蛋白質(zhì)化學(xué)醫(yī)學(xué)講座培訓(xùn)課件

1、蛋白質(zhì)化學(xué)醫(yī)學(xué)講座蛋白質(zhì)化學(xué)醫(yī)學(xué)講座 第一節(jié) 蛋白質(zhì)的元素組成 N含量在各種蛋白質(zhì)中比較接近 15%18% ，平均為16%。 每1g 氮相當(dāng)于 6.25g 的蛋白質(zhì) 蛋白質(zhì)平均含N量為16,這是凱氏定氮法測定蛋白質(zhì)含量的理論依據(jù)： 粗蛋白質(zhì)含量蛋白質(zhì)含N量6.252蛋白質(zhì)化學(xué)醫(yī)學(xué)講座 第一節(jié) 蛋白質(zhì)的元素組成 N含量在各方法：常用6 mol/L的鹽酸或4 mol/L的硫 酸，回流煮沸時間約 20 h。優(yōu)點：不引起消旋作用，得到的是L-氨基酸。缺點：色氨酸被沸酸完全破壞；含有羥基的氨 基酸（絲氨酸、蘇氨酸）有一小部分 被分解；天冬酰胺和谷氨酰胺的酰胺基 被水解成了羧基。第二節(jié) 蛋白質(zhì)的氨基酸組成

2、 1. 酸水解一、蛋白質(zhì)的水解3蛋白質(zhì)化學(xué)醫(yī)學(xué)講座方法：常用6 mol/L的鹽酸或4 mol/L的硫 第二節(jié)2. 堿水解方法：一般用5 mol/L氫氧化鈉煮沸1020 h。 優(yōu)點：色氨酸在水解中不受破壞。 缺點：多數(shù)氨基酸受到不同程度的破壞，產(chǎn)生 消旋現(xiàn)象，得到的是D-和L-氨基酸的混 合物。此外，引起精氨酸脫氨（生成鳥 氨酸和尿素）。4蛋白質(zhì)化學(xué)醫(yī)學(xué)講座2. 堿水解方法：一般用5 mol/L氫氧化鈉煮沸10203. 酶水解方法：用于蛋白質(zhì)肽鏈斷裂的蛋白水解酶或稱 蛋白酶（proteinase）已有十多種，常用 的有胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶（或稱糜 蛋白酶）及胃蛋白酶等。優(yōu)點：不產(chǎn)生消旋作用，也

3、不破壞氨基酸。水解 位點特異，用于一級結(jié)構(gòu)分析，肽譜 缺點：使用一種酶往往水解不徹底，需幾種酶協(xié)同作用才能使蛋白質(zhì)完全水解。該法主要用于部分水解。5蛋白質(zhì)化學(xué)醫(yī)學(xué)講座3. 酶水解方法：用于蛋白質(zhì)肽鏈斷裂的蛋白水解酶或稱5蛋白質(zhì)二、氨基酸的功能：1. 組成蛋白質(zhì)2. 一些aa及其衍生物充當(dāng)化學(xué)信號分子-amino butyric acid (-氨基丁酸)、Serotonic(5-羥色胺，血清緊張素)、melatonin(褪黑激素，N-乙酰-甲氧基色胺)，都是神經(jīng)遞質(zhì)，后二者是色氨酸衍生物(神經(jīng)遞質(zhì)是一個神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生的影響第二個神經(jīng)細(xì)胞或肌肉細(xì)胞功能的物質(zhì))。Thyroxine(甲狀腺素，動物甲狀

4、腺thyroid gland產(chǎn)生的Tyr衍生物)和吲哚乙酸(植物中的Trp衍生物)都是激素(激素就是一個細(xì)胞產(chǎn)生的調(diào)節(jié)其它細(xì)胞的功能的化學(xué)信號分子)。6蛋白質(zhì)化學(xué)醫(yī)學(xué)講座二、氨基酸的功能：1. 組成蛋白質(zhì)6蛋白質(zhì)化學(xué)醫(yī)學(xué)講座3. 氨基酸是許多含N分子的前體物 核苷酸和核酸的含氮堿基、血紅素、葉綠素的合成都需要aa4. 一些基本氨基酸和非基本aa是代謝中間物 精氨酸、Citrulline(瓜氨酸)、Ornithine(鳥氨酸)是尿素循不(Urea cycle)的中間物，含氮廢物在脊椎動物肝臟中合成尿素是排除它們的一種重要機制。7蛋白質(zhì)化學(xué)醫(yī)學(xué)講座3. 氨基酸是許多含N分子的前體物7蛋白質(zhì)化學(xué)醫(yī)學(xué)

5、講座三、氨基酸的結(jié)構(gòu)與分類1809年發(fā)現(xiàn)Asp，1938年發(fā)Thr，目前已發(fā)現(xiàn)180多種。但是組成蛋白質(zhì)的aa常見的有20種，稱為基本氨基酸（編碼的蛋白質(zhì)氨基酸），還有一些稱為稀有氨基酸，是多肽合成后由基本aa經(jīng)酶促修飾而來。此外還有存在于生物體內(nèi)但不組成蛋白質(zhì)的非蛋白質(zhì)氨基酸(約150種)。（一）編碼的蛋白質(zhì)氨基酸（20種）也稱基本氨基酸或標(biāo)準(zhǔn)氨基酸，有對應(yīng)的遺傳密碼。 8蛋白質(zhì)化學(xué)醫(yī)學(xué)講座三、氨基酸的結(jié)構(gòu)與分類8蛋白質(zhì)化學(xué)醫(yī)學(xué)講座-氨基酸的一般結(jié)構(gòu)氨基在-位，為L-構(gòu)型.除脯氨酸外，均為-氨基酸除甘氨酸外，均為手性氨基酸9蛋白質(zhì)化學(xué)醫(yī)學(xué)講座-氨基酸的一般結(jié)構(gòu)除脯氨酸外，均為-氨基酸9蛋白質(zhì)

