酸奶微生物檢驗(yàn)

1、酸奶衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)編號(hào)：GB193022010一、準(zhǔn)備內(nèi)容：1、無菌器材準(zhǔn)備表：儀器名稱數(shù)量平板培養(yǎng)皿121ml移液管510ml移液管1玻璃棒1試管25燒杯3錐形瓶32、培養(yǎng)基、試劑準(zhǔn)備表：名稱體積（ml）BPW225LST100BGLB100氯化鈉肉湯225B-P瓊脂平板50平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基150生理鹽水225、100備注：無菌生理鹽水氯化鈉2.5g蒸餾水300ml平板計(jì)數(shù)瓊脂有現(xiàn)成的培養(yǎng)基，直接稱取即可，配制120ml月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（LST）肉湯胰蛋白胨或胰酪胨2.0g氯化鈉0.5g乳糖0.5g磷酸氫二鉀（K2HPO4）0.275g磷酸二氫鉀（KH2PO4）0.275g月桂基硫酸鈉0.0

2、1g蒸餾水100mL將各成分加入蒸餾水中，攪混平均，靜置約15min。10min，煮沸溶解，調(diào)治pH，高壓滅菌121，煌綠乳糖膽鹽（BGLB）肉湯蛋白胨1g乳糖1.0g牛膽粉（oxgall或oxbile）溶液20mL%煌綠水溶液mL蒸餾水80mLpH制法將蛋白胨、乳糖溶于約50mL蒸餾水中，加入牛膽粉溶液20mL（將2.0g脫水牛膽粉溶于20mL蒸餾水中，調(diào)治pH至），用蒸餾水稀釋到975mL，調(diào)治pH，再加入%煌綠水溶液mL，用蒸餾水補(bǔ)足到100mL，用棉花過濾后，分裝到有玻璃小倒管的試管中，每管10mL。121高壓滅菌15min。%氯化鈉肉湯蛋白胨2.25g牛肉膏1.125g氯化鈉16.8

3、75g蒸餾水225mLpH將上述成分加熱溶解，調(diào)治pH，分裝，每瓶225mL，121高壓滅菌15min。BairdParker瓊脂平板胰蛋白胨0.5g牛肉膏0.25g酵母膏0.05g丙酮酸鈉0.5g甘氨酸0.6g氯化鋰（LiCl6H2O）0.25g瓊脂1.0g蒸餾水pH增菌劑的配法30%卵黃鹽水50mL與經(jīng)過除菌過濾的1%亞碲酸鉀溶液10mL混雜，保存于冰箱內(nèi)。制法將各成分加到蒸餾水中，加熱煮沸至完好溶解，調(diào)治pH。121高壓滅菌15min。臨用時(shí)加熱溶化瓊脂，冷至50，每95mL加入預(yù)熱至50的卵黃亞碲酸鉀增菌劑5mL搖勻后傾注平板。培養(yǎng)基應(yīng)是致密不透明的。使用前在冰箱儲(chǔ)蓄不得高出48h。二

4、、指標(biāo)表3微生物限量項(xiàng)目采樣方案a及限量（若非擬定，均以CFU/g或CFU/ml表示）檢測(cè)方法ncmM菌落總數(shù)5210000100000大腸菌群5210100MPN計(jì)數(shù)法沙門氏菌500/25g(ml)-金黃色葡萄5110100球菌定性檢驗(yàn)霉菌90A：樣品的解析及辦理按和執(zhí)行。B：不適用于以發(fā)酵稀奶油為原料的產(chǎn)品。表4乳酸菌數(shù)項(xiàng)目限量CFU/g(mL)檢驗(yàn)方法乳酸菌數(shù)a1106GB發(fā)酵后經(jīng)熱辦理的產(chǎn)品對(duì)乳酸菌數(shù)不作要求。三、樣品本源：四、時(shí)間安排表菌落總數(shù)大腸桿菌霉菌和酵金黃色葡乳酸菌母菌沙門氏菌萄球菌無菌器材無菌器材第1天準(zhǔn)備準(zhǔn)備配置PCA配置LST配置樣液接種LST第2天配置制平板BGLB觀

5、察LST培養(yǎng)產(chǎn)氣情第3天況，有產(chǎn)（36）氣的接種BGLB第4天菌落計(jì)數(shù)觀察BGLB第5天查MPN報(bào)告表報(bào)告五、樣品配置及器材準(zhǔn)備無菌器材無菌器材準(zhǔn)備準(zhǔn)備配置孟加配置樣液拉紅劃線接種配置樣品到Baird液Parker制平板氏培養(yǎng)基和血平板培養(yǎng)(28)革蘭氏染色鏡檢菌落計(jì)數(shù)報(bào)告報(bào)告無菌器材無菌器材配置準(zhǔn)備MRS平BPW板配置樣液制BS和XLD平板劃線接種到BS和XLD平板觀察XLD平板觀察BS平板無菌器材培養(yǎng)皿試管菌落總數(shù)92移液管大腸菌數(shù)101ml*3/10ml*1;錐形瓶霉菌和酵母菌92500ml*1/250ml*1;燒杯*1金黃色葡萄菌屬樣品液稀釋度配置12325g(ml)樣品+%的生123

