熒光定量PCR原理和應用-LQ課件

1、實時熒光定量PCR原理及應用劉倩December,2004實時熒光定量PCR技術于1996年由美國Applied Biosystems公司推出，由于該技術不僅實現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規(guī)PCR相比，它具有特異性更強、有效解決PCR污染問題、自動化程度高等特點。實時定量PCR (real-time quantitative PCR)是指在PCR指數(shù)擴增期間通過連續(xù)監(jiān)測熒光信號強弱的變化來即時測定特異性產物的量，并據(jù)此推斷目的基因的初始量，不需要取出PCR產物進行分離。目前實時定量PCR作為一個極有效的實驗方法，已被廣泛地應用于分子生物學研究的各個領域。實時熒光定量PCR原理實時熒光

2、定量PCR的方法應用實時熒光定量PCR的實驗要素及 注意事項OUTLINE實時熒光定量PCR原理 什么是實時熒光定量PCR熒光檢測原理三步循環(huán)：高溫變性，低溫退火，中溫延伸94 3min94 10sec60 15sec72 20secGo to 2 for 29 cycles 72 5min4 forever指數(shù)擴增PCR（polymerase chain reaction）指數(shù)期平臺期反應體系中加入熒光物質熒光強度隨著PCR擴增產物的積累成比例變化通過檢測熒光信號對PCR反應進行實時定量監(jiān)測Opticon實時定量PCR實時定量PCR與普通PCR的區(qū)別普通PCR技術： 在PCR結束后對終點產物

3、進行定量分析。實時定量PCR技術：實時檢測PCR擴增，在擴增的指數(shù)期對起始模板進行定量。實時熒光定量PCR如何對起始模板定量？引入兩個概念：熒光閾值：在熒光擴增曲線指數(shù)增長的初期設定的一個熒光強度標準(即PCR擴增產物量的標準)循環(huán)閾值 (Ct值)：PCR擴增過程中，擴增產物量(熒光強度）到達閾值時所經(jīng)過的循環(huán)次數(shù)18.12 +/-0.04熒光域值線 C(t) 值 18.12 +/-0.04-0.04C(t) 值-0.04指數(shù)期平臺期初始 DNA量越多, 熒光達到某一值（熒光域值）時所需要的循環(huán)數(shù)越少(Ct值越小) DNA濃度每增加1倍， Ct值減少1個循環(huán)Log濃度與Ct值呈線性關系，根據(jù)C

4、t值就可計算出樣品中所含的模板量確定初始模板的濃度公式推導:只適用于PCR指數(shù)擴增期：理想的PCR反應：X=X0*2n實際的PCR反應: X=X0 (1+Ex)nn：擴增反應的循環(huán)次數(shù)X：第n次循環(huán)后的產物量X0：初始模板量Ex：擴增效率設立標準曲線：設定閾值線，得到每條擴增曲線的Ct值，軟件自動利用標準品的起始濃度和Ct值作出標準曲線。 .未知熒光強度-循環(huán)數(shù)曲線初始模板量對數(shù)-C(T)值標準曲線10410310610510210通過未知樣品的Ct值,從標準曲線上計算出該樣品的起始濃度unknown104103Unknown contains 3108 copies熒光染料類 SYBR Gr

5、een I熒光探針類 Molecular Beacon （分子信標） TaqMan實時熒光定量PCR原理 熒光檢測原理SYBR Green 1 結合到雙鏈DNA的小溝部位SYBR Green 1 染料結合到雙鏈DNA后熒光信號增強1000倍。SYBR Green I使用方便 - 不必設計復雜的熒光探針 沒有序列特異性 - 可以用于不同的模板 便宜 靈敏SYBR Green I對引物特異性要求較高與非特異性產物結合， 因此必須在反應結束后 做熔解曲線分析SYBR Green I 缺點熔解曲線分析通過產物的Tm值來確定產物-可區(qū)分單一產物、變異產物、多種產物、引物二聚體SYBR Green IMo