6、化學(xué)醫(yī)氨基酸的分類1. 按R基的化學(xué)結(jié)構(gòu)分類 可以分為三類：脂肪族、芳香族和雜環(huán)族 脂肪族氨基酸 含一氨基一羧基的中性氨基酸甘氨酸 Gly, G丙氨酸 Ala, A纈氨酸 Val, V亮氨酸 Lue, L異亮氨酸 Ile, I10蛋白質(zhì)化學(xué)醫(yī)學(xué)講座氨基酸的分類1. 按R基的化學(xué)結(jié)構(gòu)分類甘氨酸 Gly R基均為中性烷基（Gly為H），R基對分子酸堿性影響很小，它們幾乎有相同的等電點。（6 .00.03） Gly是唯一不含手性碳原子的氨基酸，因此不具旋光性。 從Gly至Ile，R基團疏水性增加，Ile 是這20 種a.a 中脂溶性最強的之一（除Phe 2.5、Trp3.4 、Tyr 2.3以外）。

7、 11蛋白質(zhì)化學(xué)醫(yī)學(xué)講座 R基均為中性烷基（Gly為H），R基對分子酸堿絲氨酸 （Ser,S）蘇氨酸 （Thr,T）半胱氨酸 （Cys,C）甲硫氨酸 （Met,M）含羥基或硫脂肪族氨基酸12蛋白質(zhì)化學(xué)醫(yī)學(xué)講座絲氨酸 （Ser,S）蘇氨酸 （Thr,T）含羥基的有兩種：Ser和Thr Ser的-CH2 OH基（pKa=15），在生理條件下不解離，但它是一個極性基團，能與其它基團形成氫鍵，具有重要的生理意義。在大多數(shù)酶的活性中心都發(fā)現(xiàn)有Ser殘基存在。 Thr 中的-OH是仲醇，具有親水性，但此-OH形成氫鍵的能力較弱，因此，在蛋白質(zhì)活性中心中很少出現(xiàn)。Ser和Thr的-OH往往與糖鏈相連，形成糖

8、蛋白。含硫的兩種：Cys、Met Cys中R含巰基（-SH），Cys 具有兩個重要性質(zhì)： （1）在較高pH值條件，巰基離解。 （2）兩個Cys的巰基氧化生成二硫鍵，生成胱氨酸 ( CysssCys) 13蛋白質(zhì)化學(xué)醫(yī)學(xué)講座含羥基的有兩種：Ser和Thr13蛋白質(zhì)化學(xué)醫(yī)學(xué)講座 二硫鍵在蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)中具有重要意義。 Cys還常常出現(xiàn)在酶的活性中心。Met的R中含有甲硫基（-SCH3），硫原子有親核性，易發(fā)生極化，因此，Met是一種重要的甲基供體。Cys與結(jié)石在細(xì)胞外液如血液中，Cys以胱氨酸(Cystine)氧化形式存在，胱氨酸的溶解性最差。胱氨酸尿(Cystinuria)是一種遺傳病，由于胱氨酸

9、的跨膜運輸缺陷導(dǎo)致大量的胱氨酸排泄到尿中。胱氨酸在腎(Kidney)、輸尿管(ureter)、膀胱(urinary bladder)中結(jié)晶形成結(jié)石(Calculus, calculi)，結(jié)石會導(dǎo)致疼痛、發(fā)炎甚至尿血。大量服用青霉胺(Penicillcemine)能降低腎中胱氨的含量，因為青霉胺與半胱氨酸形成的化合物比胱氨酸易溶解。14蛋白質(zhì)化學(xué)醫(yī)學(xué)講座 二硫鍵在蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)中具有重要意義。14蛋白質(zhì)化學(xué)酸性氨基酸及酰胺天冬氨酸 （Asp,D）谷氨酸 （Glu,E）天冬酰胺 （Asn,N）谷氨酰胺 （Gln,Q）15蛋白質(zhì)化學(xué)醫(yī)學(xué)講座酸性氨基酸及酰胺天冬氨酸 （Asp,D）谷氨酸 Asp、Glu

10、，一般稱酸性氨基酸Asp側(cè)鏈羧基pKa（-COOH）為3.86，Glu側(cè)鏈羧基pKa（-COOH）為4.25它們是在生理條件下帶有負(fù)電荷的僅有的兩個氨基酸。Asn、Gln 酰胺基中氨基易發(fā)生氨基轉(zhuǎn)移反應(yīng)，轉(zhuǎn)氨基反應(yīng)在生物合成和代謝中有重要意義16蛋白質(zhì)化學(xué)醫(yī)學(xué)講座Asp、Glu，一般稱酸性氨基酸16蛋白質(zhì)化學(xué)醫(yī)學(xué)講座堿性氨基酸賴氨酸 （Lys,K）精氨酸 （Arg,R）組氨酸 （His,H）雜環(huán)17蛋白質(zhì)化學(xué)醫(yī)學(xué)講座堿性氨基酸賴氨酸 （Lys,K）精氨酸 （Lys的R側(cè)鏈上含有一個氨基，側(cè)鏈氨基的pKa為10.53。生理條件下，Lys側(cè)鏈帶有一個正電荷（NH3+），同時它的側(cè)鏈有4個C的直鏈，