6、理鹽水123沙門氏菌乳酸菌六、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容（1）菌落總數(shù)操作步驟1、樣品的稀釋液體樣品：稱取25g樣品置盛有225mL生理鹽水的無菌錐形瓶，搖勻，制成1:10的樣品勻液。用1mL無菌吸管吸取1:10樣品勻液1mL，沿管壁緩慢注于盛有9mL稀釋液的無菌試管中（注意吸管或吸頭尖端不要波及稀釋液面），振搖試管或換用1支無菌吸管屢次吹打使其混雜平均，制成1:100的樣品勻液。另取1mL無菌吸管，按上述操作程序，制備1:1000稀釋樣品勻液。每遞加稀釋一次，換用1次1mL無菌吸管或吸頭。依照對(duì)樣品污染情況的估計(jì)，選擇2個(gè)3個(gè)合適稀釋度的樣品勻液（液體樣品可包括原液），在進(jìn)行10倍遞加稀釋時(shí)，吸取1mL樣品勻

7、液于無菌平皿內(nèi)，及時(shí)將涼至46營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基注入平皿20mL左右，并混雜平均，每個(gè)稀釋度做兩個(gè)平皿。同時(shí)，分別吸取1mL空白稀釋液加入兩個(gè)無菌平皿內(nèi)作空白比較。及時(shí)將15mL20mL冷卻至46的平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基（可放置于461恒溫水浴箱中保溫）傾注平皿，并轉(zhuǎn)動(dòng)平皿使其混雜平均。2、培養(yǎng)待瓊脂凝固后，將平板翻轉(zhuǎn)，置于361恒溫箱中培養(yǎng)48h2h。3、菌落計(jì)數(shù)可用肉眼觀察，必要時(shí)用放大鏡或菌落計(jì)數(shù)器，記錄稀釋倍數(shù)和相應(yīng)的菌落數(shù)量。菌落計(jì)數(shù)以菌落形成單位（colony-formingunits，CFU）表示。采用菌落數(shù)在30CFU300CFU之間、無延長菌落生長的平板計(jì)數(shù)菌落總數(shù)。低于30CFU的

8、平板記錄詳盡菌落數(shù)，大于300CFU的可記錄為多不可以計(jì)。每個(gè)稀釋度的菌落數(shù)應(yīng)采用兩個(gè)平板的平均數(shù)。其中一個(gè)平板有較大片狀菌落生長時(shí)，則不宜采用，而應(yīng)以無片狀菌落生長的平板作為該稀釋度的菌落數(shù)；若片狀菌落不到平板的一半，而其他一半中菌落分布又很平均，即可計(jì)算半個(gè)平板后乘以2，代表一個(gè)平板菌落數(shù)。當(dāng)平板上出現(xiàn)菌落間無明顯界線的鏈狀生長時(shí)，則將每條單鏈作為一個(gè)菌落計(jì)數(shù)。結(jié)果與報(bào)告4、菌落總數(shù)的計(jì)算方法若只有一個(gè)稀釋度平板上的菌落數(shù)在適共計(jì)數(shù)范圍內(nèi)，計(jì)算兩個(gè)平板菌落數(shù)的平均值，再將平均值乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)，作為每g（mL）樣品中菌落總數(shù)結(jié)果。若有兩個(gè)連續(xù)稀釋度的平板菌落數(shù)在適共計(jì)數(shù)范圍內(nèi)時(shí)，按公式（1

9、）計(jì)算：式中：N樣品中菌落數(shù)；C平板（含合適范圍菌落數(shù)的平板）菌落數(shù)之和；n1第一稀釋度（低稀釋倍數(shù)）平板個(gè)數(shù)；n2第二稀釋度（高稀釋倍數(shù)）平板個(gè)數(shù)；d稀釋因子（第一稀釋度）。若全部稀釋度的平板上菌落數(shù)均大于300CFU，則對(duì)稀釋度最高的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)，其他平板可記錄為多不可以計(jì)，結(jié)果按平均菌落數(shù)乘以最高稀釋倍數(shù)計(jì)算。若全部稀釋度的平板菌落數(shù)均小于30CFU，則應(yīng)按稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計(jì)算。若全部稀釋度（包括液體樣品原液）平板均無菌落生長，則以小于1乘以最低稀釋倍數(shù)計(jì)算。若全部稀釋度的平板菌落數(shù)均不在30CFU300CFU之間，其中一部分小于30CFU或大于300CFU時(shí)，則以最湊

