強(qiáng)大的多重檢測平臺

1、 強(qiáng)大的多重檢測平臺Panomics/Luminex多重核酸與蛋白定量檢測平臺 # 圖3.探針以共價方式結(jié)合到特定熒光編碼的微球上圖4.紅綠雙色激光分析Luminex多重核酸、蛋白定量檢測平臺又稱作液相芯片，是基于xMAP技術(shù)（flexibleMulti-AnalyteProfiling）的新型生物技術(shù)平臺。xMAP技術(shù)最早在1997年由美國Luminex公司開發(fā)，可用于免疫學(xué)、蛋白質(zhì)、核酸檢測、基因研究等領(lǐng)域，已成為一種新的蛋白質(zhì)組學(xué)和基因組學(xué)研究工具。Luminex的代表產(chǎn)品Luminex100/200（圖】）以及新推出的FLEXMAP3D多功能流式點(diǎn)陣儀，是唯一得到美國FDA批準(zhǔn)的，也是

2、唯一被納入美國臨床實(shí)驗(yàn)室質(zhì)控網(wǎng)絡(luò)的高通量診斷技術(shù)，被國際業(yè)界專家評價為臨床診斷的趨勢性技術(shù)之一。圖1Luminex100/200多功能流式點(diǎn)陣儀Luminex多重檢測平臺技術(shù)原理Luminex多重檢測平臺主要由4部分構(gòu)成：生化試劑、微球、流體和光學(xué)設(shè)備以及高速電子處理設(shè)備。其核心技術(shù)是基于xMAP微球技術(shù)的液相芯片檢測系統(tǒng)，在不同熒光編碼的微球上進(jìn)行抗原抗體、酶一底物、配體受體的結(jié)合反應(yīng)及核酸雜交反應(yīng)，通過激光分別檢測微球編碼和報告熒光來達(dá)到定性和定量的目的，一個反應(yīng)孔內(nèi)可以完成多達(dá)100種不同的生物學(xué)反應(yīng)。圖2100種經(jīng)熒光編碼的微球編碼微球：分別用不同配比的紅色和橙色兩種熒光染料（這兩種染

3、料各有10種不同區(qū)分）將直徑5.6gm的聚苯乙烯微球（beads）染成不同的熒光色（圖2），從而獲得多達(dá)100種經(jīng)熒光編碼的微球（最新的FLEXMAP3D可達(dá)到500種編碼微球）。不同顏色微球在分類激光激發(fā)下產(chǎn)生的熒光互不相同，這種分類熒光是識別不同微球的唯一途徑。利用這100種微球，可以分別標(biāo)記上100種不同的探針分子。交聯(lián)探針、抗體或抗原：把針對不同檢測物的核酸探針、抗體或抗原以共價方式結(jié)合到特定熒光編碼的微球上（圖3）。檢測反應(yīng)：先把針對不同檢測物的、用不同熒光色編碼的微球混合，再加入被檢測物。懸液中的微球與被檢測物特異性結(jié)合，結(jié)合物被標(biāo)記上報告熒光。激光分析：微球成單列通過兩束激光，一

4、束判定微球的熒光編碼；另一束測定微球上的報告分子的熒光強(qiáng)度。紅色激光可將微球分類，從而鑒定各個不同的反應(yīng)類型（即定性）；綠色激光可確定微球上結(jié)合的報告熒光分子的數(shù)量，從而確定微球上結(jié)合的目的分子的數(shù)量（即定量）。因此，通過紅綠雙色激光的同時檢測，完成對反應(yīng)的實(shí)時、定性和定量分析（圖4）。二.Luminex多重檢測平臺技術(shù)優(yōu)勢Luminex多重檢測平臺最突出的優(yōu)勢在于：僅需少量樣本即可同時定量檢測同一樣本中多個不同的目的分子，即多重檢測。具體，有以下顯著優(yōu)勢：高通量：可對同一樣本的多個目的分子同時分析。理論上說，檢測的通量等于微球的種類數(shù)，即最多達(dá)100種。樣本消耗量少：由于同一反應(yīng)孔內(nèi)可同時完

5、成100種不同的目的分子檢測，所以大大節(jié)省了樣本用量；且由于微球體積小巧，少至1rL的樣本即可檢測。操作簡單、快速：由于是液相體系，反應(yīng)時間大大縮短，多重細(xì)胞因子檢測，23小時內(nèi)可完成。靈敏度高：微球表面積大，每個微球上可固定10萬個探針，保證了能最大程度與樣本內(nèi)的目的分子結(jié)合，提高檢測靈敏度。最低檢測濃度可達(dá)0.1pg/mL。特異性強(qiáng)：可讀取單個微球上的熒光信號，自動區(qū)分結(jié)合與未結(jié)合微球。準(zhǔn)確性高：無需洗滌，微球上的報告分子熒光強(qiáng)度與結(jié)合的待測分子成正比。由于Luminex檢測平臺的檢測范圍大，因此不需要像ELISA檢測進(jìn)行稀釋，進(jìn)一步減少誤差。重復(fù)性好：Luminex檢測平臺直接讀取熒光值

