低溫高鹽雙重脅迫及對(duì)其抗效應(yīng)初探課件

1、低溫/高鹽雙重脅迫及對(duì)其抗性效應(yīng)初探制 作 人：夏云劍年 級(jí)： 02級(jí)專 業(yè)：生物科學(xué)指導(dǎo)老師：郝再彬，蒼晶，史芝文教授前言隨著全球環(huán)境問題的日益突出，人類賴以生存的作物生產(chǎn)和糧食供應(yīng)直接受到威脅，因而研究植物的逆境適應(yīng)機(jī)理對(duì)指導(dǎo)作物栽培以及培育抗逆、高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)作物新品種具有重要的理論意義1。近年來，關(guān)于各種逆境因子（高溫、干旱、冷害、凍害、鹽堿等）影響和破壞植物正常代謝的表現(xiàn)和作用機(jī)制已有了大量較為深入的研究，但是對(duì)于雙重或者多重脅迫影響植物生長的報(bào)道卻很少。然而事實(shí)上植物在生長發(fā)育過程中往往同時(shí)受多種逆境的作用，如干旱與低溫，低溫與鹽堿，水澇、鹽堿與機(jī)械損傷（刮風(fēng)）等。因而探索雙重脅迫對(duì)植

2、物生長的影響以及雙重脅迫與各個(gè)單一的脅迫間的關(guān)系，具有更大的理論意義和現(xiàn)實(shí)意義。近年來對(duì)Ca2+的研究表明以Ca2+為核心的鈣信使系統(tǒng)可能在植物對(duì)逆境的感受和適應(yīng)中起中心作用，從而調(diào)節(jié)植物對(duì)逆境脅迫的一系列反應(yīng)過程2。但是目前多數(shù)研究只針對(duì)Ca2+提高植物對(duì)某種單一脅迫抗性的影響，而外源Ca2+處理對(duì)植物多重抗逆性影響的研究還未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)分別采用水浸種和CaCl2浸種，研究了低溫/高鹽雙重脅迫下甜玉米幼苗的各項(xiàng)生理指標(biāo)的變化，并與單一低溫、高鹽脅迫相比較，初步探討雙重脅迫對(duì)甜玉米幼苗生長的影響，以及與各單一脅迫間的關(guān)系。同時(shí)研究了外源Ca2+處理對(duì)甜玉米抗低溫、高鹽和低溫/高鹽雙重脅迫能力

3、的影響，試圖為植物對(duì)多重脅迫間的交叉適應(yīng)機(jī)制以及鈣信使系統(tǒng)與植物抗逆性的關(guān)系的研究提供一些理論參考，并為“廣譜”抗逆作物品種的選育以及甜玉米的推廣種植提供理論依據(jù)。1材料與方法1.1實(shí)驗(yàn)材料： “甜研3號(hào)”玉米，由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院育種實(shí)驗(yàn)室提供。 1.2幼苗的培養(yǎng)及脅迫處理；1.3測(cè)定項(xiàng)目及方法。幼苗的培養(yǎng)及脅迫處理：挑選籽粒飽滿的玉米種子，用75%的乙醇溶液浸泡10S，再用5%的Ca（ClO）2溶液消毒10min，分成兩組，分別用蒸餾水和0.5%的CaCl2溶液在黑暗條件下浸種14hr。25恒溫培養(yǎng)箱中催芽3d，轉(zhuǎn)入光周期14小時(shí)的25恒溫培養(yǎng)箱中用1/2完全營養(yǎng)液培養(yǎng)。3d后去胚乳，換用

4、完全營養(yǎng)液。從浸種起第14d，挑選長勢(shì)較為一致的幼苗，平均分成8組，作如下處理：測(cè)定項(xiàng)目及方法葉綠素含量測(cè)定：722型分光光度計(jì)丙酮法3； 根系活力的測(cè)定：TTC法3； 外滲電導(dǎo)率測(cè)定： DDS-307電導(dǎo)儀法3； 脯胺酸含量測(cè)定：磺基水楊酸法3。2結(jié)果分析2.1 CaCl2浸種對(duì)單一和雙重脅迫下甜玉米幼苗葉綠素含量的影響：2.2 CaCl2浸種對(duì)單一和雙重脅迫下甜玉米幼苗脯氨酸含量的影響：2.3 CaCl2浸種對(duì)單一和雙重脅迫下甜玉米幼苗相對(duì)外滲電導(dǎo)率的影響：2.4 CaCl2浸種對(duì)單一和雙重脅迫下甜玉米幼苗根系活力的影響：CaCl2浸種對(duì)單一和雙重脅迫下甜玉米幼苗葉綠素含量的影響由表2中可

