熒光定量PCR原理和應(yīng)用-LQ課件

1、實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理及應(yīng)用劉倩December,2004實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)于1996年由美國Applied Biosystems公司推出，由于該技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規(guī)PCR相比，它具有特異性更強(qiáng)、有效解決PCR污染問題、自動化程度高等特點(diǎn)。實(shí)時(shí)定量PCR (real-time quantitative PCR)是指在PCR指數(shù)擴(kuò)增期間通過連續(xù)監(jiān)測熒光信號強(qiáng)弱的變化來即時(shí)測定特異性產(chǎn)物的量，并據(jù)此推斷目的基因的初始量，不需要取出PCR產(chǎn)物進(jìn)行分離。目前實(shí)時(shí)定量PCR作為一個(gè)極有效的實(shí)驗(yàn)方法，已被廣泛地應(yīng)用于分子生物學(xué)研究的各個(gè)領(lǐng)域。實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理實(shí)時(shí)熒光

2、定量PCR的方法應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的實(shí)驗(yàn)要素及 注意事項(xiàng)OUTLINE實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理 什么是實(shí)時(shí)熒光定量PCR熒光檢測原理三步循環(huán)：高溫變性，低溫退火，中溫延伸94 3min94 10sec60 15sec72 20secGo to 2 for 29 cycles 72 5min4 forever指數(shù)擴(kuò)增PCR（polymerase chain reaction）指數(shù)期平臺期反應(yīng)體系中加入熒光物質(zhì)熒光強(qiáng)度隨著PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的積累成比例變化通過檢測熒光信號對PCR反應(yīng)進(jìn)行實(shí)時(shí)定量監(jiān)測Opticon實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)時(shí)定量PCR與普通PCR的區(qū)別普通PCR技術(shù)： 在PCR結(jié)束后對終點(diǎn)產(chǎn)物

3、進(jìn)行定量分析。實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)：實(shí)時(shí)檢測PCR擴(kuò)增，在擴(kuò)增的指數(shù)期對起始模板進(jìn)行定量。實(shí)時(shí)熒光定量PCR如何對起始模板定量？引入兩個(gè)概念：熒光閾值：在熒光擴(kuò)增曲線指數(shù)增長的初期設(shè)定的一個(gè)熒光強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)(即PCR擴(kuò)增產(chǎn)物量的標(biāo)準(zhǔn))循環(huán)閾值 (Ct值)：PCR擴(kuò)增過程中，擴(kuò)增產(chǎn)物量(熒光強(qiáng)度）到達(dá)閾值時(shí)所經(jīng)過的循環(huán)次數(shù)18.12 +/-0.04熒光域值線 C(t) 值 18.12 +/-0.04-0.04C(t) 值-0.04指數(shù)期平臺期初始 DNA量越多, 熒光達(dá)到某一值（熒光域值）時(shí)所需要的循環(huán)數(shù)越少(Ct值越小) DNA濃度每增加1倍， Ct值減少1個(gè)循環(huán)Log濃度與Ct值呈線性關(guān)系，根據(jù)C

4、t值就可計(jì)算出樣品中所含的模板量確定初始模板的濃度公式推導(dǎo):只適用于PCR指數(shù)擴(kuò)增期：理想的PCR反應(yīng)：X=X0*2n實(shí)際的PCR反應(yīng): X=X0 (1+Ex)nn：擴(kuò)增反應(yīng)的循環(huán)次數(shù)X：第n次循環(huán)后的產(chǎn)物量X0：初始模板量Ex：擴(kuò)增效率設(shè)立標(biāo)準(zhǔn)曲線：設(shè)定閾值線，得到每條擴(kuò)增曲線的Ct值，軟件自動利用標(biāo)準(zhǔn)品的起始濃度和Ct值作出標(biāo)準(zhǔn)曲線。 .未知熒光強(qiáng)度-循環(huán)數(shù)曲線初始模板量對數(shù)-C(T)值標(biāo)準(zhǔn)曲線10410310610510210通過未知樣品的Ct值,從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該樣品的起始濃度unknown104103Unknown contains 3108 copies熒光染料類 SYBR Gr

