三章-高效液相色譜分析課件

1、3.1 高效液相色譜概述高效液相色譜High Performance Liquid Chromatography，HPLC或高壓液相色譜High Pressure Liquid Chromatography 或高速液相色譜High Speed Liquid Chromatography是在經(jīng)典的柱層析、薄層層析和氣相色譜的基礎(chǔ)上發(fā)展起來第三章 高效液相色譜法3.1 高效液相色譜概述高效液相色譜第三章 高效液相色譜1、 HPLC與經(jīng)典LC區(qū)別主要區(qū)別：固定相差別，輸液設(shè)備和檢測手段 區(qū)別固定相差別輸液設(shè)備檢測手段用途LC柱內(nèi)徑13cm，固定相粒徑 100m 且不均勻常壓輸送流動相 ；柱效低(H,

2、 n)分析周期長、無法在線檢測僅做為一種分離手段HPLC柱內(nèi)徑26mm，固定相粒徑BC正相（極性柱）與反相（非極性柱）的練習(xí)正相色譜-低極性流動相 正相色譜-中極性流動相反二、液-固吸附色譜liquid- solid adsorption chromatograph基本原理：各組分在固定相吸附劑上競爭性吸附與解吸缺點(diǎn)：非線形等溫吸附常引起峰的拖尾固定相：固體吸附劑如硅膠、氧化鋁等，較常使用的是510m的硅膠吸附劑；流動相：各種不同極性的一元或多元溶劑。特點(diǎn)：適用于分離相對分子質(zhì)量中等的油溶性試樣，對具有官能團(tuán)的化合物和異構(gòu)體有較高選擇性；二、液-固吸附色譜liquid- solid adsor

3、p三、離子對色譜ion-pair chromatograph基本原理：離子對色譜法是分離分析強(qiáng)極性有機(jī)酸和有機(jī)堿的極好方法。將一種（或多種）與溶質(zhì)離子電荷相反的離子（對離子或反離子）加到流動相中使其與溶質(zhì)離子結(jié)合形成疏水性離子對化合物，控制溶質(zhì)離子的保留行為使其兩相之間進(jìn)行分配；陰離子分離：常采用烷基銨類，如氫氧化四丁基銨或氫氧化十六烷基三甲銨作為對離子；陽離子分離：常采用烷基磺酸類，如己烷磺酸鈉作為對離子 反相離子對色譜：非極性的疏水固定相(C-18柱)，含有對離子Y+的甲醇-水或乙腈-水作為流動相，試樣離子X- 進(jìn)入流動相后，生成疏水性離子對Y+ X -在兩相間分配。三、離子對色譜ion-

4、pair chromatograp檸檬酸根的離子對色譜分離檸檬酸3-在酸性條件下與磷酸三丁酸反應(yīng)生成具有一定疏水性絡(luò)合物用C-18柱分離堿性條件下絡(luò)合物解離。檸檬酸 = 檸檬酸3- + 3H+ (water)檸檬酸 +磷酸三丁酸 =檸檬酸-磷酸三丁酸(organic)堿性酸性Question：檸檬酸3-用離子交換色譜分離？檸檬酸根的離子對色譜分離檸檬酸3-在酸性條件下與磷酸三丁酸反四、離子交換色譜ion-exchange chromatograph基本原理：組分在固定相上發(fā)生的反復(fù)離子交換反應(yīng)；組分與離子交換樹脂（固定相）之間親和力的大小與離子半徑、電荷、存在形式等有關(guān)。親和力大，保留時間長；

5、 陽離子交換：RSO3Na +M+ = RSO3 M + Na + 陰離子交換：RNR4Cl +X- = RNR4 X + Cl-固定相：陰離子離子交換樹脂或陽離子離子交換樹脂；應(yīng)用：離子及可離解的化合物、氨基酸、核酸等。四、離子交換色譜ion-exchange chromato五、離子色譜ion chromatograph離子色譜法是由離子交換色譜法派生出來的一種分離方法。由于離子交換色譜法在無機(jī)離子的分析和應(yīng)用受到限制。例如，對于那些不能采用紫外檢測器的被測離子，如采用電導(dǎo)檢測器，由于被測離子的電導(dǎo)信號被強(qiáng)電解質(zhì)流動相的高背景電導(dǎo)信號掩沒而無法檢測。陰離子交換：ROH + Na+Br- R

6、Br + Na+OH-為了解決這一問題，1975年Small等人提出一種能同時測定多種無機(jī)和有機(jī)離子的新技術(shù)。他們在離子交換分離柱后加一根抑制柱，抑制柱中裝填與分離柱電荷相反的離子交換樹脂五、離子色譜ion chromatograph離子色譜法五、離子色譜ion chromatograph 陽離子交換：RH + Na+OH- RNa + H2O RH + Na+Br- RNa + H+Br- 使具有高背景電導(dǎo)的流動相轉(zhuǎn)變成低背景電導(dǎo)的流動相，從而用電導(dǎo)檢測器可直接檢測各種離子的含量。這種色譜技術(shù)稱為離子色譜。 若樣品為陽離子，用無機(jī)酸作流動相，抑制柱為高容量的強(qiáng)堿性陰離子交換劑。五、離子色譜i