5、以看出，第3、5、7組三種脅迫處理均使甜玉米幼苗葉綠素含量降低，降低狀況為735，相對(duì)于第1組（CK1）分別降低了67.93%、36.48%和26.32%。而第4、6、8組相對(duì)于第2組分別降低了22.35%、16.35%和58.19%，表明雙重脅迫對(duì)葉綠素含量的影響要超過單一脅迫的加和，兩種脅迫間存在著相互促進(jìn)的作用。而經(jīng)過CaCl2浸種的各組（第2、4、6、8組）的葉綠素含量均比對(duì)應(yīng)的水浸組（第1、3、5、7組）要高（見圖1），分別高出約1.04%、23.51%、14.71%和31.74%，表明CaCl2浸種能夠明顯提高甜玉米幼苗抵抗單一和雙重脅迫的能力，且在一定范圍內(nèi)，脅迫強(qiáng)度越高，這種作

6、用似乎越明顯。CaCl2浸種對(duì)單一和雙重脅迫下甜玉米幼苗脯氨酸含量的影響植物在逆境條件下積累脯氨酸是一種較普遍的現(xiàn)象,脯氨酸能調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透壓，保護(hù)酶和膜的結(jié)構(gòu),其積累也是細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能受損傷的表現(xiàn)4。由表2可以看出，單一和雙重脅迫均使甜玉米幼苗葉片中的脯氨酸含量增加。增加狀況水浸種組為753，相對(duì)于第1組(CK1)分別增加了326.99%、221.65%和17.92%；CaCl2浸種組為864，相對(duì)于第2組(CK2)分別增加了554.36%、405.48%和48.92%。這表明雙重脅迫處理的甜玉米幼苗細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能受損傷的程度要比單重脅迫處理的更大，也超過了單一脅迫的加和，說明雙重脅迫間很可能

7、存在著相互促進(jìn)的關(guān)系。從圖2可以看出，除第2組外，CaCl2浸種組的脯氨酸含量都比對(duì)應(yīng)的水處理組要高，這表明CaCl2浸種組的植株受脅迫損害的程度反而更大，原因之一可能與CaCl2浸種時(shí)Cl-的毒害作用有關(guān)，有待進(jìn)一步細(xì)加研究。CaCl2浸種對(duì)單一和雙重脅迫下甜玉米幼苗相對(duì)外滲電導(dǎo)率的影響由表2可看出，單一和雙重脅迫下甜玉米幼苗的相對(duì)外滲電導(dǎo)率均升高，其中水浸種組升高狀況為573，相對(duì)于CK1分別升高了344.90%、330.99%和49.01%；CaCl2浸種組升高狀況為864，相對(duì)于CK2分別升高了301.67%、205.93%和28.80%。外滲電導(dǎo)率的升高表明細(xì)胞內(nèi)電解質(zhì)外滲和細(xì)胞膜相

8、對(duì)透性的增加。韓永華等報(bào)道，高溫/滲透雙重脅迫處理比單重處理的相對(duì)外滲電導(dǎo)率升高更多5 ，這與本實(shí)驗(yàn)CaCl2浸種組的結(jié)果相一致。而水浸種組的第7組反而略低于第5組，除了實(shí)驗(yàn)可能的誤差原因外，我們推測(cè)兩種脅迫間可能存在著相互拮抗的關(guān)系。比較水浸種組和CaCl2浸種組（圖3），我們發(fā)現(xiàn)后者的相對(duì)電導(dǎo)率總體上大于前者，特別是雙重脅迫處理組表現(xiàn)的最明顯，表明CaCl2浸種組在受脅迫時(shí)細(xì)胞膜的透性變化反而更大，對(duì)逆境脅迫的抵抗能力有所降低。其原因可能也與Cl-的毒害作用有關(guān)。CaCl2浸種對(duì)單一和雙重脅迫下甜玉米幼苗根系活力的影響 根系活力可以反映根系生長發(fā)育的好壞和吸收能力的強(qiáng)弱。由表2可得，水浸種

9、組和CaCl2浸種組在受脅迫時(shí)根系的活力均急劇下降。其中，前者的下降狀況為753，相對(duì)于CK1分別減少了56.25%、50.00%和1.01%，其中第5、7兩組下降達(dá)50%以上，受脅迫傷害嚴(yán)重，當(dāng)解除脅迫時(shí)幼苗已無法恢復(fù)生長；后者下降狀況為864，相對(duì)于CK2分別減少了96.55%、51.72%和14.59%，第8組根系基本上已失活。而從圖4可以看出，CaCl2浸種組的根系活力總體上高于水浸種組，且隨著脅迫強(qiáng)度的增加而逐漸減少差距，最后第8組的根系活力反而遠(yuǎn)小于第7組。表明CaCl2浸種能夠在一定的脅迫強(qiáng)度內(nèi)提高植物的抗逆性，但這種提高作用是有限的，當(dāng)逆境脅迫超過一定的極限強(qiáng)度時(shí)，CaCl2浸

