秀麗隱桿線蟲

1、分類號 編號煙 臺 大 學(xué)畢 業(yè) 論 文利用秀麗隱桿線蟲篩選抗白色念珠菌活性物質(zhì)Screening anti-Candida albicans substances using Caenorhabditis elegans利用秀麗隱桿線蟲篩選抗白色念珠菌活性物質(zhì)摘要：以秀麗隱桿線蟲作為模型生物進行抗菌物質(zhì)篩選。用白色念珠菌感染線蟲后，采用不同濃度的已知抗菌藥物治療，觀察線蟲存活情況，確定合適用藥濃度；采用微擬球藻提取物對白色念珠菌感染線蟲治療，觀察線蟲存活情況，與已知抗菌藥物作用效果對比，從而篩選出可用于治療白色念珠菌活性物質(zhì)。實驗發(fā)現(xiàn)，添加1020mg/L的氟康唑?qū)Ω腥景咨钪榫男沱愲[桿線

2、蟲治療效果較好，在一定劑量范圍內(nèi)，治療效果和劑量成線性關(guān)聯(lián)；微擬球藻提取物不具備抗菌活性。關(guān)鍵詞：秀麗隱桿線蟲；白色念珠菌；抗菌物質(zhì)Abstract: In the study, Caenorhabditis elegans were used as model organism to screen antibacterial agents. C.elegans were infected by Candida albicans and treated by different concentrations of antibacterial agents which had been know

3、n and extracts from Nannochloropsis OZ-1, observating the survival situation and comparing the effects of the two antibacterial agents, thus, the bioactive substance could be screened which cured the Candida albicans. The result showed that Candida albicans could be treated by 1020 mg/L Fluconazole,

4、 moreover within the scope of the dose, treatment effect and the dose of a linear correlation. And the results showed that extracts from Nannochloropsis OZ-1 did not have antibacterial activity.Key words: C.elegans；Candida albicans；Antibacterial substances目錄 TOC o 1-3 h z u HYPERLINK l _Toc389600335

5、 1 文獻綜述 PAGEREF _Toc389600335 h 1 HYPERLINK l _Toc389600336 1.1 秀麗隱桿線蟲 PAGEREF _Toc389600336 h 1 HYPERLINK l _Toc389600337 1.2 秀麗隱桿線蟲研究進展 PAGEREF _Toc389600337 h 1 HYPERLINK l _Toc389600338 1.2.1 環(huán)境毒理學(xué)的研究 PAGEREF _Toc389600338 h 2 HYPERLINK l _Toc389600339 1.2.2 程序性細胞死亡的研究 PAGEREF _Toc389600339 h 2

6、HYPERLINK l _Toc389600340 1.2.3 秀麗隱桿線蟲感染模型的建立 PAGEREF _Toc389600340 h 2 HYPERLINK l _Toc389600341 1.2.4 抗菌物質(zhì)作用機制的研究 PAGEREF _Toc389600341 h 2 HYPERLINK l _Toc389600342 1.2.5 病菌致病機制和線蟲免疫機制的研究 PAGEREF _Toc389600342 h 3 HYPERLINK l _Toc389600343 1.3 白色念珠菌 PAGEREF _Toc389600343 h 3 HYPERLINK l _Toc38960

7、0344 1.4 抗菌物質(zhì)的篩選 PAGEREF _Toc389600344 h 4 HYPERLINK l _Toc389600345 1.5 實驗研究意義 PAGEREF _Toc389600345 h 5 HYPERLINK l _Toc389600346 2 材料和方法 PAGEREF _Toc389600346 h 6 HYPERLINK l _Toc389600347 2.1 材料 PAGEREF _Toc389600347 h 6 HYPERLINK l _Toc389600348 2.1.1 實驗藥品 PAGEREF _Toc389600348 h 6 HYPERLINK l

8、_Toc389600349 2.1.2 實驗儀器 PAGEREF _Toc389600349 h 6 HYPERLINK l _Toc389600350 2.1.3 線蟲和菌株 PAGEREF _Toc389600350 h 7 HYPERLINK l _Toc389600351 2.1.4 培養(yǎng)基 PAGEREF _Toc389600351 h 7 HYPERLINK l _Toc389600352 2.1.5 試劑 PAGEREF _Toc389600352 h 7 HYPERLINK l _Toc389600353 2.2 方法 PAGEREF _Toc389600353 h 7 HYP