7、on chromatograph 陽離子交六、排阻色譜size- exclusion chromatograph原理：又稱凝膠色譜法，主要用于較大分子的分離。與其他液相色譜方法原理不同，它不具有吸附、分配和離子交換作用機(jī)理，而是基于試樣分子的尺寸和形狀不同來實(shí)現(xiàn)分離的。小分子可以擴(kuò)散到凝膠空隙，由其中通過，出峰最慢；中等分子只能通過部分凝膠空隙，中速通過；而大分子被排斥在外，出峰最快；溶劑分子小，故在最后出峰。固定相：凝膠(具有一定大小孔隙分布)；可對相對分子質(zhì)量在103-105范圍內(nèi)的化合物按質(zhì)量分離六、排阻色譜size- exclusion chroma3.4 液相色譜法固定相固定相：又稱

8、柱填料，常用高效填料510m（細(xì)粒度有利于減小渦流擴(kuò)散效應(yīng)，縮短溶質(zhì)在兩相間傳質(zhì)擴(kuò)散過程）HPLC：流動相為有機(jī)溶劑或水溶液，一定線速度下，流動相對固定相表面有相當(dāng)大的沖刷能力，且?guī)缀鯖]有一對完全互不溶解的液體存在固定相流失嚴(yán)重化學(xué)鍵合固定相通過化學(xué)反應(yīng)把某個適當(dāng)?shù)墓倌軋F(tuán)引入硅膠表面各種類型的化學(xué)鍵合固定相占了將近78廣泛地、大量使用不被溶劑抽提的，以微粒硅膠為基質(zhì)的化學(xué)鍵合固定相，是近代HPLC填料的又一特點(diǎn)3.4 液相色譜法固定相固定相：又稱柱填料，常用高效填料固定相的分類多糖骨架微粒硅膠1、按化學(xué)組成分類交聯(lián)葡聚糖凝膠交聯(lián)瓊脂糖凝膠苯乙烯與二乙烯基苯共聚物、聚乙烯醇高分子微球微粒多孔碳2

9、、結(jié)構(gòu)和形狀薄殼型全孔型3-4 液相色譜法固定相固定相的分類多糖骨架微粒硅膠1、按化學(xué)組成分類交聯(lián)葡聚糖凝膠3-5 液相色譜法流動相又稱沖洗劑、洗脫劑或載液流動相作用攜帶樣品前進(jìn)給樣品提供一個分配相調(diào)節(jié)選擇性，使混合物滿意分離流動相選擇要考慮分離、檢測、輸液系統(tǒng)的承受能力及色譜分離目的等各個方面與氣相色譜法不同，當(dāng)固定相選定時，流動相的種類、配比可顯著改變組分分離狀況3-5 液相色譜法流動相又稱沖洗劑、洗脫劑或載液流動相作HPLC對流動相要求流動相要求黏度小提高液相傳質(zhì)（柱效）降低柱壓降對試樣溶解度適宜與檢測器相適應(yīng) 對紫外光度檢測器而言，不能用對紫外光有吸收的溶劑溶劑的純度HPLC對流動相要

10、求流動相要求黏度小提高液相傳質(zhì)（柱效）降低流動相分類 按流動相組成分：單組分和多組分； 按極性分：極性、弱極性、非極性； 按使用方式分：固定組成淋洗和梯度淋洗第三章-高效液相色譜分析課件常用溶劑的極性順序：水、酰胺、腈、醇、酮、酯、醚、烴類, etc.常用溶劑：水、乙腈、乙醇、乙酸乙酯、甲苯、四氯化碳、己烷。通常根據(jù)所起的作用，流動相可分為：底劑及洗脫劑兩種底劑：決定基本的色譜分離情況；洗脫劑：調(diào)節(jié)試樣組分的滯留并對幾個組分具有選擇性的分離作用采用二元或多元組合溶劑作為流動相可以靈活調(diào)節(jié)流動相的極性或增加選擇性，以改進(jìn)分離或調(diào)整出峰時間。流動相選擇流動相選擇1. 液液分配色譜流動相采用正相液-

11、液分配分離：底劑通常采用低極性的溶劑如正己烷、苯、氯仿等，而洗脫劑則通常根據(jù)試樣的性質(zhì)選取中等極性溶劑如醚、酮、醇等，若組分的保留時間太短，降低溶劑極性，反之增加。也可在低極性溶劑中，逐漸增加其中的極性溶劑，使保留時間縮短反相色譜中，通常以水作為流動相的主體（底劑），在洗脫時再加入不同配比的有機(jī)溶劑作為極性調(diào)節(jié)劑。1. 液液分配色譜流動相采用正相液-液分配分離：底劑通常采用人干擾素-等電點(diǎn)8.5底劑：50mmol/L 磷酸鹽緩沖液，pH8.0洗脫劑： 50mmol/L 磷酸鹽緩沖液，pH8.0，1mol/L NaCl2. 離子交換色譜流動相組分保留值可通過流動相中鹽濃度及pH來調(diào)節(jié)人干擾素-等電點(diǎn)8.52. 離子交換色譜流動相3. 體積排阻色譜流動相特點(diǎn)：組分不與固定相發(fā)生吸附，又不溶于溶解固定相。各組分峰均在流動相的保留時間之前出峰，不能用來分離大小相似、相對分子量接近的分子固定相和流動相的選擇簡便，不采用梯度洗脫3. 體積排阻色譜流動相特點(diǎn)：3.6 高效液相色譜儀一、液體輸送系統(tǒng)二、梯度洗脫裝置三、進(jìn)樣系統(tǒng)四、餾分收集器五、檢測系統(tǒng)六、色譜分離系統(tǒng)3.6 高效液相色譜儀一、液