10、種不但無法借助Ca2+提高植物的抗逆性，而且還會(huì)因?yàn)镃l-的毒害作用而加大脅迫強(qiáng)度。3 討論：3.1雙重脅迫與各單一脅迫間的關(guān)系； 3.2CaCl2浸種提高植物抗逆性的機(jī)理關(guān)于雙重脅迫與各單一脅迫間關(guān)系的猜想 由于多重脅迫對(duì)植物生長的影響方面的參考文獻(xiàn)報(bào)道較少，我們這兒暫且用“猜想”一詞。先看一些近似的研究：宰學(xué)明等報(bào)道，大豆種子萌發(fā)前經(jīng)低溫預(yù)處理能有效提高種子的萌發(fā)活力，有利于種子的萌發(fā)和幼苗的生長6 ，表明逆境鍛煉在一定程度上對(duì)植物的生長是有利的。龔明等研究發(fā)現(xiàn)，熱激（非致死性高溫脅迫）處理能夠提高植物抗鹽堿脅迫的能力。并進(jìn)一步指出，植物對(duì)不同逆境脅迫間存在著交叉適應(yīng)的機(jī)制，即當(dāng)植物經(jīng)受某

11、種脅迫后，不僅對(duì)這種脅迫的抗性提高，而且對(duì)其他脅迫的抵抗也增強(qiáng)7 。這一研究雖未闡明交叉適應(yīng)的機(jī)制，但從側(cè)面證明多重脅迫間可能有著相互抑制的關(guān)系，即多重脅迫效果應(yīng)小于各單一脅迫效果的加和，甚至小于各單一脅迫。而韓永華等研究了高溫/滲透雙重脅迫對(duì)大豆某些生理反應(yīng)的影響，結(jié)果表明雙重脅迫在致使葉片含水量降低、電解質(zhì)外滲和膜脂過氧化損傷方面的效應(yīng)是單一脅迫的累加，并推測(cè)多重脅迫對(duì)作物的傷害應(yīng)比單一脅迫要大得多5 。這一結(jié)論恰好與前兩者相反。這一問題有待研究，我們暫且不討論.反應(yīng)速率溫度/pH值但是，當(dāng)溫度和pH值同時(shí)作用時(shí)，圖象又是什么樣的呢？溫度低溫 高溫 對(duì)生長的影響由酶的活性我們回到脅迫效應(yīng)。

12、一般情況下，脅迫強(qiáng)度越大，植物受傷害的程度越大，則體內(nèi)酶活性越低，而且脅迫處理還要考慮時(shí)間長短的問題，那么脅迫強(qiáng)度對(duì)植物生長的影響可以用右圖關(guān)系表示：鹽堿度缺素 高鹽 對(duì)生長的影響ttt從以上的討論我們可以猜想，這種累加效應(yīng)可能與機(jī)械振動(dòng)的疊加效應(yīng)相似，應(yīng)同時(shí)考慮振源、頻率和振幅。在植物體中，對(duì)各種逆境脅迫作出反應(yīng)的細(xì)胞功能部位，或者說是控制各種抗逆蛋白表達(dá)的基因序列，可看作是振源；植物對(duì)各種脅迫的反應(yīng)速度可看作是振動(dòng)頻率；而植物對(duì)逆境的反應(yīng)強(qiáng)度可以看作是振幅。由這三個(gè)基本參數(shù)是否可以建立一個(gè)計(jì)算多重脅迫疊加效果的數(shù)學(xué)關(guān)系式呢？或許我們可以采用不同的植物，進(jìn)行不同的處理方法、處理強(qiáng)度、處理時(shí)間

13、以及處理順序，根據(jù)得出的數(shù)據(jù)來研究多重脅迫與單一脅迫間的關(guān)系。雙重脅迫強(qiáng)度對(duì)生長的影響同樣我們會(huì)問:當(dāng)?shù)蜏睾透啕}兩種脅迫同時(shí)作用時(shí)，圖象又是什么樣的呢？t如果條件允許，我們希望在這一方面作進(jìn)一步深入的研究。CaCl2浸種提高植物抗逆性的機(jī)理Ca2+作為植物生長的必需營養(yǎng)元素之一，不僅具有穩(wěn)定膜結(jié)構(gòu)和某些酶分子結(jié)構(gòu)的作用，而且還作為第二信使在植物體對(duì)外界信號(hào)的感受、傳遞和反應(yīng)過程中起著中心環(huán)節(jié)的作用。龔明等研究指出，通常細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中的Ca2+要比細(xì)胞外和細(xì)胞器中低，約相差103104數(shù)量級(jí)，所以細(xì)胞外Ca2+的進(jìn)入和細(xì)胞器中Ca2+的釋放均能引起細(xì)胞質(zhì)中Ca2+較大的升高。當(dāng)達(dá)到閾值時(shí)，Ca2+