6、lecular BeaconsMolecular Beacons發(fā)夾型雜交探針RQ 熒光淬滅:不發(fā)光 展開:發(fā)出熒光Molecular Beacons環(huán)形結構與目的片斷結合比莖部自身的相互配對更穩(wěn)定TACCGGGGGTTACGAACGGTAATTTTTGCCCCCAAAAQRTarget退火時探針與目的片段結合報告與淬滅基團分離產生特異性熒光Molecular Beacons設計困難 既要避免產生強的背景信號，又要避免莖部雜交過強，影響其與模板的退火，從而影響熒光的生成 只能用于一個特定的目標價格較高Molecular Beacons缺點TaqMan 探針TaqMan水解型雜交探針目標特異性探

7、針5 為熒光基團， 3 為淬滅基團5 熒光報告基團3淬滅基團與目標序列互補TaqMan 探針探針完整時，R發(fā)射的熒光能量被Q吸收，無熒光Taq酶有5-3外切酶活性，可以水解探針RQ報告基團淬滅基團RQ報告基團被淬滅FRRQ在PCR進行中，探針與目的序列雜交RQ探針在延伸階段部分解離RQ探針被DNA聚合酶的 5端外切酶活性水解RQ解離的報告基團發(fā)出熒光 每產生一條DNA鏈，就切斷一條探針每切斷一條探針，就產生一個單位信號信號強度與結合探針的DNA分子數(shù)成正比TaqMan 探針對目標序列有很高的特異性 -特別適合于SNP檢測與 Molecular Beacons 相比引物設計 相對簡單可以在一個反

8、應中進行多個基因的定量重復性比較好TaqMan 探針價格較高只適合于一個特定的目標背景高TaqMan 探針化學試劑工作原理有否淬滅劑信號檢測主要應用范圍SYBR Green I結合于雙鏈DNA的小溝中否延伸后熔解曲線分析定量和檢測目標基因Molecular Beacons發(fā)夾型雜交探針是復性SNP分析定量和檢測目標基因TaqMan探針水解型雜交探針（5-3外切）是任何步驟SNP分析定量和檢測目標基因OUTLINE實時熒光定量PCR原理實時熒光定量PCR的方法應用實時熒光定量PCR的實驗要素和 注意事項實時熒光定量PCR應用定量：DNA定量RNA定量定性：點突變分析SNP分析基因型分析DNA甲基

9、化分析熔解曲線分析內源基因拷貝數(shù)的鑒定轉基因拷貝數(shù)的檢測DNA定量拷貝數(shù)研究（替代Southern Blot）實時熒光定量PCR應用RNA定量基因表達差異（替代Northern Blot)不同組織器官、不同時期、不同處理單個或多個基因地表達譜分析絕對定量與相對定量 相對定量：在被測樣本中靶序列相對于參照樣本的量的變化差異表達分析芯片評估轉基因成分含量檢測絕對定量：精確計算樣本中靶序列濃度（DNA，RNA），即通常所說的拷貝數(shù)病毒DNA或RNA的拷貝數(shù)轉基因的拷貝數(shù)絕對定量 通過標準樣品定量 絕對定量的標準樣品： 已知拷貝數(shù)的質粒DNA，做系列稀釋。標準樣品的種類：含有和待測樣品相同擴增片段的克

10、隆質粒含有和待測樣品相同擴增片段的cDNAPCR的產物相對定量的目的比較靶序列在不同樣本中的量的差異（倍數(shù)關系）如何實現(xiàn)準確的相對定量？-解決模板提取過程中造成的差別-解決加樣過程中的差別如何保證不同樣品（RNA或DNA）上樣量的一致?相對定量 在細胞中的表達量或在基因組中的拷貝數(shù)恒定，受環(huán)境因素影響較小內標數(shù)量代表樣本中所含細胞或基因組數(shù)量對樣品量校正：目的基因數(shù)量/內標基因內標通常選用beta-actin、GAPDH基因、18s rRNA 等看家基因相對定量通過 內標基因定量2-c(t) 法雙標準曲線法相對定量方法:2-c(t) 法公式推導M:目標基因，N：內標基因XC(t)M=X0M*2