9、ERLINK l _Toc389600354 2.2.1 線蟲培養(yǎng)和保存 PAGEREF _Toc389600354 h 7 HYPERLINK l _Toc389600355 2.2.2 線蟲同步化 PAGEREF _Toc389600355 h 8 HYPERLINK l _Toc389600356 2.2.3 線蟲真菌感染 PAGEREF _Toc389600356 h 8 HYPERLINK l _Toc389600357 2.2.4 線蟲抗感染治療 PAGEREF _Toc389600357 h 8 HYPERLINK l _Toc389600358 2.2.5 觀察 PAGEREF

10、 _Toc389600358 h 8 HYPERLINK l _Toc389600359 3 實驗結(jié)果分析9 HYPERLINK l _Toc389600360 3.1 氟康唑用藥濃度的選擇9 HYPERLINK l _Toc389600361 3.2 篩選可用于治療白色念珠菌的微擬球藻提取物9 HYPERLINK l _Toc389600362 4 結(jié)論12 HYPERLINK l _Toc389600363 致謝13 HYPERLINK l _Toc389600364 參考文獻14PAGE 211 文獻綜述1.1 秀麗隱桿線蟲秀麗隱桿線蟲1（Caenorhabditis elegans）（

11、圖1）是一種多細胞真核生物，個體很小，以細菌為食，可獨立生存在溫度恒定環(huán)境中，對人、動植物沒有危害。成蟲1 mm左右，通體透明，在普通顯微鏡下可觀察。秀麗隱桿線蟲有很少的雄性個體，大多數(shù)為雌雄同體。秀麗隱桿線蟲生命周期很短，從卵到成蟲需要3.5 d，平均壽命約為23周2。雌雄同體個體產(chǎn)卵孵化后，會經(jīng)歷四個幼蟲期（L1-L4），L4期生有精子，并在成蟲期產(chǎn)卵。雄性也能使雌雄同體受精，且雌雄同體優(yōu)先選擇雄性的精子。當(dāng)族群擁擠或食物不足時，秀麗隱桿線蟲會進入dauer幼蟲期，dauer能對抗逆環(huán)境，而且不會老化。秀麗隱桿線蟲基因組測序完成，是第一個完成的多細胞動物基因序列測定的動物，它的基因組序列4

12、0%以上與人類同源。秀麗隱桿線蟲有5圖1 秀麗隱桿線蟲Fig.1 Caenorhabditis elegans1.2 秀麗隱桿線蟲研究進展秀麗隱桿線蟲最開始被用于研究發(fā)育生物學(xué)和神經(jīng)生物學(xué)，隨科學(xué)技術(shù)發(fā)展，對秀麗隱桿線蟲的廣泛研究，人們發(fā)現(xiàn)了調(diào)節(jié)器官發(fā)育及細胞程序性死亡的關(guān)鍵性的基因，也證明了這些基因同樣存在于高等動物中。這些研究開辟了研究人體細胞的分化及演變的道路，有利于研究很多疾病的發(fā)病機制。Brenner1選取了秀麗隱桿線蟲線蟲作為生物模型，開啟了一個嶄新的領(lǐng)域。秀麗隱桿線蟲具有結(jié)構(gòu)簡單、生命周期短、基因測序完成等優(yōu)點，使其作為一種模型生物得到廣泛應(yīng)用。秀麗隱桿線蟲作為優(yōu)秀的模型生物不僅

13、用于抗菌藥物的體內(nèi)研究，還被廣泛應(yīng)用于毒理學(xué)、基因組學(xué)、環(huán)境生物學(xué)、人類疾病模型的復(fù)制和干預(yù)。1.2.1 環(huán)境毒理學(xué)的研究隨著環(huán)境污染的嚴重，線蟲開始運用于環(huán)境毒理學(xué)的研究，環(huán)境中的重金屬、電輻射等毒素對人類的健康狀況產(chǎn)生嚴重的威脅，線蟲可以用來研究它們的作用機制，評估其危害性。線蟲模型如果能模擬毒素的作用機制，那么線蟲將更加廣泛的用于環(huán)境毒理學(xué)的研究3。1.2.2 程序性細胞死亡的研究秀麗隱桿線蟲為程序性細胞死亡研究奠定了基礎(chǔ)。Horvitz等4在秀麗隱桿線蟲身上發(fā)現(xiàn)了基因調(diào)控的程序性細胞死亡的存在，他們發(fā)現(xiàn)了兩個基因ced-3和ced-4，認為它們是發(fā)生細胞死亡的前提。后來，他們又發(fā)現(xiàn)了c