10、近30CFU或300CFU的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計(jì)算。5、菌落總數(shù)的報(bào)告菌落數(shù)小于100CFU時(shí)，按“四舍五入”原則修約，以整數(shù)報(bào)告。菌落數(shù)大于或等于100CFU時(shí)，第3位數(shù)字采用“四舍五入”原則修約后，取前2位數(shù)字，后邊用0代替位數(shù)；也可用10的指數(shù)形式來表示，按“四舍五入”原則修約后，采用兩位有效數(shù)字。若全部平板上為延長菌落而無法計(jì)數(shù)，則報(bào)告菌落延長。若空白比較上有菌落生長，則此次檢測(cè)結(jié)果無效。稱重取樣以CFU/g為單位報(bào)告，體積取樣以CFU/mL為單位報(bào)告。（2）大腸菌數(shù)操作步驟操作步驟樣品的稀釋固體和半固體樣品：稱取25g樣品,放入盛有225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌均質(zhì)杯內(nèi),

11、8000r/min10000r/min均質(zhì)1min2min,或放入盛有225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打1min2min，制成1:10的樣品勻液。液體樣品：以無菌吸管吸取25mL樣品置盛有225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌錐形瓶（瓶內(nèi)預(yù)置合適數(shù)量的無菌玻璃珠）中，充分混勻，制成1:10的樣品勻液。樣品勻液的pH值應(yīng)在之間，必要時(shí)分別用1mol/LNaOH或1mol/LHCl調(diào)治。用1mL無菌吸管或微量移液器吸取1:10樣品勻液1mL，沿管壁慢慢注入9mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌試管中（注意吸管或吸頭尖端不要波及稀釋液面），振搖試管或換用1支1mL無菌吸管

12、屢次吹打，使其混雜平均，制成1:100的樣品勻液。依照對(duì)樣品污染情況的估計(jì)，按上述操作，依次制成十倍遞加系列稀釋樣品勻液。每遞加稀釋次，換用1支1mL無菌吸管或吸頭。從制備樣品勻液至樣品接種達(dá)成，全過程不得高出15min。初發(fā)酵試驗(yàn)每個(gè)樣品，選擇3個(gè)合適的連續(xù)稀釋度的樣品勻液（液體樣品可以選擇原液），每個(gè)稀釋度接種3管月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（LST）肉湯，每管接種1mL（如接種量高出1mL，則用雙料LST肉湯），361培養(yǎng)24h2h，觀察倒管內(nèi)可否有氣泡產(chǎn)生，24h2h產(chǎn)氣者進(jìn)行復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)，如未產(chǎn)氣則連續(xù)培養(yǎng)至48h2h，產(chǎn)氣者進(jìn)行復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)。未產(chǎn)氣者為大腸菌群陰性。復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)用接種環(huán)從產(chǎn)氣的L

13、ST肉湯管中分別取培養(yǎng)物1環(huán)，移種于煌綠乳糖膽鹽肉湯BGLB）管中，361培養(yǎng)48h2h，觀察產(chǎn)氣情況。產(chǎn)氣者，計(jì)為大腸菌群陽性管。大腸菌群最可能數(shù)（MPN）的報(bào)告按確證的大腸菌群LST陽性管數(shù)，檢索MPN表（見附錄B），報(bào)告每g（mL）樣品中大腸菌群的MPN值。（3）霉菌和酵母菌操作步驟樣品的稀釋固體和半固體樣品：稱取25g樣品至盛有225mL滅菌蒸餾水的錐形瓶中，充分振搖，即為1:10稀釋液。或放入盛有225mL無菌蒸餾水的均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打2min，制成1:10的樣品勻液。液體樣品：以無菌吸管吸取25mL樣品至盛有225mL無菌蒸餾水的錐形瓶（可在瓶內(nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的無菌玻璃珠）

14、中，充分混勻，制成1:10的樣品勻液。取1mL1:10稀釋液注入含有9mL無菌水的試管中,另換一支1mL無菌吸管屢次吹吸,此液為1:100稀釋液。按操作程序，制備10倍系列稀釋樣品勻液。每遞加稀釋一次，換用1次1mL無菌吸管。依照對(duì)樣品污染情況的估計(jì)，選擇2個(gè)3個(gè)合適稀釋度的樣品勻液（液體樣品可包括原液），在進(jìn)行10倍遞加稀釋的同時(shí)，每個(gè)稀釋度分別吸取平皿內(nèi)。同時(shí)分別取1mL樣品稀釋液加入2個(gè)無菌平皿作空白比較。1mL樣品勻液于2個(gè)無菌及時(shí)將15mL20mL冷卻至46的馬鈴薯-葡萄糖-瓊脂或孟加拉紅培養(yǎng)基(可放置于461恒溫水浴箱中保溫)傾注平皿，并轉(zhuǎn)動(dòng)平皿使其混雜平均。培養(yǎng)待瓊脂凝固后，將平

