實(shí)驗(yàn)，衛(wèi)生部以上課題和研究生課題必須使用二級(jí)以上動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤學(xué)基本概念22按微生物控制分類一級(jí)：普通動(dòng)物，不攜帶人畜共患疾病病原體的動(dòng)免疫缺陷動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤學(xué)基本概念23免疫缺陷動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤學(xué)基本概念23裸小鼠（ nude mice）1962年英國(guó)發(fā)現(xiàn)。鼠11號(hào)染色體裸基因nu是隱性突變基因。裸基因純合子（nu/nu）鼠的特征:1. 全身無(wú)毛，裸體外表。2. 胸腺上皮細(xì)胞不能增殖，T細(xì)胞發(fā)育受阻，T細(xì)

12、胞免疫缺陷。3.B 細(xì)胞形態(tài)正常，功能較差，免疫球蛋白以 Ig M 為主，少量Ig G ，類似于人原發(fā)細(xì)胞免疫缺陷。 隨著鼠齡增加， T細(xì)胞增加，移植實(shí)驗(yàn)一般用4-8周鼠。4. 裸小鼠抵抗力差，易患病毒性肝炎和肺炎，應(yīng)飼養(yǎng)在SPF 環(huán)境。5. 純合型雌鼠不能生育，/nu/+和/nu/nu交配可獲 1/2 純合子鼠。 常用BALB/c nu/nu, Swiss nu/nu, NC nu/nu 。實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤學(xué)基本概念24裸小鼠（ nude mice）1962年英國(guó)發(fā)現(xiàn)。鼠11號(hào)染應(yīng) 用建立人腫瘤的裸鼠移植瘤模型 研究致癌機(jī)理：1在裸鼠體內(nèi)誘發(fā)人類腫瘤：EBV 2生物因素的致瘤性：多瘤病毒只在新生鼠或

13、幼鼠誘發(fā)腫瘤，而在成年裸鼠也可在遠(yuǎn)離注射部位誘發(fā)腫瘤，在雌鼠為乳腺癌，雄鼠為骨肉瘤。實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤學(xué)基本概念25應(yīng) 用建立人腫瘤的裸鼠移植瘤模型 裸大鼠(nude rat)1953年蘇格蘭在遠(yuǎn)交系hooded大鼠中發(fā)現(xiàn)，因飼養(yǎng)不當(dāng)而絕種。1975年重新發(fā)現(xiàn)純合子大鼠。純合子 rnu/rnu 鼠無(wú)胸腺，缺乏功能性T細(xì)胞，抵抗力低下。實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤學(xué)基本概念26裸大鼠(nude rat)1953年蘇格蘭在遠(yuǎn)交系hoode嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷鼠 (severe combined immune deficiency mice, SCID)1982年美國(guó)發(fā)現(xiàn)于C.B-17/ICR品系。Scid位于16號(hào)染色體，是隱性突

14、變基因。純合子scid/scid T細(xì)胞和B細(xì)胞功能缺陷，血清中無(wú)免疫球蛋白，外周血淋巴細(xì)胞數(shù)量明顯減少。NK 細(xì)胞功能正常。接受單克隆抗體雜交瘤移植后易形成腹水瘤，可獲得高純度的單克隆抗體。SCID 鼠被毛發(fā)正常，雌雄可生育。實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤學(xué)基本概念27嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷鼠 (severe combined imm動(dòng)物腫瘤模型實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤學(xué)基本概念28動(dòng)物腫瘤模型實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤學(xué)基本概念28自發(fā)腫瘤：動(dòng)物自然發(fā)生的腫瘤，發(fā)病過(guò)程與人類腫瘤相似，但發(fā)病時(shí)間早晚不一，不易在短期內(nèi)得到實(shí)驗(yàn)結(jié)果。實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤學(xué)基本概念29自發(fā)腫瘤：動(dòng)物自然發(fā)生的腫瘤，發(fā)病過(guò)程與人類腫瘤相似，但發(fā)病誘發(fā)腫瘤：用化學(xué)、物理、生物等因素在動(dòng)物