14、ed-9與ced-3和ced-4相互作用來阻止細胞死亡。對于程序性的細胞死亡的認識，使我們對一些疾病的發(fā)病機制有了新的理解，調(diào)控程序性的細胞死亡的功能性缺陷導(dǎo)致的疾病大體分為兩種，一種是由細胞病理性丟失過多，另一種是清除有害細胞的機能受損。對疾病本身的認識的加強為疾病的治療提供了思路，科學(xué)家現(xiàn)在已經(jīng)開始利用程序性細胞死亡的機理來研究治療惡性腫瘤的新辦法5。1.2.3 秀麗隱桿線蟲感染模型的建立研究細菌致病機制是用線蟲模型研發(fā)抗菌藥物的基礎(chǔ)。線蟲是一種簡單的模型生物，可以被很多病菌感染。周雨蒙等6建立了線蟲耐藥銅綠假單胞菌感染模型，在用抗生素治療線蟲的實驗中發(fā)現(xiàn)，可以排除毒性高、體內(nèi)外相關(guān)性差的

15、化合物，此模型為篩選得到具有良好體內(nèi)效果的新型抗菌化合物或生物活性物質(zhì)打下了基礎(chǔ)。陳麗紅等7建立了銅綠假單胞菌線蟲感染模型，確立了合適的銅綠假單胞菌培養(yǎng)時間和線蟲的感染時間，并研究了多種抗生素對線蟲的存活時間的影響，可以用于未知物質(zhì)用量相當(dāng)于等狀態(tài)下抗生素用量的計算。1.2.4 抗菌物質(zhì)作用機制的研究細菌的毒力的減弱是研發(fā)抗菌物質(zhì)的一個靶點，Ho等8通過感染秀麗隱桿線蟲研究發(fā)現(xiàn)，雷洛昔芬可以強烈的抑制銅綠假單胞菌的毒力的產(chǎn)生。實驗使用此藥物對野生型銅綠假單胞菌進行治療，結(jié)果發(fā)現(xiàn)細菌產(chǎn)生的綠膿菌素水平明顯下降。這些結(jié)果表明雷洛昔芬可能會被用于開發(fā)新型的療法以此來靶向治療銅綠假單胞菌的感染?，F(xiàn)在關(guān)

16、于銅綠假單胞菌中的拮抗細菌群體感應(yīng)系統(tǒng)的研究是一大熱點。以抑制QS系統(tǒng)為靶標(biāo)的分子抑制物，可用于研發(fā)新的抗菌物質(zhì)。Sarabhai等9利用秀麗隱桿線蟲模型實驗發(fā)現(xiàn)訶子的果實中的鞣花酸衍生物具有拮抗QS系統(tǒng)，阻斷了細菌細胞間的信號傳遞作用。它的機制是，減少了QS系統(tǒng)中兩個重要的基因的表達，同時減弱了革蘭氏陰性菌的信號分子AHL的表達，最后減弱了野生型銅綠假單胞菌的毒力并增加了它的生物膜對妥布霉素的敏感性。1.2.5 病菌致病機制和線蟲免疫機制的研究不同的病菌對線蟲的的致病機制并不一樣，線蟲自身也具有免疫機制。目前發(fā)現(xiàn)，可以感染線蟲的病菌都是通過生理途徑進行感染的。Irazoqui等10研究了銅綠

17、假單胞菌和金黃色葡萄球菌感染線蟲的致病機制。銅綠假單胞菌侵占線蟲腸道，產(chǎn)生與毒力因子有關(guān)的囊泡，在腸道細胞累積高電子密度生物被膜樣物質(zhì)，使腸道細胞變異。而金黃色葡萄球菌迅速感染細胞，破壞腸道絨毛，溶解線蟲細胞。金黃色葡萄球菌經(jīng)過熱滅后仍可以感染線蟲，這是因為其可以分泌有溶血活性的熱毒力因子。McEwan等11研究出銅綠假單胞菌會引起秀麗隱桿線蟲腸道的天然免疫力。線蟲沒有專門免疫細胞，線蟲腸道上皮細胞充當(dāng)防御系統(tǒng)，當(dāng)銅綠假單胞菌積累在線蟲腸道處，會增加線蟲的機體損傷或抗微生物相關(guān)基因的表達量。ToxA（外毒素A）是銅綠假單胞菌所表達的一種細菌毒素，線蟲感染了銅綠假單胞菌后，ToxA可以抑制線蟲體