6、，更穩(wěn)定、靈敏；每種微球檢測100個，取中值作為結(jié)果，相當(dāng)于每個樣本重復(fù)檢測了100次。費(fèi)用低：同時檢測一個樣本的多項(xiàng)指標(biāo)可節(jié)約時間、樣本、試劑、耗材和勞動，降低檢測成本，提高分析效率。靈活：用戶只需要增減帶有探針的微球和標(biāo)記分子即可滿足不同檢測項(xiàng)目的需要。三.Luminex多重檢測平臺技術(shù)應(yīng)用Luminex多重檢測平臺是一種非常靈活的多元分析平臺，在核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子的大規(guī)模分析中具有巨大的應(yīng)用潛力，可用于免疫分析、核酸研究、酶學(xué)分析、受體配體識別分析等眾多領(lǐng)域的研究，蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)相互作用、蛋白質(zhì)核酸相互作用分析等都可以在同一個平臺上實(shí)現(xiàn)?？扇苄缘鞍追肿佣繖z測Luminex多重檢測平

7、臺廣泛應(yīng)用于細(xì)胞因子檢測、病原體的檢測和分型、HLA分型、細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路研究以及過敏原篩選、自身抗體篩查、腫瘤標(biāo)志物檢測等諸多方面。國外多家公司已推出了商品化的細(xì)胞因子液相芯片檢測試劑，比如Affymetrix公司的PanomicsProcartaCytokineProfilingKits,R&D公司的FlurokineMAP系列、MERCK公司的WideScreenAssays系列等?？捎糜趤碜匀?、小鼠、大鼠的樣品，既有一次檢測單種細(xì)胞因子的試劑盒，也有預(yù)先混合多種細(xì)胞因子抗體交聯(lián)微球而一次檢測多個指標(biāo)者，研究者還可根據(jù)自身需要自行選購某幾種交聯(lián)微球。這些試劑盒在檢測靈敏性、準(zhǔn)確性、可靠性

8、等方面都具有很好的性能。Affymetrix公司的PanomicsProcarta細(xì)胞因子/趨化因子檢測試劑盒，可在同一反應(yīng)中同時檢測最多達(dá)54種蛋白，目前已開發(fā)的產(chǎn)品按種屬分主要有120種human，39種mouse，32種rat，45種non-humanprimate，8種porcine和12種canine。該系列試劑盒方便快速，檢測時間小于3小時，靈敏度可達(dá)1pg/mL，準(zhǔn)確性和重復(fù)性好。目前可以檢測的樣本類型有：血清、血漿、細(xì)胞培養(yǎng)上清、以及體液和細(xì)胞內(nèi)檢測。R&D公司的FluorokineMAP系列可以對50yL的血清、血漿或細(xì)胞上清樣品進(jìn)行多因子分析，目前已推出的產(chǎn)品類型包括細(xì)胞因

9、子、生長因子、趨化因子、MMPs、肥胖/糖尿病相關(guān)因子、血管再生因子等。MERCK公司的WideScreenAssays系列目前只提供預(yù)混的試劑盒，主要產(chǎn)品類型包括腫瘤標(biāo)志物、心血管疾病、細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、腎毒性、激素以及代謝相關(guān)分子等。多基因表達(dá)的定量檢測Affymetrix公司的PanomicsQuantiGenePlex2.0技術(shù)，可以在同一反應(yīng)中同時對3-36個基因做DNA或mRNA拷貝數(shù)的精確定量。它可以分析各種樣本（組織、細(xì)胞、血液、FFPE樣本、純化的RNA或DNA等），只需用特定裂解液裂解樣本即可，對樣本量下限無要求，特別適合需要對微量樣本做多基因定量的研究實(shí)驗(yàn)。它無需核酸的抽

10、提純化，無需PCR，因?yàn)楸苊饬撕芏嗳藶橐蛩氐母蓴_，可以快速得到準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。QuantiGenePlex2.0技術(shù)特別適用于血液樣本和保存多年的FFPE樣本。血液樣本含有各種酶的抑制物，F(xiàn)FPE樣本由于保存太久造成mRNA高度降解，這兩種樣本很難用傳統(tǒng)的real-timePCR進(jìn)行分析。而QuantiGenePlex2.0技術(shù)可以保證得到極高的準(zhǔn)確度與重復(fù)性，相關(guān)文獻(xiàn)已陸續(xù)刊載于世界頂尖雜質(zhì)（Nature,NewEnglandJMed,PNAS等）。除此之外，Luminex多重檢測平臺還廣泛涉及病原體的檢測和分型、HLA分型、mRNA表達(dá)譜（BranchDNA技術(shù)，無需RNA抽提純化、無需P