11、柔性較大，使側(cè)鏈的氨基反應(yīng)活性增大。（如肽聚糖的短肽間的連接）Arg是堿性最強的氨基酸，側(cè)鏈上的胍基是已知堿性最強的有機堿，pKa值為12.48，生理條件下完全質(zhì)子化。His含咪唑環(huán)，咪唑環(huán)的pKa在游離氨基酸中和在多肽鏈中不同，前者pKa為6.00，后者為7.35，它是20種氨基酸中側(cè)鏈pKa值最接近生理pH值的一種，在接近中性pH時，可離解平衡。它是在生理pH條件下唯一具有緩沖能力的氨基酸。 His含咪唑環(huán)，一側(cè)去質(zhì)子化和另一側(cè)質(zhì)子化同步進(jìn)行，因而在酶的酸堿催化機制中起重要作用。 18蛋白質(zhì)化學(xué)醫(yī)學(xué)講座Lys的R側(cè)鏈上含有一個氨基，側(cè)鏈氨基的pKa為10.53。2、芳香族氨基酸苯丙氨酸 （

12、Phe,F）酪氨酸 （Tyr,Y）色氨酸 （Trg,W）19蛋白質(zhì)化學(xué)醫(yī)學(xué)講座2、芳香族氨基酸苯丙氨酸 （Phe,F）酪氨酸 都具有共軛電子體系,易與其它缺電子體系或電子體系形成電荷轉(zhuǎn)移復(fù)合物( charge-transfer complex)或電子重疊復(fù)合物。在受體底物、或分子相互識別過程中具有重要作用。這三種氨基酸在近紫外區(qū)有特殊吸收峰，蛋白質(zhì)的紫外吸收主要來自這三種氨基酸，在280nm處，TrpTyrPhe。Phe疏水性最強.。酪氨酸的-OH磷酸化是一個十分普遍的調(diào)控機制，Tyr在較高pH值時，酚羥基離解。Trp有復(fù)雜的共軛休系，比Phe和Tyr更易形成電荷轉(zhuǎn)移絡(luò)合物。 20蛋白質(zhì)化學(xué)醫(yī)

13、學(xué)講座都具有共軛電子體系,易與其它缺電子體系或電子體系形成電荷3、雜環(huán)氨基酸組氨酸 （His,H）脯氨酸 （Pro,P）21蛋白質(zhì)化學(xué)醫(yī)學(xué)講座3、雜環(huán)氨基酸組氨酸 （His,H）脯氨酸 Pro，有時也把His、Trp歸入此類。Pro是唯一的一種環(huán)狀結(jié)構(gòu)的氨基酸，它的-亞氨基是環(huán)的一部分，因此具有特殊的剛性結(jié)構(gòu)。它在蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)中具有極重要的作用，一般出現(xiàn)在兩段-螺旋之間的轉(zhuǎn)角處，Pro殘基所在的位置必然發(fā)生骨架方向的變化22蛋白質(zhì)化學(xué)醫(yī)學(xué)講座Pro，有時也把His、Trp歸入此類。22蛋白質(zhì)化學(xué)醫(yī)學(xué)講2. 按R基的極性分類(能否與水形成氫鍵) 20種基本氨基酸可以分成以下四組： 1、非極性氨

14、基酸（八種） Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Trp、Met、 Pro 這類氨基酸的R基都是疏水性的，在維持蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)中起著重要作用。2、極性不帶電荷的氨基酸（七種） 6種，絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺。這類氨基酸的側(cè)鏈都能與水形成氫鍵，因此很容易溶于水。酪氨酸的-OH磷酸化是一個十分普遍的調(diào)控機制，Ser和Thr的-OH往往與糖鏈相連，Asn和Gln的-NH2很容易形成氫鍵，因此能增加蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。23蛋白質(zhì)化學(xué)醫(yī)學(xué)講座2. 按R基的極性分類(能否與水形成氫鍵) 3、極性帶正電荷的氨基酸 三種堿性氨基酸：Lys、Arg、His 在 pH7 時帶正電荷。

15、當(dāng)膠原蛋白中的Lys側(cè)鏈氧化時能形成很強的分子間(內(nèi))交聯(lián)。Arg的胍基堿性很強，與NaOH相當(dāng)。His是一個弱堿，在 pH6.0 時，His 的 R 基 50% 以上質(zhì)子化，但 pH7.0 時，質(zhì)子化的分子不到10% His 是 R 基的pK值在7附近的唯一的氨基酸。 是天然的緩沖劑，它往往存在于許多酶的活性中心。 24蛋白質(zhì)化學(xué)醫(yī)學(xué)講座3、極性帶正電荷的氨基酸 三種堿性氨基酸：Lys、Arg、H 4、極性帶負(fù)電荷的氨基酸 兩種酸性氨基酸：Asp、Glu。在pH67時，谷氨酸和天冬氨酸的第二個羧基解離，因此，帶負(fù)電荷。酶的活性中心：His、Ser、Cys非極性aa一般位于蛋白質(zhì)的疏水核心，帶

16、電荷的aa和極性aa位于表面。 25蛋白質(zhì)化學(xué)醫(yī)學(xué)講座 4、極性帶負(fù)電荷的氨基酸25蛋白質(zhì)化學(xué)醫(yī)學(xué)講座三個有特性的氨基酸 一是脯氨酸（Pro），因為它是一個環(huán)狀的亞 氨基酸。它的氨基和其它氨基酸的羧基形成的 肽鍵有明顯的特點，較易變成順式肽鍵。26蛋白質(zhì)化學(xué)醫(yī)學(xué)講座三個有特性的氨基酸 一是脯氨酸（Pro），因為它是一個環(huán)狀的二是甘氨酸（Gly），它是唯一的在碳原子上只有兩個氫原子，沒有側(cè)鏈的氨基酸。為此它既不能和其它殘基的側(cè)鏈相互作用，也不產(chǎn)生任何位阻現(xiàn)象，進(jìn)而在蛋白質(zhì)的立體結(jié)構(gòu)形成中有其特定的作用。第三個是半胱氨酸(Cys)。它的個性不僅表現(xiàn)在其側(cè)鏈有一定的大小和具有高度的化學(xué)反應(yīng)活性，還在