18、內(nèi)蛋白質(zhì)的合成，線蟲通過識別ToxA激活體內(nèi)免疫基因的表達來抵抗銅綠假單胞菌的感染。1.3 白色念珠菌白色念珠菌（Candida albicans）（圖2）又稱白假絲酵母菌，是一種真菌，廣泛的存在于自然界，也存在于人體的口腔、上呼吸道等地，在正常機體中一般數(shù)量較少，不會引起疾病，是一種條件致病菌。白色念珠菌細胞呈圓形或卵圓形，直徑36 um，革蘭染色為陽性，出芽方式繁殖，真菌細胞出芽生成假菌絲，假菌絲長短不一，假菌絲收縮斷裂又成為芽生的菌絲。在適宜的培養(yǎng)基上芽生孢子及假菌絲生長，在假菌絲間其末端形成厚膜孢子。白色念珠菌在沙保氏培養(yǎng)基上呈乳白色偶見淡黃色，表面光滑有濃酵母氣味，培養(yǎng)時間稍長后則菌

19、落增大，顏色變深、質(zhì)地變硬或有褶皺。白色念珠菌感染和致病機制有附著、發(fā)芽、蛋白酶、菌落轉(zhuǎn)換，可以侵犯人體許多部位，如皮膚、黏膜等，會引起皮膚念珠菌病、黏膜念珠菌病、內(nèi)臟念珠菌病。最早用于治療酵母菌感染的特異性活性藥物是多霉菌素，它是上世紀中期分離的一種聚烯類抗生素，此后又有很多抗真菌藥物被研發(fā)出來，氟康唑是一種常用的抗白色念珠菌藥物，抗菌譜較廣，其機制主要為高度選擇性干擾真菌的細胞色素P-450的活性，從而抑制真菌細胞膜上麥角固醇的生物合成，達到抑菌效果。 圖2 白色念珠菌Fig. 2 Candida albicans 1.4 抗菌物質(zhì)的篩選抗生素的廣泛應(yīng)用，使越來越多的病菌具有了耐藥性，而新

20、型的抗菌藥物的發(fā)現(xiàn)時間變的更長，新型的抗菌物質(zhì)的研發(fā)進入了瓶頸，開發(fā)新型的抗菌物質(zhì)成為一個非常重要的任務(wù)。體外抗菌實驗方法簡單，但存在一些問題，為走出這種困境可以通過活體生物感染模型來解決。傳統(tǒng)的動物模型耗時長、耗費高、操作復(fù)雜，具有很多缺點，而線蟲具有結(jié)構(gòu)簡單、生命周期短、易于培養(yǎng)等優(yōu)點，另外其基因組序列40%以上與人類同源，許多基因和生物機制方面的高保守性，使線蟲成為體內(nèi)藥物篩選的優(yōu)秀模型。它可避免小白鼠模型的高成本、時間長的缺點，又可以提供相對完整的動物實驗?zāi)Ｐ?，因此可以很大程度降低藥物篩選的成本，適用于大規(guī)模的藥物篩選12。Moy等13建立了糞腸球菌感染的秀麗隱桿線蟲體內(nèi)抗感染物質(zhì)篩選

21、模型。他們在96孔板上進行篩選，篩選了1000多種天然產(chǎn)物還有6000余種合成化合物，篩選發(fā)現(xiàn)9種提取物和16種化合物可以使被糞腸球菌感染的線蟲的壽命延長。他們雖然利用線蟲活體篩選抗菌物質(zhì)的實驗方法很先進，但是也有很多缺點，有很多人工操作需要重復(fù)進行，還需要通過顯微鏡觀=觀察判斷線蟲死亡狀況，比較耗費人力和時間。隨后，他們對實驗方法進行改進，建立了全自動化和更微型化的384孔板采集分析的高通量篩選系統(tǒng)。他們采用這個系統(tǒng)篩選了37000個天然提取物和化合物，發(fā)現(xiàn)了28種沒有被報道過的具有抗菌活性的物質(zhì)14。Okoli等15建立了線蟲白色念珠菌感染模型的高通量篩選抗真菌物質(zhì)的系統(tǒng)。他們用這個系統(tǒng)篩

