121 食品中菌落總數(shù)大腸菌群數(shù)測(cè)定

1、項(xiàng)目12.1 食品的微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)、大腸菌群測(cè)定食品微生物學(xué)檢驗(yàn)的指標(biāo)菌落總數(shù)大腸菌群致病菌霉菌及其毒素其它指標(biāo)：寄生蟲常見食品微生物檢驗(yàn)樣品的采集與處理一、我國食品微生物檢驗(yàn)樣品的取樣方案1、檢驗(yàn)前的準(zhǔn)備工作 儀器、藥品、儀器用具滅菌、環(huán)境滅菌2、食品檢驗(yàn)樣品采集的原則 - 代表性：隨機(jī)抽樣，避免主觀性和以偏概全 - 無菌操作：防止外來污染 - 保存和運(yùn)輸：冷藏，微生物不發(fā)生變化 - 標(biāo)簽、記錄：過程可追溯3、需要遵循的取樣方法（了解） 二、常見食品微生物樣品的采集與處理1、肉與肉制品樣品 - 健康的禽畜肉、血液及臟器組織，一般無菌 - 微生物來源于加工過程中的污染2、乳與乳制品 -

2、 成批產(chǎn)品按千分之一取樣3、蛋與蛋制品 - 75%酒精消毒蛋殼 - 沙門菌4、水產(chǎn)品樣品 - 一般取完整的個(gè)體 - 檢驗(yàn)新鮮度：檢驗(yàn)肌肉內(nèi)微生物含量 - 檢驗(yàn)是否有致病菌：取鰓、腸5、清涼飲料樣品 - 一般取完整包裝6、調(diào)味品樣品 - 食醋：用滅菌碳酸鈉調(diào)整pH為中性7、冷食菜、涼菜、豆制品 - 取接觸容器邊緣、底部及上面不同部位的樣品8、糖果、糕點(diǎn)、果脯樣品 - 取25克加入滅菌生理鹽水225mL，1：109、酒類樣品 - 一般不進(jìn)行微生物學(xué)檢驗(yàn)，因酒精可抑制細(xì)菌 - 一般只檢驗(yàn)低度酒10、糧食樣品 - 糧食在生長過程中容易受到霉菌侵入 - 原糧需用75%酒精浸泡，以去除表面的蠟質(zhì) - 分離

3、糧粒內(nèi)部的霉菌，需要先用無菌水洗凈表面的微生物國際上常見的取樣方案一、國際食品微生物規(guī)范委員會(huì)取樣方案1、采樣原則 - 各類微生物對(duì)人的危害程度不同 - 食品經(jīng)不同條件處理后，危害度變化情況：降低、未變、增加2、采樣方法 - 三種危害度： 1）老人和嬰幼兒 2）可立即食用的食品，在食用前危害基本不變 3）食用前經(jīng)過加熱處理 ICMSF取樣方案：分為二級(jí)法和三級(jí)法解釋四個(gè)代號(hào)：n：系指一批產(chǎn)品采樣個(gè)數(shù)。c：系指該批產(chǎn)品的檢樣菌數(shù)中，超過限量的檢樣數(shù)，即結(jié)果超過合格菌數(shù)限量的最大允許數(shù)。m：系指合格菌數(shù)限量，將可接受與不可接受的數(shù)量區(qū)別開。M：系指附加條件，判定為合格的菌數(shù)限量，表示邊緣的可接受數(shù)

4、與邊緣的不可接受數(shù)之間的界限。 它是從統(tǒng)計(jì)學(xué)原理來考慮，對(duì)一批產(chǎn)品，檢查多少檢樣，才能夠有代表性，才能客觀地反映出該產(chǎn)品的質(zhì)量而設(shè)定的 （1）二級(jí)抽樣方案 舉例： 以生食海產(chǎn)品魚為例，n=5，c=0，m=102，n=5即抽樣5個(gè)，c=0即意味著在該批檢樣中，未見到有超過m值的檢樣，此批貨物為合格品。只設(shè)合格判定標(biāo)準(zhǔn)m值，超過m值的，則為不合格品。檢查在檢樣是否有超過m值的，來判定該批是否合格。 （2）三級(jí)抽樣方案例如：冷凍生蝦的細(xì)菌數(shù)標(biāo)準(zhǔn)n=5，c=3，m=101，M=102，其意義是從一批產(chǎn)品中，取5個(gè)檢樣，經(jīng)檢樣結(jié)果，允許3個(gè)檢樣的菌數(shù)是在m和值之間，如果有3個(gè)以上檢樣的菌數(shù)是在m和M值之

