轉(zhuǎn)氨基作用主題醫(yī)學(xué)知識(shí)培訓(xùn)課件

1、轉(zhuǎn)氨基作用主題醫(yī)學(xué)知識(shí)轉(zhuǎn)氨基作用主題醫(yī)學(xué)知識(shí)實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、 學(xué)習(xí)層析技術(shù)2、 掌握氨基酸紙層析 法的基本原理10/9/20222轉(zhuǎn)氨基作用主題醫(yī)學(xué)知識(shí)實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、 學(xué)習(xí)層析技術(shù)10/3/20222轉(zhuǎn)氨基作用主題層析技術(shù)層析法又稱色譜法，是一種根據(jù)混合物的物理或化學(xué)性質(zhì)不同（如吸附力、溶解度等）而建立的物質(zhì)分離、分析方法，是近代生化最常用技術(shù)之一。10/9/20223轉(zhuǎn)氨基作用主題醫(yī)學(xué)知識(shí)層析技術(shù)層析法又稱色譜法，是一種根據(jù)混合物的物理或化學(xué)性質(zhì)不層析技術(shù)的基本原理 在層析系統(tǒng)(固定相流動(dòng)相)中，由于混合物各組份理化性質(zhì)不同，與兩相的相互作用（吸附、溶解等）能力不同，隨著流動(dòng)相不斷向前移動(dòng)，不同組

2、分最終得以分開10/9/20224轉(zhuǎn)氨基作用主題醫(yī)學(xué)知識(shí)層析技術(shù)的基本原理 在層析系統(tǒng)(固定相流動(dòng)相)紙層析的分離原理紙層析是分配層析，是利用混合物在二種或者二種以上的溶劑中總分配系數(shù)的不同而使物質(zhì)分離的方法。10/9/20225轉(zhuǎn)氨基作用主題醫(yī)學(xué)知識(shí)紙層析的分離原理紙層析是分配層析，是利用混合物在二種或者二種紙層析原理以濾紙為支持物，濾紙上纖維為載體，濾紙上結(jié)合水為固定相，有機(jī)溶劑作為流動(dòng)相。濾紙纖維與水親合力強(qiáng)，能吸收20-22%的水，且其中6-7%的水是以氫鍵形式與纖維素的羥基結(jié)合，在一般情況下很難脫去，而濾紙纖維與有機(jī)溶劑的親和力甚弱。10/9/20226轉(zhuǎn)氨基作用主題醫(yī)學(xué)知識(shí)紙層析原

3、理以濾紙為支持物，濾紙上纖維為載體，濾紙上結(jié)合水為固紙層析法分類按操作方式分成兩類：垂直型和水平型。顧名思義垂直型是將濾紙條垂直懸掛，使流動(dòng)相向上或者向下擴(kuò)散。水平型是將圓形濾紙置于水平位置，使流動(dòng)相溶劑由中心向四周擴(kuò)散。10/9/20227轉(zhuǎn)氨基作用主題醫(yī)學(xué)知識(shí)紙層析法分類按操作方式分成兩類：垂直型和水平型。顧名思義垂直紙色譜法10/9/20228轉(zhuǎn)氨基作用主題醫(yī)學(xué)知識(shí)紙色譜法10/3/20228轉(zhuǎn)氨基作用主題醫(yī)學(xué)知識(shí)實(shí)驗(yàn)原理 轉(zhuǎn)氨基反應(yīng)是由專一轉(zhuǎn)氨酶催化的-氨基與-酮酸之間基團(tuán)互換反應(yīng), 廣泛存在于機(jī)體各組織器官，是體內(nèi)氨基酸代謝的重要途徑。10/9/20229轉(zhuǎn)氨基作用主題醫(yī)學(xué)知識(shí)實(shí)驗(yàn)原

4、理 轉(zhuǎn)氨基反應(yīng)是由專一轉(zhuǎn)氨酶催化的實(shí)驗(yàn)原理 本實(shí)驗(yàn)以丙氨酸和-酮戊二酸為底物，加含有谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）的肝勻漿，保溫后用紙層析法檢查谷氨酸的出現(xiàn)，以證明轉(zhuǎn)氨基作用。10/9/202210轉(zhuǎn)氨基作用主題醫(yī)學(xué)知識(shí)實(shí)驗(yàn)原理 本實(shí)驗(yàn)以丙氨酸和-酮戊二酸為底物，加含有ALT催化的轉(zhuǎn)氨基反應(yīng)10/9/202211轉(zhuǎn)氨基作用主題醫(yī)學(xué)知識(shí)ALT催化的轉(zhuǎn)氨基反應(yīng)10/3/202211轉(zhuǎn)氨基作用主題醫(yī)實(shí)驗(yàn)原理 本實(shí)驗(yàn)設(shè)立實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組發(fā)生了上述轉(zhuǎn)氨基作用，體系中存在兩種氨基酸；而對(duì)照組由于用煮沸的方法使肝勻漿中ALT失活，不能發(fā)生轉(zhuǎn)氨基作用，體系中只存在一種氨基酸。10/9/202212轉(zhuǎn)氨基作用主題醫(yī)