22、選了1900多種生物活性化合物和1280余種小分子合成化合物，篩選出了19種化合物具有抗真菌活性。Breger等16建立了白色念珠菌秀麗隱桿線蟲感染模型，篩選了1200余種已知藥理活性的化合物，他們發(fā)現(xiàn)了15個化合物能延長被感染的秀麗隱桿線蟲的壽命，而且可以抑制白色念珠菌在秀麗隱桿線蟲體內(nèi)形成假菌絲。用白色念珠菌秀麗隱桿線蟲模型篩選發(fā)現(xiàn)的抗真菌藥物在結(jié)構(gòu)上和現(xiàn)在的抗真菌藥物不具有相似性，可能存在不同作用機制，這為發(fā)現(xiàn)新型的復(fù)合型抗真菌藥物指明了方向。楊再昌等17采用金黃色葡萄球菌秀麗隱桿線蟲感染模型、銅綠假單胞菌秀麗隱桿線蟲感染模型，篩選了43種中草藥的體內(nèi)抗菌療效，發(fā)現(xiàn)8種中草藥具有體內(nèi)抗菌

23、作用。對9種提取物進行體外抗菌實驗，發(fā)現(xiàn)在1600 ug/ml時，除黃連外，其余8種提取物無抗菌活性，但是濃度低于1600 ug/ml時對線蟲產(chǎn)生保護作用。利用秀麗隱桿線蟲感染模型進行抗感染物質(zhì)篩選具有體外篩選不具備優(yōu)勢，它可以發(fā)現(xiàn)體外沒有抗菌活性但體內(nèi)有活性的物質(zhì)，以及一些新型抗感染機制的化合物，還可以篩選去除有毒化合物和體內(nèi)無效的化合物18。1.5 實驗研究意義秀麗隱桿線蟲作為一種模型生物為篩選抗菌物質(zhì)提供了良好的平臺，為新型抗菌物質(zhì)的研發(fā)提供了一個良好的工具，在研發(fā)新型抗菌藥的過程中諸多問題也可以通過對感染的活體動物模型研究來解決。因此，利用秀麗隱桿線蟲模型進行抗感染藥物篩選具有重要意義

24、19。雖然線蟲與人類基因有高度的保守性，作為模型生物在抗菌物質(zhì)體內(nèi)研究中表現(xiàn)出很大優(yōu)勢，然而，線蟲與人類在生理等方面還是有很大差異，線蟲不能在37下存活，線蟲不具備免疫系統(tǒng)，所以還需要進行其他的哺乳動物模型進行抗菌物質(zhì)篩選。線蟲還具有很強的解毒系統(tǒng)，這是因為細胞色素P450基因的原因，因此這就限制了一些可以調(diào)節(jié)宿主防御的化合物的發(fā)現(xiàn)。目前，秀麗隱桿線蟲只能用于初選抗感染藥物，新藥物的研發(fā)還需我們應(yīng)該正確認識秀麗隱桿線蟲在抗菌物質(zhì)篩選研究中的優(yōu)勢和缺點，然后設(shè)計合理周密的實驗方案，確保線蟲模型和人類疾病的某些一致性，只有這樣才能發(fā)揮線蟲模型這個體內(nèi)抗感染藥物篩選和體外抗感染研究橋梁的作用20。本

25、論文利用秀麗隱桿線蟲來篩選抗白色念珠菌的活性物質(zhì)，選取了常用抗真菌藥物氟康唑進行抗感染治療，驗證了秀麗隱桿線蟲模型的可行性。另選取了微擬球藻提取物，對線蟲進行抗感染治療，以此來探究微擬球藻提取物是否具有抗菌療效。2 材料和方法2.1 材料2.1.1 實驗藥品表1 實驗藥品Table 1 List of experimental regents試劑名稱純度級別生產(chǎn)廠家蛋白胨-上海東海制藥廠氯化鈉AR天津市永大化學(xué)試劑有限公司瓊脂-北京康倍斯科技有限公司膽固醇-北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司磷酸氫二鉀AR天津市瑞金特化學(xué)品有限公司磷酸二氫鉀AR天津市瑞金特化學(xué)品有限公司硫酸鎂AR天津市瑞金特化學(xué)品