15、板倒置，281培養(yǎng)5d，觀察并記錄。菌落計(jì)數(shù)肉眼觀察，必要時(shí)可用放大鏡，記錄各稀釋倍數(shù)和相應(yīng)的霉菌和酵母數(shù)。以菌落形成單位（colonyformingunits，CFU）表示。采用菌落數(shù)在10CFU150CFU的平板，依照菌落形態(tài)分別計(jì)數(shù)霉菌和酵母數(shù)。霉菌延長生長覆蓋整個(gè)平板的可記錄為多不可以計(jì)。菌落數(shù)應(yīng)采用兩個(gè)平板的平均數(shù)。（4）金黃色葡萄球菌操作步驟樣品的辦理稱取25g樣品至盛有225mL%氯化鈉肉湯或10%氯化鈉胰酪胨大豆肉湯的無菌均質(zhì)杯內(nèi)，8000r/min10000r/min均質(zhì)1min2min，或放入盛有225mL%氯化鈉肉湯或10%氯化鈉胰酪胨大豆肉湯的無菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)

16、器拍打1min2min。若樣品為液態(tài)，吸取25mL樣品至盛有225mL%氯化鈉肉湯或10%氯化鈉胰酪胨大豆肉湯的無菌錐形瓶(瓶內(nèi)可預(yù)置合適數(shù)量的無菌玻璃珠)中，振蕩混勻。增菌和分別培養(yǎng)將上述樣品勻液于361培養(yǎng)18h24h。金黃色葡萄球菌在%氯化鈉肉湯中呈污濁生長，污染嚴(yán)重時(shí)在10%氯化鈉胰酪胨大豆肉湯內(nèi)呈污濁生長。將上述培養(yǎng)物，分別劃線接種到Baird-Parker平板和血平板，血平板1培養(yǎng)18h24h。Baird-Parker平板361培養(yǎng)18h24h或45h48h。金黃色葡萄球菌在Baird-Parker平板上，菌落直徑為2mm3mm，顏色呈灰色到黑色，邊緣為淡色，周圍為一污濁帶，在其外

17、層有一透明圈。用接種針接觸菌落有似奶油至樹膠樣的硬度，有時(shí)會(huì)遇到非脂肪溶解的近似菌落；但無污濁帶及透明圈。長遠(yuǎn)保存的冷凍或干燥食品中所分其他菌落比典型菌落所產(chǎn)生的黑色較淡些，外觀可能粗糙并干燥。在血平板上，形成菌落較大，圓形、圓滑突出、濕潤、金黃色（有時(shí)為白色），菌落周圍可見完好透明溶血圈。挑取上述菌落進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢及血漿凝固酶試驗(yàn)。判斷染色鏡檢：金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽性球菌，排列呈葡萄球狀，無芽胞，無莢膜，直徑約為m1m。（5）沙門氏菌檢樣25g（ml）樣品+225mlBPW361，8h18h1ml+TTB10ml1ml+SC10ml421，18h24h361，18h24hBSXLD(

18、或HE、顯色培養(yǎng)基)361，40h48h361，18h24h挑取可疑菌落TSI,賴氨酸，NA，靛基質(zhì)，尿素（），KCN生化判斷試劑盒或全自動(dòng)微生物生化判斷系統(tǒng)+2S+靛基質(zhì)-2S+靛基質(zhì)+2-反應(yīng)結(jié)果與左HHHS-靛基質(zhì)尿素-KCN-尿素-KCN-尿素-KCN-側(cè)描述不符賴氨酸+賴氨酸+賴氨酸+/-甘露醇+、山梨醇+ONPG-沙門氏菌，血清學(xué)試驗(yàn)非沙門氏菌報(bào)告（6）乳酸菌操作步驟樣品制備樣品的全部制備過程均應(yīng)依照無菌操作程序。冷凍樣品可先使其在25條件下解凍，時(shí)間不高出18h，也可在溫度不高出45的條件解凍，時(shí)間不高出15min。固體和半固體食品：以無菌操作稱取25g樣品，置于裝有225mL生理鹽水的無菌均質(zhì)杯內(nèi)，于8000r/min10000r/min均質(zhì)1min2min，制成1:10樣品勻液；或置于225mL生理鹽水的無菌均質(zhì)