5、een I熒光探針類 Molecular Beacon （分子信標(biāo)） TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理 熒光檢測原理SYBR Green 1 結(jié)合到雙鏈DNA的小溝部位SYBR Green 1 染料結(jié)合到雙鏈DNA后熒光信號增強(qiáng)1000倍。SYBR Green I使用方便 - 不必設(shè)計(jì)復(fù)雜的熒光探針 沒有序列特異性 - 可以用于不同的模板 便宜 靈敏SYBR Green I對引物特異性要求較高與非特異性產(chǎn)物結(jié)合， 因此必須在反應(yīng)結(jié)束后 做熔解曲線分析SYBR Green I 缺點(diǎn)熔解曲線分析通過產(chǎn)物的Tm值來確定產(chǎn)物-可區(qū)分單一產(chǎn)物、變異產(chǎn)物、多種產(chǎn)物、引物二聚體SYBR Green IMo

6、lecular BeaconsMolecular Beacons發(fā)夾型雜交探針RQ 熒光淬滅:不發(fā)光 展開:發(fā)出熒光Molecular Beacons環(huán)形結(jié)構(gòu)與目的片斷結(jié)合比莖部自身的相互配對更穩(wěn)定TACCGGGGGTTACGAACGGTAATTTTTGCCCCCAAAAQRTarget退火時(shí)探針與目的片段結(jié)合報(bào)告與淬滅基團(tuán)分離產(chǎn)生特異性熒光Molecular Beacons設(shè)計(jì)困難 既要避免產(chǎn)生強(qiáng)的背景信號，又要避免莖部雜交過強(qiáng)，影響其與模板的退火，從而影響熒光的生成 只能用于一個(gè)特定的目標(biāo)價(jià)格較高M(jìn)olecular Beacons缺點(diǎn)TaqMan 探針TaqMan水解型雜交探針目標(biāo)特異性探

7、針5 為熒光基團(tuán)， 3 為淬滅基團(tuán)5 熒光報(bào)告基團(tuán)3淬滅基團(tuán)與目標(biāo)序列互補(bǔ)TaqMan 探針探針完整時(shí)，R發(fā)射的熒光能量被Q吸收，無熒光Taq酶有5-3外切酶活性，可以水解探針RQ報(bào)告基團(tuán)淬滅基團(tuán)RQ報(bào)告基團(tuán)被淬滅FRRQ在PCR進(jìn)行中，探針與目的序列雜交RQ探針在延伸階段部分解離RQ探針被DNA聚合酶的 5端外切酶活性水解RQ解離的報(bào)告基團(tuán)發(fā)出熒光 每產(chǎn)生一條DNA鏈，就切斷一條探針每切斷一條探針，就產(chǎn)生一個(gè)單位信號信號強(qiáng)度與結(jié)合探針的DNA分子數(shù)成正比TaqMan 探針對目標(biāo)序列有很高的特異性 -特別適合于SNP檢測與 Molecular Beacons 相比引物設(shè)計(jì) 相對簡單可以在一個(gè)反

8、應(yīng)中進(jìn)行多個(gè)基因的定量重復(fù)性比較好TaqMan 探針價(jià)格較高只適合于一個(gè)特定的目標(biāo)背景高TaqMan 探針化學(xué)試劑工作原理有否淬滅劑信號檢測主要應(yīng)用范圍SYBR Green I結(jié)合于雙鏈DNA的小溝中否延伸后熔解曲線分析定量和檢測目標(biāo)基因Molecular Beacons發(fā)夾型雜交探針是復(fù)性SNP分析定量和檢測目標(biāo)基因TaqMan探針?biāo)庑碗s交探針（5-3外切）是任何步驟SNP分析定量和檢測目標(biāo)基因OUTLINE實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的實(shí)驗(yàn)要素和 注意事項(xiàng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR應(yīng)用定量：DNA定量RNA定量定性：點(diǎn)突變分析SNP分析基因型分析DNA甲基