26、有限公司氯化鈣AR天津市瑞金特化學(xué)品有限公司磷酸氫二納AR天津市永大化學(xué)試劑有限公司葡萄糖AR天津市瑞金特化學(xué)品有限公司酵母浸粉-北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司胰蛋白胨-北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司乙醇（95%）AR天津市永大化學(xué)試劑有限公司氫氧化鈉AR天津市永大化學(xué)試劑有限公司次氯酸鈉AR天津市富宇精細化工有限公司酵母浸粉2.1.2 實驗儀器表2 實驗儀器與生產(chǎn)廠家Table 2 List of experimental instruments儀器名稱型號生產(chǎn)廠家精密天平BSM-220.3上海卓精電子科技有限公司立式壓力蒸汽滅菌器YXQ-LS-75S11上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠單人單

27、面凈化工作臺SW-CJ-1FD蘇州凈化設(shè)備有限公司臺式高速離心機TGL-16江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠振蕩培養(yǎng)箱BS-1E（A）東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司2.1.3 線蟲和菌株 N2野生型秀麗隱桿線蟲（購自CGC）、尿嘧啶缺陷型大腸桿菌OP50（購自CGC）、白色念珠菌（濱州醫(yī)學(xué)院惠贈）。2.1.4 培養(yǎng)基NGM培養(yǎng)基 1000 ml的培養(yǎng)基加入2.5 g蛋白胨，3 g NaCl，17 g瓊脂，975 ml蒸餾水，滅菌后分別加入單獨滅菌的l mol/L K2HPO4 - KH2PO4緩沖液（pH6.0）25 ml，1 mol/L MgSO4 1 ml，1 mol/L CaCl2 1 ml，1 ml膽

28、固醇溶液（LB培養(yǎng)基 1000 ml培養(yǎng)基含有胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 2.沙保氏培養(yǎng)基 1000 ml培養(yǎng)基中含40 g葡萄糖和10 g蛋白胨，pH 4.06.0，用于真菌培養(yǎng)。YPD液體培養(yǎng)基 900 ml蒸餾水中含10 g酵母提取物和20 g蛋白胨，100 ml2.1.5 試劑M9緩沖液 1000 ml的M9緩沖液含6 g Na2HPO4，3 g KH2PO4，5 g NaCl，0.25 g 線蟲裂解液 每5 ml含有3.4 ml蒸餾水，0.6 ml NaClO，1 ml 8 mol/L NaOH，現(xiàn)用現(xiàn)配。2.2 方法2.2.1 線蟲培養(yǎng)和保存秀麗隱桿線蟲培養(yǎng)時選用

29、大腸桿菌OP50作為其食物，在NGM培養(yǎng)基上生長培養(yǎng)。挑取大腸桿菌OP50單菌落于 LB液體培養(yǎng)基中，37 過夜振蕩培養(yǎng)，制成菌懸液。吸取少量菌懸液涂布到NGM平板，培養(yǎng)24h。用M9緩沖液清洗線蟲，靜置后去掉上清液，沉淀物接種到NGM培養(yǎng)基上，放于20 的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天，可看到培養(yǎng)基上有大量線蟲21實驗室中可將線蟲放入30 %甘油中，在-80 下保存222.2.2 線蟲同步化 選用生長狀態(tài)良好的平板，用M9緩沖液將蟲體洗于玻璃管中，等蟲體沉降后吸去上清液，加入線蟲裂解液，旋渦震蕩5 min至蟲體裂解，將其轉(zhuǎn)移至離心管中800 r/min離心1 min，吸去上清液，加入M9緩沖液，重復(fù)離