11、C(t)M=A(域值) (1)XC(t)N=X0N*2C(t)N=A(域值) (2)均一化 (1)/(2):X0M/X0N=2 C(t)N- C(t)M=2-C(t)X0M1/X0N1=2-C(t)1 處理1X0M2/X0N2=2-C(t)2 處理2處理2與處理1相比：(X0M2/X0N2): (X0M1/X0N1)= 2-C(t)2-C(t)1= 2-C(t)C(t)=(C(t)M2-C(t)N2)-(C(t)M1-C(t)N1)理想PCR反應每增加一個循環(huán)產物增加一倍N個循環(huán)2n倍兩個樣品，C(t)值每相差1初始模板相差一倍相差N，初始模板相差2n倍比較兩個樣品差異的簡單方法： 2 C(t

12、)2-c(t) 法目標基因內標基因C(t)樣本1C(t)M1C(t)N1C(t)1樣本2C(t)M2C(t)N2C(t)2C(t)C(t)值與起始模板濃度成反比：2C(t)當有多個樣品時（如時間點），各樣品均一化后都與同一時間點相比2-c(t) 法適用范圍不要求很高的精度（預實驗）擴增效率較高，并且目標基因和內標基因擴增效率一致不做標準曲線，高通量檢測（芯片評估）2-c(t) 法問題與解決前提：目標基因與內標基因擴增效率一致如何判斷？-檢測目標基因與內標基因在不同稀釋濃度下的C(t)以稀釋倍數(shù)的對數(shù)值對C(t)作圖，當直線的斜率近似于0時，說明目標基因與內標基因擴增效率一致。2-c(t) 法問

13、題與解決如何保證擴增效率一致？擴增產物長度：75-300bp內標和目標基因地擴增長度要接近引物設計，特異，退火溫度一致模板純度、復雜度等反應條件優(yōu)化2-c(t) 法雙標準曲線法用目標基因和內標基因的標準品分別獲得標準曲線參照與被測樣品同時擴增目標基因和內標基因，獲得C(t)值通過標準曲線計算目標基因和內標基因的絕對拷貝數(shù)用內標基因對目標基因均一化均一化之后的目標基因值相比得出處理與未處理的樣本中目標基因的表達差異適用范圍需要很精確的結果計算擴增效率較低目標基因與內標基因擴增效率差異較大雙標準曲線法利用TaqMan技術研究ERBB2 在乳腺腫瘤組織標本中的表達差異-雙標準曲線法已知在50%的乳腺

14、腫瘤樣本中，ERBB2表達異常，因此可以作為一個檢測標準選用GAPDH作為內標基因FAM標記的ERBB2探針VIC標記的GAPDH探針標準品（質粒）構造標準曲線多重PCR反應陰性對照無RNA對照（空白）無逆轉錄酶對照（監(jiān)控基因組污染）實驗1組分儲存濃度 體積 終濃度 總RNA 1ng/l 2 l ERBB2引物探針混合液 200.5 l 0.5GAPDH引物探針混合液200.5 l 0.5QuantiTect Probe RT-PCR Master Mix 210 l QuantiTect RT Mix 0.2 l ddH2O 6.8 l 終體積 20 l 多重RT-qPCR反應體系實驗1RT

15、-qPCR反應程序50 30min95 15min94 15sec60 1minPlate readGo to step 3, 39 more times10 forever實驗1標準曲線Color 2 - VIC detection for GAPDHColor 1 FAM detection for ERBB2實驗1樣品擴增：正常vs腫瘤PMT1-FAM detection- ERBB2PMT2-VIC detection- GAPDH腫瘤腫瘤正常正常實驗1實驗結果Multiplex Reactions: C(t)Healthy RNACarcinoma28.4027.3628.4627.

16、1228.43 0.0427.24 0.17ERBB2表達Multiplex Reactions: C(t)Healthy RNACarcinoma23.2722.8123.4122.8623.34 0.1022.83 0.03GAPDH表達實驗1HealthyRNATumorRNAGAPDHERBB210951052213024929550085730136000130800Copies ng/ l Total RNAERBB2 copies / GAPDH copies1095 / 95500 = 0.0111052 / 85730 = 0.0122130/136000 = 0.01724

17、92/130800 = 0.0197Healthy RNATumor RNA0.0110.0180.018/ 0.0111.63HealthyTissueCarc.TissueRelative Expression00.20.40.60.811.21.41.61.82實驗結果實驗12-c(t) 法C(t)=4.41-5.18=-0.770.182-c(t) =1.511.93結果與雙標準曲線法相近Healthy RNABBER2GAPDHC(t)28.4023.275.3128.4623.415.0528.43 0.0423.34 0.105.180.18Carcinoma RNABBER2G