9、化分析熔解曲線分析內(nèi)源基因拷貝數(shù)的鑒定轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)的檢測DNA定量拷貝數(shù)研究（替代Southern Blot）實(shí)時(shí)熒光定量PCR應(yīng)用RNA定量基因表達(dá)差異（替代Northern Blot)不同組織器官、不同時(shí)期、不同處理單個(gè)或多個(gè)基因地表達(dá)譜分析絕對定量與相對定量 相對定量：在被測樣本中靶序列相對于參照樣本的量的變化差異表達(dá)分析芯片評估轉(zhuǎn)基因成分含量檢測絕對定量：精確計(jì)算樣本中靶序列濃度（DNA，RNA），即通常所說的拷貝數(shù)病毒DNA或RNA的拷貝數(shù)轉(zhuǎn)基因的拷貝數(shù)絕對定量 通過標(biāo)準(zhǔn)樣品定量 絕對定量的標(biāo)準(zhǔn)樣品： 已知拷貝數(shù)的質(zhì)粒DNA，做系列稀釋。標(biāo)準(zhǔn)樣品的種類：含有和待測樣品相同擴(kuò)增片段的克

10、隆質(zhì)粒含有和待測樣品相同擴(kuò)增片段的cDNAPCR的產(chǎn)物相對定量的目的比較靶序列在不同樣本中的量的差異（倍數(shù)關(guān)系）如何實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確的相對定量？-解決模板提取過程中造成的差別-解決加樣過程中的差別如何保證不同樣品（RNA或DNA）上樣量的一致?相對定量 在細(xì)胞中的表達(dá)量或在基因組中的拷貝數(shù)恒定，受環(huán)境因素影響較小內(nèi)標(biāo)數(shù)量代表樣本中所含細(xì)胞或基因組數(shù)量對樣品量校正：目的基因數(shù)量/內(nèi)標(biāo)基因內(nèi)標(biāo)通常選用beta-actin、GAPDH基因、18s rRNA 等看家基因相對定量通過 內(nèi)標(biāo)基因定量2-c(t) 法雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法相對定量方法:2-c(t) 法公式推導(dǎo)M:目標(biāo)基因，N：內(nèi)標(biāo)基因XC(t)M=X0M*2

11、C(t)M=A(域值) (1)XC(t)N=X0N*2C(t)N=A(域值) (2)均一化 (1)/(2):X0M/X0N=2 C(t)N- C(t)M=2-C(t)X0M1/X0N1=2-C(t)1 處理1X0M2/X0N2=2-C(t)2 處理2處理2與處理1相比：(X0M2/X0N2): (X0M1/X0N1)= 2-C(t)2-C(t)1= 2-C(t)C(t)=(C(t)M2-C(t)N2)-(C(t)M1-C(t)N1)理想PCR反應(yīng)每增加一個(gè)循環(huán)產(chǎn)物增加一倍N個(gè)循環(huán)2n倍兩個(gè)樣品，C(t)值每相差1初始模板相差一倍相差N，初始模板相差2n倍比較兩個(gè)樣品差異的簡單方法： 2 C(t

12、)2-c(t) 法目標(biāo)基因內(nèi)標(biāo)基因C(t)樣本1C(t)M1C(t)N1C(t)1樣本2C(t)M2C(t)N2C(t)2C(t)C(t)值與起始模板濃度成反比：2C(t)當(dāng)有多個(gè)樣品時(shí)（如時(shí)間點(diǎn)），各樣品均一化后都與同一時(shí)間點(diǎn)相比2-c(t) 法適用范圍不要求很高的精度（預(yù)實(shí)驗(yàn)）擴(kuò)增效率較高，并且目標(biāo)基因和內(nèi)標(biāo)基因擴(kuò)增效率一致不做標(biāo)準(zhǔn)曲線，高通量檢測（芯片評估）2-c(t) 法問題與解決前提：目標(biāo)基因與內(nèi)標(biāo)基因擴(kuò)增效率一致如何判斷？-檢測目標(biāo)基因與內(nèi)標(biāo)基因在不同稀釋濃度下的C(t)以稀釋倍數(shù)的對數(shù)值對C(t)作圖，當(dāng)直線的斜率近似于0時(shí)，說明目標(biāo)基因與內(nèi)標(biāo)基因擴(kuò)增效率一致。2-c(t) 法問