17、于兩個 Cys 能形成穩(wěn)定的帶有二硫（橋）鍵的胱氨酸。二硫鍵不僅可以在肽鏈內(nèi)，也可以在肽鏈間存在。更有甚者，同樣的一對二硫鍵能具有不同的空間取向。 27蛋白質(zhì)化學(xué)醫(yī)學(xué)講座二是甘氨酸（Gly），它是唯一的在碳原子上只有兩個氫原子（浙江大學(xué)2006年題）按氨基酸R基的極性性質(zhì)將其分為哪幾類？請寫出各類的性質(zhì)，氨基酸的名稱以及三字符號和單子符號解析：主要考察編碼蛋白質(zhì)的20種氨基酸的結(jié)構(gòu)和極性及單字和三字符號28蛋白質(zhì)化學(xué)醫(yī)學(xué)講座（浙江大學(xué)2006年題）按氨基酸R基的極性性質(zhì)將其分為哪幾類二、非編碼的蛋白質(zhì)氨基酸也稱修飾氨基酸，是在蛋白質(zhì)合成后，由基本氨基酸修飾而來。Prothrombin(凝血酶原

18、)中含有-羧基谷氨酸，能結(jié)合Ca2+。結(jié)締組織中最豐富的蛋白質(zhì)膠原蛋白含有大量4-羥脯氨酸和5-羥賴氨酸。 （1）4-羥脯氨酸 （2）5-羥賴氨酸這兩種氨基酸主要存在于結(jié)締組織的纖維狀蛋白（如膠原蛋白）中。（3）6-N-甲基賴氨酸（存在于肌球蛋白中） (4)-羧基谷氨酸 存在于凝血酶原及某些具有結(jié)合Ca2+離子功能的蛋白質(zhì)中。（5）Tyr的衍生物： 3.5 -二碘酪氨酸、甲狀腺素 （甲狀腺蛋白中）（6）鎖鏈素由4個Lys組成（彈性蛋白中）。29蛋白質(zhì)化學(xué)醫(yī)學(xué)講座二、非編碼的蛋白質(zhì)氨基酸29蛋白質(zhì)化學(xué)醫(yī)學(xué)講座（三）非蛋白質(zhì)氨基酸除參與蛋白質(zhì)組成的20多種氨基酸外，生物體內(nèi)存在大量的氨基酸中間代謝

19、產(chǎn)物，它們不是蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)單元，但在生物體內(nèi)具有很多生物學(xué)功能，如尿素循環(huán)中的L-瓜氨酸和L-鳥氨酸。（1）L-型 氨基酸的衍生物 L-瓜氨酸 L-鳥氨酸（2）D-型氨基酸 D-Glu、D-Ala（肽聚糖中）、D-Phe（短桿菌肽S）（3）-、-、-氨基酸-Ala（泛素的前體）、-氨基丁酸（神經(jīng)遞質(zhì)）。30蛋白質(zhì)化學(xué)醫(yī)學(xué)講座（三）非蛋白質(zhì)氨基酸30蛋白質(zhì)化學(xué)醫(yī)學(xué)講座 -丙氨酸是遍多酸（泛酸）（一種維生素）的前體成分 氨基丁酸是傳遞神經(jīng)沖動的化學(xué)介質(zhì) L-瓜氨酸、L-鳥氨酸是尿素循環(huán)的中間體31蛋白質(zhì)化學(xué)醫(yī)學(xué)講座 -丙氨酸是遍多酸（泛酸）（一種維生素）的前體成分31蛋白甜菜堿肌氨酸鳥氨酸胍氨酸3

20、2蛋白質(zhì)化學(xué)醫(yī)學(xué)講座甜菜堿肌氨酸鳥氨酸胍氨酸32蛋白質(zhì)化學(xué)醫(yī)學(xué)講座四、氨基酸的重要理化性質(zhì)（一）一般物理性質(zhì) -氨基酸為無色晶體，熔點極高，一般在200以上。有的無味、有的味甜、有的味苦、谷氨酸的單鈉鹽有鮮味，是味精的主要成分。 各種氨基酸在水中的溶解度差別很大，除胱氨酸和酪氨酸外一般都能溶于水，并能溶解于稀酸或稀堿中，但不能溶解于有機溶劑。通常酒精能把氨基酸從其溶液中沉淀析出。 脯氨酸和羥脯氨酸能溶于乙醇或乙醚中。33蛋白質(zhì)化學(xué)醫(yī)學(xué)講座四、氨基酸的重要理化性質(zhì)（一）一般物理性質(zhì)33蛋白質(zhì)化學(xué)醫(yī)學(xué)（二）氨基酸的光吸收構(gòu)成蛋白質(zhì)的20種氨基酸在可見光區(qū)都沒有光吸收，但在遠(yuǎn)紫外區(qū)(3.5，-羧基以

