酵母雙雜交文庫篩選與蛋白互作驗證服務(wù)

1、酵母雙雜交技術(shù)是研究蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的一種蛋白組學(xué)方法，是基于對真核生物的 轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控轉(zhuǎn)錄起始過程的認(rèn)識而發(fā)明的技術(shù)。其基本原理是利用真核生物酵母的轉(zhuǎn)錄激 活因子Gal4可分為結(jié)構(gòu)上分開并且功能獨立的兩個結(jié)構(gòu)域：N端1-147aaDNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DNAbindingdomain,BD)和 C 端 768-881aa 轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(Activation Domain,AD)，Gal4 的N端和C端可以分開構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒，將N端和誘餌蛋白(研究的目標(biāo)蛋白A)融合表達(dá)，C端和細(xì)胞cDNA或者獵物蛋白X融合表達(dá)，如果cDNA編碼的蛋白x能和A互相作用，就 能把Gal4的C端和N端聯(lián)系在一起，

2、形成轉(zhuǎn)錄因子，激活UAS下游的基因表達(dá)，原理如圖 1所示。圖 1 酵母雙雜交技術(shù)原理圖(引自 MATCHMAKER GAL4 Two-Hybrid System 3&Libraries User Manual).公司選用的是美國Clontech公司(現(xiàn)為Takara公司收購)的MatchMaker系列酵母 雙雜交系統(tǒng)，所用的AH109, Y187酵母菌株，是通過基因工程的方法突變了內(nèi)源Gal4轉(zhuǎn)錄 因子的工程菌株，并在GAL4 UASs和啟動子的下游構(gòu)建了 3個報道基因-ADE2，HIS3，MEL1(或LacZ)，因此可以通過營養(yǎng)缺陷和顯色報告基因的表達(dá)來篩選或驗證兩個蛋白之間是否存在相互作用

3、。菌株信息如圖2所示。TABLE 1. MATCHMAKER VEAST STRAIN GENOTYPESStMtnGenoiype3F?eference$AHW9b0 -皿心$ 10 ura3-&2 $3-200, gai4AtLYS2: GALJ-GAL 1T.v-HfS3tGALg-GAL2taADEZURA3 ： MEL -MEL 板腿已 MEL 1Our unpublished observations107ura3-52r his3-200r de2-1Q1, trpl-901,URA3:區(qū) IgGHL 臨盤球岫 7Harper er M, 1993AH149 Conskct$ME

4、LI IMS弓I ll MATCHMAKER GAL4 Two-Hybrid System J&Libianes U;er Manual(clontedi)曲LI TATAGA11 UASGAL2 瞄 GALHATA MELI UASMEM TATAJU EllMELI TATA所用表達(dá)載體信息如下引自 MATCHMAKER GAL4 Two-Hyb-rid Sy&tenn 3&Ub舊AH149 Conskct$MELI IMS弓I ll MATCHMAKER GAL4 Two-Hybrid System J&Libianes U;er Manual(clontedi)曲LI TATAGA11

5、 UASGAL2 瞄 GALHATA MELI UASMEM TATAJU EllMELI TATA所用表達(dá)載體信息如下引自 MATCHMAKER GAL4 Two-Hyb-rid Sy&tenn 3&Ub舊ri晤山審 Mm#洲般四策h(yuǎn))H海 III*SVVtJLS pGADTZ wmd 8.0 hb HA 書 piiopoi巡Hindll 0伽IIImil 火，以Hi冏II|HIIpGBKn 5 7 3 kbpvc 0fi 酵母雙雜交技術(shù)優(yōu)點：高效:轉(zhuǎn)化方法簡單，轉(zhuǎn)化效率高，便于操作。靈敏可檢測蛋白質(zhì)之間的微弱作用。真 實:酵母細(xì)胞是真核細(xì)胞，融合蛋白之間的相互作用是在真核細(xì)胞核內(nèi)進(jìn)行的,蛋