11、CR擴(kuò)增）、miRNA表達(dá)譜、轉(zhuǎn)錄因子研究、細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路研究以及過敏原篩選、自身抗體篩查、腫瘤標(biāo)志物檢測等諸多方面。轉(zhuǎn)錄因子（TF）檢測轉(zhuǎn)錄因子是一種DNA結(jié)合蛋白，它們通過結(jié)合上游啟動子區(qū)域來調(diào)控基因表達(dá)。轉(zhuǎn)錄因子可以通過特定位點(diǎn)的磷酸化或與其他轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合成復(fù)合物的方式被激活。而被激活的轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物則可以結(jié)合DNA上游啟動子區(qū)域來啟動轉(zhuǎn)錄機(jī)制。單一的胞外刺激可以激發(fā)多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而進(jìn)一步激活多種轉(zhuǎn)錄因子來調(diào)節(jié)特定mRNA的轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄因子活性的改變通常與人類的疾病相關(guān)，比如：癌癥患者的API、ER、以及p53表達(dá)都會改變；相關(guān)疾病中NFkB改變；肥胖癥中PPARG發(fā)生改變。用簡便

12、易行的方法對活化的轉(zhuǎn)錄因子做分析和定量就可以幫助我們了解細(xì)胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)并揭示與疾病相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子。通過運(yùn)用這些方法，人們逐漸地積累了更多有用信息，同時通過運(yùn)用這些信息在更短的時間內(nèi)開發(fā)了更安全有效的藥物。Affymetrix公司的PanomicsProcartaTFPlexassay是一種轉(zhuǎn)錄因子高通量檢測試劑盒，它利用專利的分離技術(shù)與Luminnex液相芯片系統(tǒng)相結(jié)合，可以在同一反應(yīng)中同時檢測最多達(dá)43種轉(zhuǎn)錄因子。它對樣本的要求量很低，只需500ng的總細(xì)胞蛋白或250ng的核抽提物，整個過程只需不到5個小時。SH2結(jié)構(gòu)域檢測SH2域是在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中，介導(dǎo)蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用的眾多蛋白質(zhì)

13、域家族之一。和其他域一樣，SH2域也由氨基酸殘基的保守區(qū)定義。100個氨基酸序列的折疊特性，使得這些序列可以定向識別并結(jié)合到包含磷酸化酪氨酸的配體中。涉及磷酸化酪氨酸的蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用，就像SH2域促成的相互作用一樣，是補(bǔ)充信號蛋白質(zhì)的主要方式，因而在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中占據(jù)重要角色。目前人們已在酶、適配蛋白質(zhì)、信號蛋白質(zhì)的調(diào)節(jié)亞基、支架蛋白質(zhì)和轉(zhuǎn)錄因子中發(fā)現(xiàn)了SH2域。這些蛋白質(zhì)對于信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程必不可少，因?yàn)樗鼈冊谑荏w和下游信號分子之間扮演著適配器的角色，使得細(xì)胞內(nèi)的信號傳遞得以進(jìn)行，并對特定蛋白質(zhì)激酶的活性進(jìn)行調(diào)控。蛋白質(zhì)磷酸化是細(xì)胞應(yīng)答的主要信息通道，依賴于SH2域的信號傳遞發(fā)生故障，通

14、常直接或間接地與人類疾病相關(guān)。Affymetrix公司的PamonicsSH2DomainPlexKit可以在同一反應(yīng)中同時檢測最多達(dá)30種SH2結(jié)構(gòu)域，可以自由選擇不同的SH2蛋白對樣本的磷酸化情況做定量定性分析，操作簡單快速，可在4小時內(nèi)得到精確結(jié)果?？偠灾?，Panomics/Luminex多重核酸蛋白檢測平臺帶給用戶一個更全面、更系統(tǒng)的分析角度，從而使您的檢測數(shù)據(jù)具有更大的意義。 # #(上接第18頁)高通量N-聚糖研究鏈接在重組單克隆抗體(rMabs)的Fc區(qū)域的Asn-X位置的N聚糖已表明可以影響藥代動力學(xué)，藥效以及治療安全性?？贵w生產(chǎn)過程中介質(zhì)，pH值，溫度等條件的變化都會影響糖

15、基化的結(jié)構(gòu)?？紤]到聚糖對于抗體治療性特征來說具有的重要意義，各家藥物生產(chǎn)商必須能夠在生產(chǎn)中測量并控制糖基化過程。這就需要一整套糖分析模塊系統(tǒng)來確認(rèn)各批次藥物在糖基化關(guān)鍵性治療屬性上的一致性。而且，藥物設(shè)計和開發(fā)過程中優(yōu)化糖基化作用可有助于顯著增強(qiáng)藥物性能，并減少臨床應(yīng)用中的安全風(fēng)險。如果用傳統(tǒng)的層析技術(shù)，CE-LIF技術(shù)或者質(zhì)譜技術(shù)來分析N-聚糖，通常需要3天的時間來進(jìn)行消化，標(biāo)記和分析。而如果在LCGXII上使用N聚糖分析試劑盒來做這項(xiàng)工作，這一過程將從3天縮短為不超過6個小時。LabChipN-聚糖分析技術(shù)同NPLC和CE-LIF的比較輝瑞的一份研究報告比較了LabChipN-聚糖分析技術(shù)和傳統(tǒng)的NPLC和CE-LIF方法，發(fā)現(xiàn)LabChip技術(shù)的速度是NPLC的160倍，是CE-LIF的6倍，具體數(shù)據(jù)參見圖16.*!AzahRdvF”A-i/-ar4、m圖16.NPLCanalysiswith2-ABlabel(to