21、-COO-形式存在。-氨基pK2在9.4左右，當(dāng)pH3.5，-羧基以氨基酸的兩性解離性質(zhì)及等電點 pH = pI 凈電荷=0 pH pI凈電荷為負(fù)CHRCOOHNH3+CHRCOONH2CHRCOONH3+ + H+ OH- + H+ OH-(pK1)(pK2)在一定的pH條件下，氨基酸分子中所帶的正電荷數(shù)和負(fù)電荷數(shù)相等，即凈電荷為零，在電場中既不向陽極也不向陰極移動，此時溶液的pH值稱為該種氨基酸的等電點(isoelectric point，pI)。即氨基酸的等電點是它呈現(xiàn)電中性時所處環(huán)境的pH值。1、概念39蛋白質(zhì)化學(xué)醫(yī)學(xué)講座氨基酸的兩性解離性質(zhì)及等電點 氨基酸的解離常數(shù)可用測定滴定曲線的

22、實驗方法求得40蛋白質(zhì)化學(xué)醫(yī)學(xué)講座氨基酸的解離常數(shù)可用測定滴定曲線的實驗方法求得40蛋白質(zhì)化學(xué)在pH2.34和pH9.60處，Gly具有緩沖能力。滴定開始時，溶液中主要是Gly+。起點：100% Gly+ 凈電荷：+1第一拐點： 50%Gly+ ，50%Gly 平均凈電荷：+0.5第二拐點： 100%Gly 凈電荷：0 等電點pI第三拐點： 50%Gly ， 50%Gly- 平均凈電荷：-0.5終點： 100% Gly- 凈電荷：-1第一拐點：pH=pK+lgGly/Gly+，pH=pK1=2.34第二拐點：100%Gly，凈電荷為0，此時的pH值稱氨基酸的等電點pI。第三拐點：pH=pK2+

23、lgGly-/Gly=pK2=9.641蛋白質(zhì)化學(xué)醫(yī)學(xué)講座在pH2.34和pH9.60處，Gly具有緩沖能力。41蛋白Handerson-Hasselbalch方程:pH=pKa+log 質(zhì)子受體/質(zhì)子供體計算緩沖溶液pH的主要公式 緩沖容量與緩沖對的濃度有關(guān), 越濃緩沖能力越大 與pH及pK有關(guān), pH=pK時緩沖能力最大 2. 計算緩沖對的濃度比值計算在任一pH條件下一種酸或堿(或氨基酸) 離子化的百分?jǐn)?shù)42蛋白質(zhì)化學(xué)醫(yī)學(xué)講座Handerson-Hasselbalch方程:42蛋白質(zhì)化2、氨基酸等電點的計算 可見，氨基酸的pI值等于該氨基酸的兩性離子兩側(cè)的基團pK值之和的二分之一。pI=2

24、pK1+pK2一氨基一羧基AA的等電點計算：pI=2pK2+pK3二氨基一羧基AA的等電點計算：pI=2pK1+pK2一氨基二羧基AA的等電點計算：43蛋白質(zhì)化學(xué)醫(yī)學(xué)講座2、氨基酸等電點的計算 可見，氨基酸的pI值A(chǔ). 等電點時，氨基酸的溶解度最小，容易沉淀。 利用該性質(zhì)可分離制備某些氨基酸。例如谷氨酸的生產(chǎn)，即將微生物發(fā)酵液的pH值調(diào)至3.22（谷氨酸的等電點）而使谷氨酸沉淀析出。B. 利用各種氨基酸的等電點不同，可通過電泳法、離子交換法等在實驗室或工業(yè)生產(chǎn)上進(jìn)行混合氨基酸的分離或制備。 氨基酸的等電點可由其分子上解離基團的解離常數(shù)來確定 3、應(yīng)用44蛋白質(zhì)化學(xué)醫(yī)學(xué)講座A. 等電點時，氨基酸

25、的溶解度最小，容易沉淀。3、應(yīng)用44蛋1. 某氨基酸溶于pH7的水中，所得氨基酸溶液的pH為8，問此氨基酸的pI是大于8、等于8還是小于8？解析：主要從氨基酸的解離特點考慮，先確定其兩性離子狀態(tài)（即等電點狀態(tài)），然后分析氨基酸溶液變?yōu)?時是從水中吸收了質(zhì)子還是釋放了質(zhì)子。解答：氨基酸晶體主要以兩性離子形式存在，溶于pH7的水中，溶液的pH從7升為8，說明氨基酸在溶解的過程中從水中吸收了質(zhì)子。溶液中有如下平衡：AA + H2O AA+ + OH-要使AA+ 所帶電荷為零，必須加堿，這會使pH8， 故氨基酸的pI 8。45蛋白質(zhì)化學(xué)醫(yī)學(xué)講座1. 某氨基酸溶于pH7的水中，所得氨基酸溶液的pH為8，

26、問2. 計算下列溶液的pH值：（1）0.1 mol/L Gly 0.05 mol/L NaOH的等體積混合液 (2) 0.1 mol/L Gly 0.05 mol/L HCl的等體積混合液解答： （1）Gly 和 NaOH的反應(yīng)為：+H3N-CH2-COO- + NaOH H2N-CH2-COO-Na+ + H2OGlyGly-0.1 mol/L Gly 0.05 mol/L NaOH的等體積混合后Gly - = OH-=0.05/2=0.025 (mol/L)Gly = (0.1-0.05)/2 = 0.025 (mol/L)此時溶液存在如下平衡：+H3N-CH2-COO-H2N-CH2-C

27、OO- + H+Ka2根據(jù)公式pH= pKa + lg 質(zhì)子受體/質(zhì)子供體混合后溶液的pH值為pH=pKa2 +lg(Gly- /Gly )=9.6+lg(0.025/0.025)=9.646蛋白質(zhì)化學(xué)醫(yī)學(xué)講座2. 計算下列溶液的pH值：+H3N-CH2-COO- + （2）Gly 和HCl的反應(yīng)為：+H3N-CH2-COO- + HCl Cl- +H3N-CH2-COOHGlyGly+0.1 mol/L Gly 0.05 mol/L HCl的等體積混合后Gly+ = H+ = 0.05/2=0.025 (mol/L)Gly = (0.1-0.05)/2 = 0.025 (mol/L)此時溶液