13、題與解決如何保證擴(kuò)增效率一致？擴(kuò)增產(chǎn)物長度：75-300bp內(nèi)標(biāo)和目標(biāo)基因地?cái)U(kuò)增長度要接近引物設(shè)計(jì)，特異，退火溫度一致模板純度、復(fù)雜度等反應(yīng)條件優(yōu)化2-c(t) 法雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法用目標(biāo)基因和內(nèi)標(biāo)基因的標(biāo)準(zhǔn)品分別獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線參照與被測樣品同時(shí)擴(kuò)增目標(biāo)基因和內(nèi)標(biāo)基因，獲得C(t)值通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算目標(biāo)基因和內(nèi)標(biāo)基因的絕對拷貝數(shù)用內(nèi)標(biāo)基因?qū)δ繕?biāo)基因均一化均一化之后的目標(biāo)基因值相比得出處理與未處理的樣本中目標(biāo)基因的表達(dá)差異適用范圍需要很精確的結(jié)果計(jì)算擴(kuò)增效率較低目標(biāo)基因與內(nèi)標(biāo)基因擴(kuò)增效率差異較大雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法利用TaqMan技術(shù)研究ERBB2 在乳腺腫瘤組織標(biāo)本中的表達(dá)差異-雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法已知在50%的乳腺

14、腫瘤樣本中，ERBB2表達(dá)異常，因此可以作為一個(gè)檢測標(biāo)準(zhǔn)選用GAPDH作為內(nèi)標(biāo)基因FAM標(biāo)記的ERBB2探針VIC標(biāo)記的GAPDH探針標(biāo)準(zhǔn)品（質(zhì)粒）構(gòu)造標(biāo)準(zhǔn)曲線多重PCR反應(yīng)陰性對照無RNA對照（空白）無逆轉(zhuǎn)錄酶對照（監(jiān)控基因組污染）實(shí)驗(yàn)1組分儲存濃度 體積 終濃度 總RNA 1ng/l 2 l ERBB2引物探針混合液 200.5 l 0.5GAPDH引物探針混合液200.5 l 0.5QuantiTect Probe RT-PCR Master Mix 210 l QuantiTect RT Mix 0.2 l ddH2O 6.8 l 終體積 20 l 多重RT-qPCR反應(yīng)體系實(shí)驗(yàn)1RT

15、-qPCR反應(yīng)程序50 30min95 15min94 15sec60 1minPlate readGo to step 3, 39 more times10 forever實(shí)驗(yàn)1標(biāo)準(zhǔn)曲線Color 2 - VIC detection for GAPDHColor 1 FAM detection for ERBB2實(shí)驗(yàn)1樣品擴(kuò)增：正常vs腫瘤PMT1-FAM detection- ERBB2PMT2-VIC detection- GAPDH腫瘤腫瘤正常正常實(shí)驗(yàn)1實(shí)驗(yàn)結(jié)果Multiplex Reactions: C(t)Healthy RNACarcinoma28.4027.3628.4627.

16、1228.43 0.0427.24 0.17ERBB2表達(dá)Multiplex Reactions: C(t)Healthy RNACarcinoma23.2722.8123.4122.8623.34 0.1022.83 0.03GAPDH表達(dá)實(shí)驗(yàn)1HealthyRNATumorRNAGAPDHERBB210951052213024929550085730136000130800Copies ng/ l Total RNAERBB2 copies / GAPDH copies1095 / 95500 = 0.0111052 / 85730 = 0.0122130/136000 = 0.01724

17、92/130800 = 0.0197Healthy RNATumor RNA0.0110.0180.018/ 0.0111.63HealthyTissueCarc.TissueRelative Expression00.20.40.60.811.21.41.61.82實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)12-c(t) 法C(t)=4.41-5.18=-0.770.182-c(t) =1.511.93結(jié)果與雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法相近Healthy RNABBER2GAPDHC(t)28.4023.275.3128.4623.415.0528.43 0.0423.34 0.105.180.18Carcinoma RNABBER2G

18、APDHC(t)27.3622.814.5527.1222.864.2627.24 0.1722.83 0.034.41 0.21實(shí)驗(yàn)1定性分析：點(diǎn)突變分析等位基因型分析DNA甲基化分析SNP分析熔解曲線分析FRFQGVQTCSNP G/AFQGVQTForward primerReverse primerAllele-specific probeAllele-specific probe點(diǎn)突變分析雙Taqman探針法實(shí)驗(yàn)2兩條探針分別針對不同等位基因SNP placed in the center of the probe Quencher; TAMRA or MGB/NFQ*wtmutGC