5、學(xué)知識(shí)實(shí)驗(yàn)原理 本實(shí)驗(yàn)設(shè)立實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組發(fā)生了上述轉(zhuǎn)氨基轉(zhuǎn)氨基作用主題醫(yī)學(xué)知識(shí)培訓(xùn)課件比移率Rf計(jì)算衡量某種被分離物質(zhì)在濾紙上的移動(dòng)速率我們可以用比移率Rf表示：不同物質(zhì)的Rf不同,經(jīng)計(jì)算可分析是否發(fā)生了轉(zhuǎn)氨基反應(yīng)!10/9/202214轉(zhuǎn)氨基作用主題醫(yī)學(xué)知識(shí)比移率Rf計(jì)算衡量某種被分離物質(zhì)在濾紙上的移動(dòng)速率我們可以用【器材】勻漿器、水浴鍋、恒溫水浴箱、圓濾紙(9cm)、吹風(fēng)機(jī)、組織剪刀離心管、試管、培養(yǎng)皿、表面皿、等10/9/202215轉(zhuǎn)氨基作用主題醫(yī)學(xué)知識(shí)【器材】勻漿器、水浴鍋、恒溫水浴箱、圓濾紙(9cm)、吹風(fēng)機(jī)【試劑】1磷酸鹽緩沖液。 20.2mol/L 丙氨酸溶液 30.1

6、mol/L 酮戊二酸 40.1mol/L 谷氨酸溶液 50.5% 茚三酮溶液 6層析溶劑 酚飽和水溶液10/9/202216轉(zhuǎn)氨基作用主題醫(yī)學(xué)知識(shí)【試劑】1磷酸鹽緩沖液。 10/3/202216轉(zhuǎn)氨基作用實(shí)驗(yàn)步驟準(zhǔn)備濾紙點(diǎn)樣層析終止測(cè)定管上清液 0.1 mol/L丙氨酸 對(duì)照管上清液 0.1 mol/L谷氨酸 10/9/202217轉(zhuǎn)氨基作用主題醫(yī)學(xué)知識(shí)實(shí)驗(yàn)步驟準(zhǔn)備濾紙點(diǎn)樣層析終止測(cè)定管上清液 10/3/2【實(shí)驗(yàn)步驟】 1勻漿制備 2酶促反應(yīng)過程 （1）取離心管兩支，編號(hào)：測(cè)定管、對(duì)照管。各管加肝勻漿10滴。測(cè)定管于37水浴10min，對(duì)照管放沸水浴中加熱10min，取出冷卻。10/9/202

7、218轉(zhuǎn)氨基作用主題醫(yī)學(xué)知識(shí)【實(shí)驗(yàn)步驟】 1勻漿制備10/3/202218轉(zhuǎn)氨基作用主【實(shí)驗(yàn)步驟】 （2）各管加丙氨酸溶液10滴, -酮戊二酸10滴, 磷酸鹽緩沖液1.5 ml, 搖勻，置 37保溫30min，取出。10/9/202219轉(zhuǎn)氨基作用主題醫(yī)學(xué)知識(shí)【實(shí)驗(yàn)步驟】 （2）各管加丙氨酸溶液10滴,10/3/2【實(shí)驗(yàn)步驟】（3）測(cè)定管取出后立即放沸水浴中煮 10min(終止反應(yīng))，取出后冷卻， 過濾，濾液備用。 10/9/202220轉(zhuǎn)氨基作用主題醫(yī)學(xué)知識(shí)【實(shí)驗(yàn)步驟】（3）測(cè)定管取出后立即放沸水浴中煮10/3/203層析 取直徑9cm圓形濾紙一張，用圓規(guī)作半徑1cm同心圓，通過圓心做兩條相

8、互垂直的線，找到4個(gè)位點(diǎn)。10/9/202221轉(zhuǎn)氨基作用主題醫(yī)學(xué)知識(shí)3層析 取直徑9cm圓形濾紙一張，用圓規(guī)作半徑1cm同心層析紙準(zhǔn)備 在濾紙圓心處打一小孔，取濾紙一條，下半剪成須狀，卷成燈芯狀捻, 上端插入濾紙中心孔中（不要突出濾紙面）。10/9/202222轉(zhuǎn)氨基作用主題醫(yī)學(xué)知識(shí)層析紙準(zhǔn)備 在濾紙圓心處打一小孔，取濾紙一條，下半剪點(diǎn)樣用毛細(xì)管在紙上1、3處分別點(diǎn)測(cè)定和對(duì)照管上清液(斑點(diǎn)直徑約0.5cm)，2、4處各點(diǎn)丙氨酸和谷氨酸溶液。10/9/202223轉(zhuǎn)氨基作用主題醫(yī)學(xué)知識(shí)點(diǎn)樣用毛細(xì)管在紙上1、3處分別點(diǎn)測(cè)定和對(duì)照管上清液(斑點(diǎn)直徑層析把濾紙平放在盛有層析液的培養(yǎng)皿上，使紙芯下浸入

9、層析液中，可見酚液沿紙芯上升到濾紙中心，漸向四周擴(kuò)散，蓋上培養(yǎng)皿蓋。當(dāng)酚液前緣到離濾紙邊緣約1cm時(shí)（約25-30分鐘）取出濾紙，用鑷子小心取下紙芯，在烤箱中烘吹干濾紙。10/9/202224轉(zhuǎn)氨基作用主題醫(yī)學(xué)知識(shí)層析把濾紙平放在盛有層析液的培養(yǎng)皿上，使紙芯下浸入層析液中，4 、顯色在層析濾紙上滴0.5 %茚三酮溶液,在烤箱中烘吹干濾紙,可見同心弧狀色斑。用鉛筆圈下各色斑。比較各色斑的位置及顏色深淺，并按下列公式計(jì)算各色斑的Rf值，分析是否發(fā)生了轉(zhuǎn)氨基反應(yīng)。10/9/202225轉(zhuǎn)氨基作用主題醫(yī)學(xué)知識(shí)4 、顯色10/3/202225轉(zhuǎn)氨基作用主題醫(yī)學(xué)知識(shí)注意事項(xiàng) 1點(diǎn)樣時(shí)手要洗凈，操作中手盡可 能少接觸濾紙，以免污染。 2. 點(diǎn)樣點(diǎn)不宜過大，直徑應(yīng)小于 0.5cm，為什么？