15、體內(nèi)誘發(fā)的腫瘤。物理、生物因素誘發(fā)腫瘤的潛伏期長(zhǎng)，發(fā)生率不穩(wěn)定，常用化學(xué)因子誘發(fā)腫瘤。常用于腫瘤病因、化學(xué)預(yù)防的研究實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤學(xué)基本概念30誘發(fā)腫瘤：用化學(xué)、物理、生物等因素在動(dòng)物體內(nèi)誘發(fā)的腫瘤。物理誘發(fā)腫瘤模型的基本要求簡(jiǎn)單易行、易重復(fù)選擇對(duì)特定致癌物敏感的動(dòng)物種系： 多環(huán)方香烴-皮膚/小鼠； 甲基卞肼亞硝胺-食道癌/大鼠； 甲基氨基偶氮苯-肝癌/大鼠恰當(dāng)?shù)闹掳┪飫┝浚?動(dòng)物存活率高，誘發(fā)周期短。誘發(fā)的腫瘤類似于人類腫瘤實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤學(xué)基本概念31誘發(fā)腫瘤模型的基本要求簡(jiǎn)單易行、易重復(fù)實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤學(xué)基本概念31原位誘發(fā)：如：0.25二已基亞硝胺 0.251 ml 灌胃6月， 70發(fā)生肝癌異位誘發(fā)：將與致

16、癌物作用過(guò)的器官或組織移植于自體或同系、同基因正常動(dòng)物皮下，誘發(fā)所需的腫瘤。如：甲基膽蒽穿線法穿入幼鼠子宮頸，將子宮頸切除，移植于同系成年小鼠皮下，3個(gè)月后誘發(fā)異位子宮頸癌實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤學(xué)基本概念32原位誘發(fā)：如：0.25二已基亞硝胺 0.251 ml 灌可移植性腫瘤 腫瘤組織在同種或異種動(dòng)物體內(nèi)傳代后獲得的生物學(xué)特性學(xué)相對(duì)穩(wěn)定的腫瘤。實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤學(xué)基本概念33可移植性腫瘤 腫瘤組織在同種或異種動(dòng)物體內(nèi)傳代后獲得的生實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤學(xué)基本概念培訓(xùn)課件移植部位原位移植（orthotopic implantation）異位移植(ectopic implantation) 皮下、腎包膜下、腹腔實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤學(xué)基本概念35移

17、植部位原位移植（orthotopic implantati可移植性腫瘤的參考標(biāo)準(zhǔn)傳15-20代以上接種成活率100%，自發(fā)消消退率2年)的狀態(tài),此時(shí)腫瘤細(xì)胞處于G0期或增殖和凋亡相平衡。微小轉(zhuǎn)移灶（micro-metastasis）:在原發(fā)灶以外用常規(guī)臨床檢查方法不能發(fā)現(xiàn)的腫瘤病灶微小殘留灶：治療后在原發(fā)灶遺留的小量腫瘤細(xì)胞實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤學(xué)基本概念41腫瘤休眠（tumor dormancy）腫瘤細(xì)胞在機(jī)體內(nèi)持續(xù)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物腫瘤模型理論基礎(chǔ)：1 腫瘤是癌基因突變/抑癌基因失活的結(jié)果 2 基因功能在進(jìn)化中是保守的 實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤學(xué)基本概念42轉(zhuǎn)基因動(dòng)物腫瘤模型理論基礎(chǔ)：1 腫瘤是癌基因突變/抑癌基因失轉(zhuǎn)基因動(dòng)物

18、外源基因在動(dòng)物染色體穩(wěn)定整合并遺傳給后代的動(dòng)物。用途：生物醫(yī)藥 基因表達(dá)調(diào)控 單基因表達(dá)調(diào)控 多基因表達(dá)調(diào)控 基因敲除（knock out)實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤學(xué)基本概念43轉(zhuǎn)基因動(dòng)物外源基因在動(dòng)物染色體穩(wěn)定整合并遺傳給后代的動(dòng)物。實(shí)轉(zhuǎn)基因方法 DNA 逆轉(zhuǎn)錄病毒/DNA轉(zhuǎn)染 胚胎干細(xì)胞 顯微注射受精卵 四細(xì)胞胚胎 囊胚 原腸胚 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物 顯微注射 逆轉(zhuǎn)錄病毒DNA DNA實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤學(xué)基本概念44轉(zhuǎn)基因方法 纖維注射與逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染的比較轉(zhuǎn)基因方式 顯微注射 逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染DNA導(dǎo)入 50kb,單細(xì)胞受精卵 10-15kb,46細(xì)胞卵培養(yǎng)液 M16 高營(yíng)養(yǎng)液移卵 輸卵管 子宮整合 隨機(jī)整合，多拷貝 隨機(jī)整合，嵌合