18、APDHC(t)27.3622.814.5527.1222.864.2627.24 0.1722.83 0.034.41 0.21實驗1定性分析：點突變分析等位基因型分析DNA甲基化分析SNP分析熔解曲線分析FRFQGVQTCSNP G/AFQGVQTForward primerReverse primerAllele-specific probeAllele-specific probe點突變分析雙Taqman探針法實驗2兩條探針分別針對不同等位基因SNP placed in the center of the probe Quencher; TAMRA or MGB/NFQ*wtmutGC

19、CT點突變分析雙Taqman探針法實驗2TGAA雙Taqman探針法檢測野生型和突變型雜合體個體的DNA擴增產物則可同時與VIC和FAM標記的探針結合同型突變型個體的擴增DNA只與VIC或FAM標記的探針結合野生型 (純合子) 突變型(純合子) 雜合型實驗2實驗2等位基因型分析的原理與點突變分析方法相同SNP分析：SNPs，即單核苷酸多態(tài)性，這種人類最常見的可遺傳變異占據(jù)了所有已知多態(tài)性的90%以上，因此作為研究個體對不同疾病的易感性或者個體對特定藥物的不同反應有著重要的意義，也因此國際人類基因研究學會花費大量的資金來完成人類單體型圖譜。SNP分析從根本上來說其實就是確定一對染色體的每種基因的

20、兩個拷貝，哪種點突變在這兩個拷貝中存在，因此利用定量PCR方法，并配合芯片技術可以快速靈敏的檢測到SNP結果。ABI號稱有數(shù)以千記的定量PCR試劑盒，自然在這方面也不會留下空白，TaqMan SNP Genotyping Assays包含了一百萬的HapMap SNPs（人類單核苷酸多態(tài)性圖譜SNPs），方便SNP分型高通量研究。DNA甲基化分析：CG 島內胞嘧啶的甲基化形成 5-甲基胞嘧啶被認為和許多人類疾病特別是癌癥有關。Laird 等人利用一種被稱作 Methylight 的技術。 Methylight 是一種基于 Taqman 探針的甲基化特異定量 PCR 技術。在擴增之前先處理 DN

21、A ，使得未甲基化的胞嘧啶變成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不受影響，用特異性的引物和 Taqman 探針來區(qū)分甲基化和非甲基化的 DNA ，這種方法不僅方便而且靈敏度更高。特異的引物和 Taqman 探針被用來區(qū)分甲基化和非甲基化的 DNA 。和其它實時 PCR 方法一樣，Methylight無需電泳，因而提高了反應的靈敏性和通量。這種方法的靈敏性在食道癌病人血液中癌細胞異常甲基化的DNA檢測中被證明。熔解曲線分析 HRM（High Resolution Melt）是一種最新（2007年開發(fā)出來）的遺傳學分析手段 每一段DNA都有其獨特的序列，包括長度、GC含量及堿基的互補性差異，這樣每個DNA片

22、段都有獨特的熔解曲線形狀 HRM曲線是根據(jù)擴增子（amplicon）中的堿基差異（包括缺失、增加、或單堿基變化）的溶解曲線進行高分辨處理后區(qū)分的，精度達到單堿基差異。 Identical reaction components, except initial template concentration varies10,000 copiesNon-specific productAmpliconAmplicon10 copies熔解曲線分析SYBR Green I通過產物的Tm值來確定產物-可區(qū)分單一產物、變異產物、多種產物、引物二聚體10,000 copies10 copies0 copi

23、es Melting curve resultsAmplification results1. 95oC for 5 min2. 94oC for 10 sec3. 63oC for 15 sec4. 72oC for 30 sec5. Plate Read6. 84oC for 1 sec7. Plate Read8. Go to line 2 39 more times9. Melting curve from 65oC to 95oC, read every 0.2oC, hold 1 sec.熔解曲線分析實驗31. 95oC for 5 min2. 94oC for 10 sec3. 63oC for 15 sec4. 72oC for 3