28、存在如下平衡：+H3N-CH2-COO- +H3N-CH2-COOHKa1根據(jù)公式pH= pKa + lg 質(zhì)子受體/質(zhì)子供體混合后溶液的pH值為pH=pKa1 +lg (Gly / Gly+ ) = 2.34 + lg(0.025/0.025)=2.3447蛋白質(zhì)化學(xué)醫(yī)學(xué)講座（2）Gly 和HCl的反應(yīng)為：+H3N-CH2-COO- 3. 制備1L pH 3.2, 0.1 mol/L 甘氨酸緩沖液， 需0.1 mol/L 甘氨酸鹽酸鹽(Cl- +H3N-CH2-COOH)和0.1 mol/L 甘氨酸(+H3N-CH2-COO-) 各多少？解答：甘氨酸鹽酸鹽(Cl- +H3N-CH2-COOH

29、) 實際上為二元酸，它的解離式為+H3N-CH2-COO- + H+ +H3N-CH2-COOHKa1GlyGly+pH=pKa1 + lg (Gly / Gly+ ), 3.2=2.34 + lg (Gly / Gly+ )lg (Gly / Gly+ ) = 3.2 - 2.34 = 0.86, Gly / Gly+ =7.24因為配制甘氨酸緩沖溶液所用的甘氨酸鹽酸鹽和甘氨酸的原始濃度相同，所以它們的濃度之比就是它們所用的體積之比，V Gly / V Gly+ = 7.24已知緩沖溶液的總體積為1 L,V Gly / (1-V Gly ）= 7.24， V Gly = 0.879 (L),

30、 V Gly+ = 0.121 (L)48蛋白質(zhì)化學(xué)醫(yī)學(xué)講座3. 制備1L pH 3.2, 0.1 mol/L 甘氨酸緩（四）氨基酸的化學(xué)性質(zhì) 氨基酸是離子化合物，但在溶液狀態(tài)時，存在 下列平衡：化學(xué)反應(yīng)中可用左邊的結(jié)構(gòu)式表示氨基酸。氨基酸分子的-氨基、-羧基能參加反應(yīng)，有的側(cè)鏈R基團也能參加反應(yīng) 49蛋白質(zhì)化學(xué)醫(yī)學(xué)講座（四）氨基酸的化學(xué)性質(zhì) 氨基酸是離子化合物，但在溶液狀態(tài)時，1. -NH2參加的反應(yīng)A. ?；磻?yīng)酰化試劑：芐氧酰氯、叔丁氧甲酰氯、苯二甲酸酐、對-甲苯磺酰氯。這些?；瘎┰诙嚯暮偷鞍踪|(zhì)的人工合成中被用作氨基保護(hù)劑。丹磺酰氯（DNS-Cl，5二甲基氨基萘-1-磺酰氯）DNSCl可

31、用于多肽鏈NH2末端氨基酸的標(biāo)記和微量氨基酸的定量測定。N GlyAlaSerLeuPhe C N DNSGlyAlaSerLeuPhe C水解 DNSGly、 Ala、 Ser、 Leu、 PheDNS-氨基酸在紫外光激發(fā)后發(fā)黃色熒光。50蛋白質(zhì)化學(xué)醫(yī)學(xué)講座1. -NH2參加的反應(yīng)50蛋白質(zhì)化學(xué)醫(yī)學(xué)講座（生物體內(nèi)）在酶和ATP存在條件下，羧酸也可與氨基酸的氨基作用，形成酰基化產(chǎn)物。苯甲酸與Gly的氨基的?；磻?yīng)是生物體內(nèi)解毒作用的一個典型的例子。苯甲酸是食品防腐劑，在生物體內(nèi)轉(zhuǎn)變成N-苯甲酰-Gly后，可經(jīng)尿排出。 51蛋白質(zhì)化學(xué)醫(yī)學(xué)講座（生物體內(nèi)）在酶和ATP存在條件下，羧酸也可與氨基酸

32、的氨基B. 烷基化反應(yīng)-氨基中的氮是一個親核中心，能發(fā)生親核取代反應(yīng)。Sanger反應(yīng)（2,4一二硝基氟苯，DNFB或FDNB）二硝基苯基氨基酸（DNP-氨基酸），黃色，層析法鑒定，被Sanger用來測定多肽的NH2末端氨基酸。Edman反應(yīng)（苯異硫氰酸酯，PITC）苯氨基硫甲酰衍生物（PTC-氨基酸） 苯乙內(nèi)酰硫脲衍生物（PTH-氨基酸）PTH-氨基酸，無色，可以用層析法分離鑒定。被Edman用來鑒定多肽的NH2末端氨基酸 52蛋白質(zhì)化學(xué)醫(yī)學(xué)講座B. 烷基化反應(yīng)52蛋白質(zhì)化學(xué)醫(yī)學(xué)講座 含硫氨基酸的烷基化反應(yīng)硫原子也是親核中心，可發(fā)生親核取代反應(yīng)。生物體內(nèi)，最重要的甲基化試劑是S-腺苷甲硫氨酸