5、間或一個(gè)檢樣菌數(shù)超過M值者，則判定該批產(chǎn)品為不合格品。 設(shè)有微生物標(biāo)準(zhǔn)m及M值兩個(gè)限量如同二級(jí)法，超過m值的檢樣，即算為不合格品。其中以m值到M值的范圍內(nèi)的檢樣數(shù)，作為c值，如果在此范圍內(nèi)，即為附加條件合格，超過M值者，則為不合格。二、美國FDA取樣方案 - 與ICMSF基本一致 15個(gè)100克樣品各取25克混合成一堆取25克菌落形成單位CFU (colony forming unit) 菌落總數(shù)：指樣品在一定條件下培養(yǎng)后，1g或1ml檢樣總所含細(xì)菌菌落總數(shù)。每個(gè)活菌只能形成一個(gè)肉眼可見菌落，是活的細(xì)胞總數(shù)大腸菌群的檢驗(yàn)任務(wù)12-112.1 大腸菌群測(cè)定的衛(wèi)生學(xué)意義定義：一群在37條件下培養(yǎng)2

6、4小時(shí)能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸、產(chǎn)氣、需氧和兼性厭氧、革蘭氏陰性、無芽孢桿菌包括：埃希氏菌屬、檸檬酸桿菌屬、腸桿菌屬、克雷伯氏菌屬等細(xì)菌作為糞便污染指標(biāo)，有廣泛的衛(wèi)生學(xué)意義廣泛用做水源的衛(wèi)生指標(biāo)和食品加工衛(wèi)生狀況的通用指標(biāo)腸桿菌科中與醫(yī)學(xué)有關(guān)的常見菌族和菌屬埃希菌族 埃希菌屬 大腸桿菌 志賀菌屬 痢疾志賀菌愛德華菌族 愛德華菌屬 遲鈍愛德華菌沙門菌族 沙門菌屬 傷寒沙門菌 枸櫞酸菌屬 佛勞第枸櫞酸菌克雷伯菌族 克雷伯菌屬 肺炎克氏菌 腸桿菌屬 產(chǎn)氣腸桿菌 哈夫尼亞菌屬 蜂窩哈夫尼亞菌 沙雷菌屬 粘質(zhì)沙雷菌變形桿菌族 變形桿菌屬 普通變形桿菌 摩根菌屬 摩氏摩根菌屬 普羅威登斯菌屬 雷氏普羅威登斯菌耶爾

7、森菌族 耶爾森菌屬 鼠疫耶爾菌歐文菌族本 歐文菌屬 草原居民歐文菌菌族 菌屬（菌種數(shù)） 代表種大腸桿菌(埃希氏菌屬 Escherichine)是人類和動(dòng)物腸道中的正常菌群出生后數(shù)小時(shí)就進(jìn)入腸道，并終生伴隨以大腸埃希氏菌（E.coli）最為重要大腸桿菌O157侵襲性大腸桿菌（EIEC）致瀉性大腸桿菌腸毒素性大腸桿菌（ETEC）致病性大腸桿菌（EPEC）出血性大腸桿菌（EHEC）大腸菌群測(cè)定的意義成人糞便中大腸桿菌含量108-109 （個(gè)/克）推測(cè)：大腸桿菌 糞便污染 致病菌 一些特殊食品不適用這個(gè)原理：冷凍食品因?yàn)榇竽c桿菌比致病菌更容易死亡過程監(jiān)測(cè)：原料、生產(chǎn)、加工、運(yùn)輸、儲(chǔ)存12.2 大腸菌群