30、心2次，吸去上清液，得到蟲卵，將其放入新的NGM平板的大腸桿菌OP50菌苔上，20 生長2天，得到同步化的2.2.3 線蟲真菌感染 選取白色念珠菌單菌落于50 ml的YPD液體培養(yǎng)基中，30 ，振蕩培養(yǎng)24 h，吸取80 ul菌液于沙保氏平板，涂布，30 培養(yǎng)24 h，得到白色念珠菌感染平板。將同步化的L4時期線蟲從大腸桿菌OP50菌苔用M9緩沖液洗下，將其轉(zhuǎn)移至沙保氏平板生長的白色念珠菌菌苔上進行感染，培養(yǎng)2.2.4 線蟲抗感染治療 將經(jīng)過感染的線蟲從白色念珠菌菌苔上洗下，M9緩沖液清洗后，加入M9緩沖液，轉(zhuǎn)移至96孔板中培養(yǎng),每個孔中加入300ul含有線蟲的M9緩沖液。第一列孔為陰性對照，

31、不加入任何物質(zhì)，其后各孔加入不同劑量的藥物，使各孔中的藥物濃度有所差異，對線蟲進行抗菌治療。每次實驗做3組平行。 另取一經(jīng)過白色念珠菌感染線蟲，將其用M9緩沖液洗下，加入M9緩沖液，轉(zhuǎn)移至96孔板中培養(yǎng)。第一列孔為陰性對照，不加入任何物質(zhì)，其后各孔加入不同劑量的微擬球藻提取物，對線蟲進行抗菌治療。每次實驗做3組平行。2.2.5 觀察 將96孔板置于顯微鏡觀察，活線蟲呈正弦狀（圖3a），而死亡線蟲呈直線型（圖3b），記錄存活的線蟲數(shù)量。每個孔的線蟲的存活率單獨計算，然后取三個孔的的平均值。 a. 線蟲存活狀態(tài) b. 線蟲死亡狀態(tài)圖3 秀麗隱桿線蟲感染前后狀態(tài)Fig. 3 Different st

32、atus of C.elegans before and after bacterial infection 3 實驗結(jié)果分析3.1 氟康唑治療效果實驗選用臨床常用的抗真菌藥物氟康唑?qū)Ω腥景咨钪榫?0 min的線蟲進行治療。根據(jù)氟康唑藥品使用說明，人體的正常用藥血液中含量為45 mg/L60 mg/L。本實驗初步選用藥物濃度為2.5 mg/L、5 mg/L、10 mg/L、15 mg/L、20 mg/L，連續(xù)觀察記錄線蟲存活情況，直到第六天對照組死亡，結(jié)果如圖4所示。圖4 不同濃度的氟康唑?qū)Ω腥揪€蟲的療效Fig.4 Effect of different concentrations of

33、fluconazole on infection elegans 由圖4可知，不同濃度的氟康唑?qū)Ω腥景咨钪榫木€蟲療效不同。濃度較低時，治療效果相對較差，隨著氟康唑濃度的增加，治療效果越好，但并不是濃度越高越好，濃度過高對線蟲產(chǎn)生一定的毒副作用，會導(dǎo)致線蟲死亡。線蟲感染白色念珠菌10 min以后，添加1020 mg/L的氟康唑治療效果比較好，在一定劑量范圍內(nèi)，治療效果與劑量成線性關(guān)聯(lián)。3.2 篩選可用于治療白色念珠菌的微擬球藻提取物用95%乙醇浸提微擬球藻浸粉，得到乙醇浸膏，分別用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，得到3種萃取相和水相，用得到的正丁醇萃取相上大孔樹脂D101，分別用40%、60%

34、、80%乙醇洗脫得到洗脫液。本次實驗用的微擬球藻提取物為水相提取物和正丁醇相40%、60%、80%乙醇洗脫液。采用40%乙醇洗脫液進行抗菌治療，分別加入5ul、10ul、20ul劑量進行治療，連續(xù)觀察記錄線蟲存活狀況，直到線蟲死亡，結(jié)果如圖5所示。圖5 40%乙醇洗脫液對感染線蟲的療效Fig. 5 Effect of the 40% ethanol eluent on infection elegans 采用60%乙醇洗脫液進行抗菌治療，分別加入5ul、10ul、20ul劑量進行治療，連續(xù)觀察記錄線蟲存活狀況，直到線蟲死亡，結(jié)果如圖6所示。圖6 60 %乙醇洗脫液對感染線蟲的療效Fig. 6