6、白質(zhì)經(jīng)過翻 譯后的修飾，多數(shù)可以保持蛋白質(zhì)的天然空間構(gòu)象和折疊狀態(tài)接近其真實的生理狀態(tài)，一定 程度上可代表其在細(xì)胞內(nèi)真實情況。簡捷:只需要構(gòu)建誘餌表達(dá)載體，可以省略蛋白質(zhì)抽提 純化或抗體制備的繁瑣步驟。酵母雙雜交服務(wù)內(nèi)容介紹：酵母雙雜交cDNA文庫構(gòu)建：服務(wù)內(nèi)容：總RNA提取、純化一mRNA分離一cDNA制備一cDNA連接AD載體一連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌-cDNA文庫效價測定一cDNA文庫擴(kuò)增一cDNA文庫擴(kuò)增后的質(zhì)粒DNA純化一純化后cDNA 文庫質(zhì)量的鑒定（如PCR和酶切鑒定等方法）等合作方式：為客戶構(gòu)建指定的酵母雙雜交基因文庫。由客戶提供cDNA或組織、細(xì)胞等。服務(wù)完成時提供詳細(xì)的實驗報告

7、以及文庫酵母雙雜交技術(shù)從cDNA文庫中篩選相互作用蛋白：服務(wù)內(nèi)容：l誘餌質(zhì)粒的構(gòu)建及自激活作用和蛋白毒性檢測l組織cDNA文庫的構(gòu)建（或客戶提供）l酵母接合效率的計算及接合后初步陽性克隆篩選的統(tǒng)計l陽性克隆文庫質(zhì)粒的提取，轉(zhuǎn)化酵母后自激活作用檢測l酵母雙雜交篩選結(jié)果的質(zhì)?；剞D(zhuǎn)驗證結(jié)果l陽性克隆文庫質(zhì)粒的提取，轉(zhuǎn)化細(xì)菌，測序及登陸NCBI等網(wǎng)站進(jìn)行序列比對，公布最 終篩選結(jié)果合作方式：為客戶對指定的基因文庫進(jìn)行酵母雙雜交篩選，篩選完成后向客戶提供詳細(xì)的篩選報告和陽 性克隆實物，客戶需要提供誘餌基因信息。酵母雙雜交技術(shù)檢測指定蛋白對之間的相互作用：技術(shù)服務(wù)內(nèi)容：l誘餌蛋白表達(dá)載體與獵物蛋白表達(dá)載體

8、的構(gòu)建l表達(dá)載體轉(zhuǎn)化酵母的驗證及自激活活性，毒性檢測l誘餌蛋白質(zhì)粒與獵物蛋白質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化酵母的驗證以及相互作用的檢測報告l 無相互作用時誘餌和獵物蛋白的表達(dá)情況的Western blotting檢測合作方式：為客戶對指定的2個或多個蛋白之間進(jìn)行酵母雙雜交實驗，驗證其相互作用。由客戶提供基 因克隆，抗體，或從公司購買抗體。實驗完成后向客戶提供詳細(xì)的實驗報告和相互作用陽性 的酵母共轉(zhuǎn)化菌株。部分實驗案例圖示ioaob|i，海p 50Ob圖2. 4個C盛片段的PCR圖諸圖3一 4個。或US1片段誘餌載體 的酶切鑒定圖諸丑-b.p皿即5000 皿201075-u oooo o 0505Q 0752圖g

9、16種共轉(zhuǎn)化ORUSl誘餌載怵與。站適2 J獵物載體的酵母AH109菌落的PCR驗證5656Os02g5024096.89%67Os06g4064099.76%65Os02g4652022Os05g40180putative, expressed45Os04g5424038Os05g11320克隆編號相似序列登錄號蛋白功能描述相似百分比glutamine synthetase, catalytic domain containing protein,expressedfructose-bisphospatealdolaseisozyme, putative, expressedhydrolase, putative,expressed 95.22% serine/threonine-protein kinase stt7, chloroplast precursor,77.27%wou