8、的測(cè)定方法培養(yǎng)基 乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基（試管）、伊紅美藍(lán)瓊脂、乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基（試管）革蘭氏染液乳糖膽鹽發(fā)酵管配方：蛋白胨 2 % 豬膽鹽（或牛膽鹽）0. 5 % 乳糖 1 % 溴甲酚紫酒精液 0 . 06ml pH 雙料乳糖膽鹽發(fā)酵管：除蒸餾水外其他成分加倍原理溴甲酚紫，中性時(shí)呈藍(lán)紫色，酸性時(shí)呈黃色如果顏色不變（呈藍(lán)紫色），說明無產(chǎn)酸的大腸菌群如果顏色變黃色，說明可能出現(xiàn)能分解乳糖產(chǎn)酸的大腸菌群膽鹽可以抑制G+細(xì)菌生長繁殖分解乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣的大腸菌群，看杜氏管中的氣體杜氏發(fā)酵管產(chǎn)氣情況1產(chǎn)氣 2不產(chǎn)氣伊紅美藍(lán)瓊脂EMB 蛋白胨 g 乳糖 g 磷酸氫二鉀 2.0g 瓊脂 g伊紅 0.4g美藍(lán)g 蒸餾

9、水 mL最終0.2 (25) 蛋白胨提供細(xì)菌生長發(fā)育所需的氮源、維生素和氨基酸，乳糖提供發(fā)酵所需的碳源，磷酸氫二鉀維持緩沖體系，伊紅和美藍(lán)抑制絕大部分革蘭氏陽性菌的生長。瓊脂是凝固劑。 大腸桿菌在EMB上發(fā)酵乳糖，形成黑色菌落，大部分有金屬光澤。沙門氏菌形成無色菌落。金黃色葡萄球菌基本上不生長。菌株 菌號(hào) 生長情況 菌落 產(chǎn)氣腸桿菌 ATCC 13048 好 粉紅，無光澤大腸埃希氏菌 ATCC 25922 好，極好 有紫綠金屬光澤中心肺炎克雷伯氏菌 ATCC 13883 好 綠金屬光澤，有黑心奇異變形桿菌 ATCC 25933 好，極好 無色鼠傷寒沙門氏菌 ATCC 14028 好，極好 無色

10、金黃色葡萄球菌 ATCC 25923 被抑制 12.3 大腸菌群測(cè)定操作流程（任務(wù)一）梯度稀釋樣品大腸菌群測(cè)定操作注意事項(xiàng)1、檢驗(yàn)步序：三步法（乳糖發(fā)酵、分離培養(yǎng)、證實(shí)實(shí)驗(yàn)），也可稱（初發(fā)酵、平板分離、復(fù)發(fā)酵）2、抑菌劑3、挑選菌落4、產(chǎn)氣量5、接種量是指實(shí)際接入試管中的、相當(dāng)于原樣品的量 例如： 稀釋度1：10 接種10ml，取液量是10ml，但接種量就是1ml(g)，即相當(dāng)于原樣品的1ml(g)6、接種量若是大于ml的話全部用雙料管，等于或小于ml用單料管大腸菌群測(cè)定操作注意事項(xiàng) 根據(jù)證實(shí)為大腸菌群陽性的管數(shù)，查MPN檢索表，報(bào)告為：個(gè)/100mL（或g） 或 MPN/100ml（或g）1

11、2.4 MPN法估計(jì)大腸菌群數(shù)量（任務(wù)二）What? MPN (Most Probable Number)?MPN法是一種常見的間接計(jì)數(shù)法，相對(duì)來說， CFU是直接計(jì)數(shù)法MPN法是一種概率估計(jì)法，有可信區(qū)間， MPN值并不能表示實(shí)際菌落數(shù)，而實(shí)際菌落數(shù)落在可信區(qū)間內(nèi)的任何一點(diǎn)MPN值是該區(qū)間內(nèi)最有可能的那個(gè)值How? MPN檢索表的使用方法（1）該方法只適用于連續(xù)的10倍稀釋的情況（2）向發(fā)酵管里面接種的接種量指的是相當(dāng)于原樣品（液體或固體）的體積或質(zhì)量，而不是稀釋后的體積或質(zhì)量 例如： 的103稀釋液的接種量 = 1ml的104稀釋液的接種量，因?yàn)樗鼈兿喈?dāng)于原樣品的量是相同的（3）也可以不用