33、（SAM），是由Met與ATP作用得到的S-烷基化產(chǎn)物。在酶催化下，SAM可以使多種生物分子的氨基甲基化，如磷脂酰膽堿的生物合成。S-腺嘌呤核苷-高半胱氨酸（比Cys多一個-CH2）53蛋白質(zhì)化學(xué)醫(yī)學(xué)講座 53蛋白質(zhì)化學(xué)醫(yī)學(xué)講座C. 形成西佛堿反應(yīng)西佛堿是以氨基酸為底物的某些酶促反應(yīng)如轉(zhuǎn)氨基反應(yīng)的中間物。氨基酸的-氨基能與醛類化合物反應(yīng)生成弱堿，即所謂西佛堿（Schiffs base）。54蛋白質(zhì)化學(xué)醫(yī)學(xué)講座C. 形成西佛堿反應(yīng)西佛堿是以氨基酸為底物的某些酶促反應(yīng)如轉(zhuǎn)D.與甲醛的反應(yīng) 用NaOH滴定氨基酸甲醛滴定法 判斷蛋白質(zhì)水解或合成的進(jìn)度55蛋白質(zhì)化學(xué)醫(yī)學(xué)講座D.與甲醛的反應(yīng) 用NaOH滴

34、定氨基酸甲醛滴定法 判斷蛋E. 與亞硝酸的反應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)條件下測定生成的N2體積，即可計算出氨基酸的量。用途：范斯萊克（Van Slyke）法測定氨基氮的基礎(chǔ)?？捎糜诎被岫亢偷鞍踪|(zhì)水解程度的測定。56蛋白質(zhì)化學(xué)醫(yī)學(xué)講座E. 與亞硝酸的反應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)條件下測定生成的N2體積，即可計算F. 與熒光胺反應(yīng)熒光胺熒光產(chǎn)物熒光產(chǎn)物激發(fā)波長 x = 390 nm , 發(fā)射波長 M = 475 nm ,該反應(yīng)非常靈敏（1ng），可根據(jù)熒光強度M測定氨基酸含量57蛋白質(zhì)化學(xué)醫(yī)學(xué)講座F. 與熒光胺反應(yīng)熒光胺熒光產(chǎn)物熒光產(chǎn)物激發(fā)波長 x = G. 脫氨基反應(yīng)經(jīng)相應(yīng)的氨基酸氧化酶、轉(zhuǎn)氨酶催化的反應(yīng)。58蛋白質(zhì)化學(xué)醫(yī)學(xué)講

35、座G. 脫氨基反應(yīng)經(jīng)相應(yīng)的氨基酸氧化酶、轉(zhuǎn)氨酶催化的反應(yīng)。582、-羧基參加的反應(yīng)脫羧基反應(yīng): 是生成胺類的重要反應(yīng)成鹽、成酯分別與堿、醇作用, 可用于羧基的保護(hù)成酰氯的反應(yīng)（使羧基活化）氨基被保護(hù)后，羧基可與二氯亞砜或五氯化磷反應(yīng)，生成酰氯。此反應(yīng)使氨基酸的羧基活化，易與另一個氨基酸的氨基結(jié)合，在多肽的人工合成中常用。59蛋白質(zhì)化學(xué)醫(yī)學(xué)講座2、-羧基參加的反應(yīng)成鹽、成酯59蛋白質(zhì)化學(xué)醫(yī)學(xué)講座3、 -氨基和-羧基參加的反應(yīng)（1）與茚三酮的反應(yīng) 常用于氨基酸的定性或定量檢測脯氨酸和羥脯氨酸與茚三酮反應(yīng)產(chǎn)生黃色物質(zhì)，其余所有的-氨基酸與茚三酮反應(yīng)均產(chǎn)生藍(lán)紫色物質(zhì)。 60蛋白質(zhì)化學(xué)醫(yī)學(xué)講座3、 -氨

36、基和-羧基參加的反應(yīng)（1）與茚三酮的反應(yīng)脯氨酸（2）成肽反應(yīng)這是多肽和蛋白質(zhì)生物合成的基本反應(yīng)。61蛋白質(zhì)化學(xué)醫(yī)學(xué)講座（2）成肽反應(yīng)這是多肽和蛋白質(zhì)生物合成的基本反應(yīng)。61蛋白質(zhì)（1）Tyr的酚基 在3和5 位上可發(fā)生親電取代反應(yīng)，如碘化、硝化。 Pauly反應(yīng)可用于檢測TyrTyr的酚基可以與重氮化合物，如重氮苯磺酸，結(jié)合生成橘黃色化合物橘黃色4. 側(cè)鏈R基參加的反應(yīng)62蛋白質(zhì)化學(xué)醫(yī)學(xué)講座（1）Tyr的酚基Tyr的酚基可以與重氮化合物，如重氮苯磺酸（2）His的咪唑基與重氮鹽（重氮苯磺酸）的反應(yīng)棕紅色附：咪唑基的性質(zhì) 組氨酸含有咪唑基，它的pK2值為6.0，在生理條件下具有緩沖作用。組氨酸中

37、的咪唑基能夠發(fā)生多種化學(xué)反應(yīng)。可以與ATP發(fā)生磷?；磻?yīng)，形成磷酸組氨酸，從而使酶活化。組氨酸的咪唑基也能發(fā)生烷基化反應(yīng)。生成烷基咪唑衍生物，并引起酶活性的降低或喪失63蛋白質(zhì)化學(xué)醫(yī)學(xué)講座（2）His的咪唑基與重氮鹽（重氮苯磺酸）的反應(yīng)棕紅色附：咪簡述組氨酸的作用解答：（1）His的咪唑基pK值在氨基酸和多肽鏈中分別為6.00和7.35，后者接近生理條件。故在生理條件下，咪唑基既可以作為質(zhì)子受體，又可以作為質(zhì)子供體，在pH7 附近具有明顯的緩沖能力。血紅蛋白由于含有較多的His 殘基，使其在pH7附近有明顯的緩沖能力。（2） His的咪唑基供出質(zhì)子或接受質(zhì)子的速度十分迅速，因而在很多酶的活性中