35、Effect of the 60 % ethanol eluent on infection elegans采用80%乙醇洗脫液進行抗菌治療，分別加入5ul、10ul、20ul劑量進行治療，連續(xù)觀察記錄線蟲存活狀況，直到線蟲死亡，結(jié)果如圖7所示。圖7 80%乙醇洗脫液對感染線蟲的療效Fig.7 Effect of the 80% ethanol eluent on infection elegans乙醇洗脫液中含有一定量的乙醇，可能會對實驗有一定影響，因此用乙醇做一組對照實驗，觀察線蟲存活情況，發(fā)現(xiàn)對線蟲存活無明顯影響，因此可以排除乙醇對實驗的影響。采用水相提取物進行抗菌治療，分別加入2.5u

36、l、5ul、10ul、20ul劑量進行治療，連續(xù)觀察記錄線蟲存活狀況，直到線蟲死亡，結(jié)果如圖8所示。圖8 水相提取物對感染線蟲的療效Fig.8 Effect of the aqueous extract on infection elegans由以上4個圖可知，微擬球藻的正丁醇萃取相40%、60%、80%乙醇洗脫液，與對照組相比較不具有抗菌療效；水相提取物與對照組相比，同樣不具有抗菌效果，加入量過多還會引起線蟲死亡。4 結(jié)論氟康唑是一種常用的抗白色念珠菌藥物，抗菌譜較廣，其機制主要為高度選擇性干擾真菌的細胞色素P-450的活性，從而抑制真菌細胞膜上麥角固醇的生物合成，達到抑菌效果。本次實驗分別

37、選用氟康唑和微擬球藻提取物對感染了白色念珠菌的秀麗隱桿線蟲進行治療。選用氟康唑?qū)Ω腥揪€蟲進行治療，在一定劑量范圍內(nèi)，治療效果與劑量呈線性關(guān)系，添加1020 mg/L的氟康唑治療效果較好。選用微擬球藻提取物對感染線蟲進行治療，發(fā)現(xiàn)不具備抗菌療效。致謝參考文獻1 Brenner S. The genetics of Caenorhabditis elegansJ. Genetics, 1974, 77: 7194. 2 趙晴, 蔣湉湉. 秀麗隱桿線蟲研究綜述J. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2010, 38(19): 1009210095.3 賈熙華, 曹誠. 秀麗隱桿線蟲在醫(yī)藥學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用和進展J. 藥學(xué)學(xué)

38、報, 2009, 44(7): 687694 .4 Ellis HM, Horvitz HR. Genetic control of programmed cell death in the nematode C.elegansJ. Cell, 1986, 44(6): 817829. 5 劉恩岐, 倉林讓. 模型動物秀麗隱桿線蟲研究進展J. 動物科學(xué)與動物醫(yī)學(xué), 2003, 20(10): 110112.6 周雨朦, 陳代杰, 李繼安, 邵雷, 朱春寶. 秀麗隱桿線蟲耐藥銅綠假單胞菌感染模型的建立J. 中國抗生素雜志, 2011, 36(7): 511514. 7 陳麗紅, 孫利芹, 王長海

39、. 利用秀麗隱桿線蟲構(gòu)建抗菌物質(zhì)體內(nèi)篩選模型J. 煙臺大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)與工程版), 2012, 25(2): 117121.8 Ho Sui S J, Lo R, Femandes A R, et al. Raloxifence attenuates Pseudomonas aeruginosa pyocyanin production and virulenceJ. Int J Antimicrob Agents, 2012, 40(3): 246251. 9 Sarabhai S, Sharma P, Capalash N. Ellagic acid derivatives from T

40、erminalia chebula Retz. Downregulate the expression of quorum sensing genes to attenuate Pseudomonas aeruginosa PAO1 virulenceJ. PLoS One, 2013, 8(1): e53441. 10 Irazoqui J E, Troemel E R, Feinbaum R L, et al. Distinct pathogenesis and host responses during infection of C.elegans by P.aeruginosa and

41、 S.aureusJ. PLoS Pathog, 2010, 6(7): e1000982. 11 McEwan D L, Kirienko N V, Ausubel F M. Host translational inhibition by Pseudomonas aeruginosa exotoxin A triggers an immune response in Caenorhabditis elegansJ. Cell Host Microbe, 2012, 11(4): 364374.12 史秋佳, 楊劍萍, 陳纘光. 秀麗隱桿線蟲作為抗感染藥物篩選模型的研究進展J. 中國藥理學(xué)通報, 2013, 29(10): 13331337. 13 Moy T I, Ball A R, Anklesaria Z, et al. Iden