12、梯度稀釋液來接種，或者說也可以不用做梯度稀釋液，而直接用樣品接種 例如， 可以直接向三組發(fā)酵管中分別直接加入10g（或ml）、 1g（或ml）、（或ml）樣品（4）初發(fā)酵和復(fù)發(fā)酵的發(fā)酵管中培養(yǎng)基的量不會(huì)影響檢驗(yàn)結(jié)果，無關(guān)How? MPN檢索表的使用方法（5）MPN表中的陽性管數(shù)是最終證實(shí)實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陽性且革蘭氏染色為陰性無芽孢桿菌的管數(shù)，而不是初發(fā)酵時(shí)產(chǎn)氣的管數(shù) (6) 3個(gè)稀釋度9支試管，理想情況下，應(yīng)該讓最高稀釋度的試管呈陰性，最低稀釋度的試管全呈陽性，即 3, x, 0形式How? MPN檢索表的使用方法任務(wù)二練習(xí)：MPN檢索表用法十倍稀釋1ml ，百倍稀釋1ml ，千倍稀釋1ml各三管，

13、都為陰性，結(jié)果為？MPN/100mL原樣品1ml或十倍稀釋10ml ，十倍稀釋1ml， 百倍稀釋 1ml 各三管，都為陰性，結(jié)果為？MPN/100mL原樣品10ml ，原樣品1ml，十倍稀釋1ml 各三管，都為陰性，結(jié)果為？MPN/100mL十倍稀釋1ml ，百倍稀釋1ml ，千倍稀釋1ml各三管，都為陰性，結(jié)果為300MPN/100mL原樣品1ml或十倍稀釋10ml ，十倍稀釋1ml， 百倍稀釋 1ml 各三管，都為陰性，結(jié)果為30MPN/100mL原樣品10ml ，原樣品1ml，十倍稀釋1ml 各三管，都為陰性，結(jié)果為3MPN/100mL任務(wù)二練習(xí)：MPN檢索表用法MPN法的隱性成本 但是

14、，讓我們看一下90 MPN/100 g的可信區(qū)間，為10 360 cfu/100g 也就是說有部分實(shí)際菌落數(shù)在1030 cfu/100g之間，會(huì)被當(dāng)作不合格產(chǎn)品處理！假如某產(chǎn)品的大腸菌群國家標(biāo)準(zhǔn)為30 MPN/100 g，而某廠家的樣品的檢測(cè)結(jié)果為90 MPN/100 g大腸菌群超標(biāo)鑒定完畢！原國家商檢局制訂的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，等效采用美國FDA的標(biāo)準(zhǔn)方法，用于對(duì)出口食品中的大腸桿菌進(jìn)行檢測(cè)兩步法：推測(cè)試驗(yàn)：樣品稀釋后，選擇三個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度接種三管LST肉湯。361培養(yǎng)482h，觀察是否產(chǎn)氣。證實(shí)試驗(yàn)：將產(chǎn)氣管培養(yǎng)物接種煌綠乳糖膽鹽（BGLB）肉湯管中，361培養(yǎng)482h，觀察是否產(chǎn)氣。以BGLB產(chǎn)氣為陽性。查MPN表，報(bào)告每ml(g)樣品中大腸菌群的MPN值。水樣的檢驗(yàn)一般只檢驗(yàn)菌落總數(shù)和大腸菌群MPN只有在流行病學(xué)調(diào)查時(shí)才進(jìn)行致病菌檢驗(yàn)大腸菌群是水的衛(wèi)生學(xué)指示菌水樣中大腸菌群的檢驗(yàn)方法：MPN法（特殊） - 初發(fā)酵、平板分離、復(fù)發(fā)酵水中總大腸菌群的測(cè)定多管發(fā)酵法 (1) 生活飲用水 初發(fā)酵試驗(yàn) 平板分離 復(fù)發(fā)酵試驗(yàn) 陽性管接種在伊紅美蘭培養(yǎng)基上，37培養(yǎng)1824h，挑選典型特征的菌落，涂片、革蘭氏染色、鏡檢 各100mL原水樣各10mL3724hG-G-G+3718-24h3724h水中總大腸菌群的測(cè)定(2) 水源水：