38、心均有His殘基參與（3）組氨酸中的咪唑基能夠發(fā)生多種化學(xué)反應(yīng)。可以與ATP發(fā)生磷?；磻?yīng)，形成磷酸組氨酸，從而使酶活化。（4）組氨酸的咪唑基也能發(fā)生烷基化反應(yīng)。生成烷基咪唑衍生物，并引起酶活性的降低或喪失 64蛋白質(zhì)化學(xué)醫(yī)學(xué)講座簡述組氨酸的作用64蛋白質(zhì)化學(xué)醫(yī)學(xué)講座(3) Cys巰基（-SH）參加的反應(yīng)性質(zhì)很活潑作用：這些反應(yīng)可用于巰基的保護(hù)。C6H5CH2ClA. 在弱堿性條件下，與鹵代烴（如芐氯、碘乙酰胺等）反應(yīng)，生成穩(wěn)定的烴基衍生物。65蛋白質(zhì)化學(xué)醫(yī)學(xué)講座(3) Cys巰基（-SH）參加的反應(yīng)性質(zhì)很活潑作用：這作用：與金屬離子的螯合性質(zhì)可用于體內(nèi)解毒。B. 與各種金屬離子，如對羥基汞苯

39、甲酸，形成穩(wěn)定程度不同的絡(luò)合物66蛋白質(zhì)化學(xué)醫(yī)學(xué)講座作用：與金屬離子的螯合性質(zhì)可用于體內(nèi)解毒。B. 與各種金屬離作用：氧化還原反應(yīng)可使蛋白質(zhì)分子中二硫鍵形成或 斷裂。胱氨酸+2H- 2HC. 很容易被氧化形成二硫鍵（SS）67蛋白質(zhì)化學(xué)醫(yī)學(xué)講座作用：氧化還原反應(yīng)可使蛋白質(zhì)分子中二硫鍵形成或 次磺酸sulfenic 亞磺酸sulfinic磺酸sulfonicS-nitrosothiolS-nitrothiol68蛋白質(zhì)化學(xué)醫(yī)學(xué)講座次磺酸sulfenic 亞磺酸sulfinic磺酸sulf（4）羥基參加的反應(yīng)作用：可用于修飾蛋白質(zhì)（酶）。二異丙基氟磷酸 Ser 和 Thr 的羥基能夠與酸作用形成酯

40、。在蛋白質(zhì)分子中，Ser 常與磷酸結(jié)合。 SersSer 是大多數(shù)蛋白水解酶活性中心的主要組分，多種?；噭┠芘c酶活性中心的 Ser 羥基作用，導(dǎo)致酶的失活。Ser69蛋白質(zhì)化學(xué)醫(yī)學(xué)講座（4）羥基參加的反應(yīng)作用：可用于修飾蛋白質(zhì)（酶）。二異丙基氟（一）電泳分離舉例：Glu、Leu 、His 、Lys，4種混合樣，在pH6.0時，泳動方向及相對速度。 Glu Leu His LyspI 3.22 5.98 7.59 9.74五、 氨基酸的分析分離 70蛋白質(zhì)化學(xué)醫(yī)學(xué)講座（一）電泳分離五、 氨基酸的分析分離 70蛋白質(zhì)化學(xué)蛋白質(zhì)化學(xué)醫(yī)學(xué)講座培訓(xùn)課件有效分配系數(shù)KeffKeff =某一物質(zhì)在動相中

41、的總量某一物質(zhì)在靜相中的總量72蛋白質(zhì)化學(xué)醫(yī)學(xué)講座有效分配系數(shù)KeffKeff =某一物質(zhì)在動相中的總量某一物上述逆流分溶的結(jié)果可用曲線表示逆流分溶曲線管號各管中溶質(zhì)的總含量73蛋白質(zhì)化學(xué)醫(yī)學(xué)講座上述逆流分溶的結(jié)果可用曲線表示逆流分溶曲線管號各管中溶質(zhì)的總分溶曲線與轉(zhuǎn)移次數(shù)的關(guān)系溶劑系統(tǒng)體積相對濃度74蛋白質(zhì)化學(xué)醫(yī)學(xué)講座分溶曲線與轉(zhuǎn)移次數(shù)的關(guān)系溶劑系統(tǒng)體積相對濃度74蛋白質(zhì)化學(xué)醫(yī)(二）分配柱層析可以同檢測器、記錄儀、餾分收集器、輸液泵構(gòu)成層析系統(tǒng)。75蛋白質(zhì)化學(xué)醫(yī)學(xué)講座(二）分配柱層析可以同檢測器、記錄儀、餾分收集器、輸液泵構(gòu)成(三)紙層析Rf主要與R基的極性有關(guān)，溶劑的pH可影響R基的極性，氨基酸與濾紙的吸附作用也影響Rf。76蛋白質(zhì)化學(xué)醫(yī)學(xué)講座(三)紙層析Rf主要與R基的極性有關(guān)，溶劑的pH可影響R基的紙層析中的Rf值Rf=XY溶劑前沿氨基酸顯色點濾紙原點77蛋白質(zhì)化學(xué)醫(yī)學(xué)講座紙層析中的Rf值Rf=XY溶劑前沿氨基酸顯色點濾紙原點77蛋2. 以正丁醇：乙酸：水體系為溶劑（pH4.5) ，對下列氨基酸進(jìn)行紙層析分離，指出下列各組中氨基酸的相對移動