14、 和CaM形成Ca-CaM復(fù)合物。此復(fù)合物作用于靶酶或引發(fā)蛋白質(zhì)磷酸化等，激活某些酶類，最終啟動(dòng)各種生理生化反應(yīng)機(jī)制2 。其過程可由右圖表示：環(huán)境脅迫誘導(dǎo)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)示意圖用CaCl2浸種時(shí)，Ca2+進(jìn)入細(xì)胞間隙，大大提高了玉米種子細(xì)胞外的Ca2+含量，此時(shí)種子代謝活力弱，細(xì)胞處于“鈍化”狀態(tài)，外界高濃度的Ca2+也難以進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，僅與膜相互作用，提高膜的穩(wěn)定性，為逆境脅迫下抵抗膜的傷害做準(zhǔn)備。當(dāng)玉米種子萌發(fā)后，因活細(xì)胞內(nèi)外巨大的電化學(xué)梯度，Ca2+被動(dòng)擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞，同時(shí)利用代謝加強(qiáng)后提供的能量通過主動(dòng)運(yùn)輸進(jìn)入。因此CaCl2浸種通過增加外源Ca2+來提高細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平，使之更接近閾值。

15、當(dāng)?shù)蜏亍Ⅺ}堿等脅迫信號(hào)被感知時(shí)，引發(fā)整個(gè)Ca-CaM相偶聯(lián)的生理生化機(jī)制，使得細(xì)胞及早啟動(dòng)逆境適應(yīng)機(jī)制，盡量避免或減輕傷害。水浸種處理的幼苗，因?yàn)镃a2+水平升高緩慢而使抗逆機(jī)制啟動(dòng)延遲，或者因脅迫強(qiáng)度過大使膜結(jié)合Ca2+大量脫離，以及細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+積累過多直接造成膜結(jié)構(gòu)損傷和細(xì)胞內(nèi)Ca2+毒害，從而引起細(xì)胞內(nèi)生理生化反應(yīng)紊亂，致使毒害發(fā)生2。 CaCl2浸種提高植物的抗逆性的原因需要指出的是，CaCl2浸種對(duì)提高細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平進(jìn)而提高植物的抗逆性的作用是有限的。我們認(rèn)為當(dāng)植物所受脅迫強(qiáng)度過大，特別是在多重脅迫同時(shí)作用，超過植物的致死脅迫強(qiáng)度時(shí)，外源Ca2+處理不一定能夠起到保護(hù)的作用

16、，甚至還可能會(huì)加重對(duì)植物的傷害。要從根本上解決植物抗逆性問題，可以通過植物基因工程技術(shù)培育耐鹽植物新品種，這是當(dāng)前國際上的熱門研究課題之一。國內(nèi)有相關(guān)報(bào)道，如東北林業(yè)大學(xué)鹽堿地生物資源環(huán)境研究中心在國內(nèi)首次提取植物耐鹽堿基因，轉(zhuǎn)入該基因后的植物具有較強(qiáng)的耐鹽堿能力，有望在碳酸鈉或碳酸氫鈉鹽堿地上長出蔬菜瓜果。山東師范大學(xué)的趙彥修教授和張慧教授從鹽生植物堿蓬中成功地克隆出一種耐鹽關(guān)鍵基因，把該基因轉(zhuǎn)移到植物擬南芥中，在1/2海水澆灌條件下，擬南芥能完成生活史；在盆栽條件下，15天不澆水，復(fù)水后仍能恢復(fù)生長并結(jié)實(shí)，而對(duì)照株均死亡。據(jù)張慧介紹，在所有已知公開發(fā)表的資料中，中國科學(xué)家培育的轉(zhuǎn)基因植物耐鹽性是最強(qiáng)的。我校在這方面也有深入的研究。致謝本實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)、操作和課件制作得到了史芝文教授、郝再彬教授、蒼晶教授的悉心指導(dǎo)；也得益于生物學(xué)021班全體同學(xué)的團(tuán)結(jié)協(xié)作和熱情支持在此表示感謝！參 考 文 獻(xiàn)1武維華植物生理學(xué)，北京：科學(xué)出版社，20032郭麗紅等氯化鈣浸種對(duì)玉米幼苗抗逆性的影響及谷胱甘