19、CT點(diǎn)突變分析雙Taqman探針法實(shí)驗(yàn)2TGAA雙Taqman探針法檢測野生型和突變型雜合體個(gè)體的DNA擴(kuò)增產(chǎn)物則可同時(shí)與VIC和FAM標(biāo)記的探針結(jié)合同型突變型個(gè)體的擴(kuò)增DNA只與VIC或FAM標(biāo)記的探針結(jié)合野生型 (純合子) 突變型(純合子) 雜合型實(shí)驗(yàn)2實(shí)驗(yàn)2等位基因型分析的原理與點(diǎn)突變分析方法相同SNP分析：SNPs，即單核苷酸多態(tài)性，這種人類最常見的可遺傳變異占據(jù)了所有已知多態(tài)性的90%以上，因此作為研究個(gè)體對不同疾病的易感性或者個(gè)體對特定藥物的不同反應(yīng)有著重要的意義，也因此國際人類基因研究學(xué)會花費(fèi)大量的資金來完成人類單體型圖譜。SNP分析從根本上來說其實(shí)就是確定一對染色體的每種基因的

20、兩個(gè)拷貝，哪種點(diǎn)突變在這兩個(gè)拷貝中存在，因此利用定量PCR方法，并配合芯片技術(shù)可以快速靈敏的檢測到SNP結(jié)果。ABI號稱有數(shù)以千記的定量PCR試劑盒，自然在這方面也不會留下空白，TaqMan SNP Genotyping Assays包含了一百萬的HapMap SNPs（人類單核苷酸多態(tài)性圖譜SNPs），方便SNP分型高通量研究。DNA甲基化分析：CG 島內(nèi)胞嘧啶的甲基化形成 5-甲基胞嘧啶被認(rèn)為和許多人類疾病特別是癌癥有關(guān)。Laird 等人利用一種被稱作 Methylight 的技術(shù)。 Methylight 是一種基于 Taqman 探針的甲基化特異定量 PCR 技術(shù)。在擴(kuò)增之前先處理 DN

21、A ，使得未甲基化的胞嘧啶變成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不受影響，用特異性的引物和 Taqman 探針來區(qū)分甲基化和非甲基化的 DNA ，這種方法不僅方便而且靈敏度更高。特異的引物和 Taqman 探針被用來區(qū)分甲基化和非甲基化的 DNA 。和其它實(shí)時(shí) PCR 方法一樣，Methylight無需電泳，因而提高了反應(yīng)的靈敏性和通量。這種方法的靈敏性在食道癌病人血液中癌細(xì)胞異常甲基化的DNA檢測中被證明。熔解曲線分析 HRM（High Resolution Melt）是一種最新（2007年開發(fā)出來）的遺傳學(xué)分析手段 每一段DNA都有其獨(dú)特的序列，包括長度、GC含量及堿基的互補(bǔ)性差異，這樣每個(gè)DNA片

22、段都有獨(dú)特的熔解曲線形狀 HRM曲線是根據(jù)擴(kuò)增子（amplicon）中的堿基差異（包括缺失、增加、或單堿基變化）的溶解曲線進(jìn)行高分辨處理后區(qū)分的，精度達(dá)到單堿基差異。 Identical reaction components, except initial template concentration varies10,000 copiesNon-specific productAmpliconAmplicon10 copies熔解曲線分析SYBR Green I通過產(chǎn)物的Tm值來確定產(chǎn)物-可區(qū)分單一產(chǎn)物、變異產(chǎn)物、多種產(chǎn)物、引物二聚體10,000 copies10 copies0 copi

23、es Melting curve resultsAmplification results1. 95oC for 5 min2. 94oC for 10 sec3. 63oC for 15 sec4. 72oC for 30 sec5. Plate Read6. 84oC for 1 sec7. Plate Read8. Go to line 2 39 more times9. Melting curve from 65oC to 95oC, read every 0.2oC, hold 1 sec.熔解曲線分析實(shí)驗(yàn)31. 95oC for 5 min2. 94oC for 10 sec3. 63oC for 15 sec4. 72oC for 3