生物酶工程專(zhuān)業(yè)知識(shí)市公開(kāi)課獲獎(jiǎng)?wù)n件

1、Advanced Enzyme Engineering第九章 生物酶工程第1頁(yè)第1頁(yè)Contents一、生物酶工程定義二、生物酶工程內(nèi)容三、生物酶工程前景GoGoGo第2頁(yè)第2頁(yè) 生物酶工程是酶學(xué)和以基因重組技術(shù)為主當(dāng)代分子生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合產(chǎn)物，亦稱(chēng)高級(jí)酶工程(Advanced Enzyme Engineering)。一、 生物酶工程1. 定義第3頁(yè)第3頁(yè)二、 生物酶工程內(nèi)容（3） 從蛋白質(zhì)或基因水平上設(shè)計(jì)，合成酶雜合體或自然界不曾有酶（雜合酶）。生物酶工程主要包括：（1） 用基因工程技術(shù)大量生產(chǎn)酶（克隆酶）；（2） 修飾酶基因產(chǎn)生遺傳修飾酶（突變酶）；第4頁(yè)第4頁(yè)（4） 抗體酶；（5） 核酶

2、。第5頁(yè)第5頁(yè) 通過(guò)基因工程手段，克隆各種天然酶基因，將其克隆到表示載體中，然后將表示載體轉(zhuǎn)化到適當(dāng)宿主中，得到表示特定酶基因工程菌，通過(guò)基因工程菌繁殖大量產(chǎn)生酶稱(chēng)為克隆酶。 1. 克隆酶（1）克隆酶定義：第6頁(yè)第6頁(yè)克隆酶圖例基因工程菌載體宿主生物體發(fā)酵克隆酶酶基因第7頁(yè)第7頁(yè) 外源基因轉(zhuǎn)入微生物宿主細(xì)胞內(nèi)，與宿主細(xì)胞遺傳物質(zhì)相結(jié)合，后代宿主遺傳物質(zhì)中含有外源基因，這種帶上人工賦予新遺傳特性宿主微生物，被稱(chēng)為基因工程菌。2. 基因工程菌定義第8頁(yè)第8頁(yè)（1）在宿主細(xì)胞內(nèi)能夠自主復(fù)制；（2）克隆酶對(duì)載體要求（2）容易引入受體細(xì)胞；（3）含有適當(dāng)篩選標(biāo)識(shí)基因；（4）含有少數(shù)限制性酶切位點(diǎn)。第9頁(yè)

3、第9頁(yè)（3）克隆酶對(duì)宿主要求（1）安全可靠，非致病菌；（3）有助于酶分離和純化；（5）容易培養(yǎng)和管理。（4）能利用廉價(jià)原料，發(fā)酵周期短，產(chǎn)量高；（2）外源基因在宿主內(nèi)能夠表示且不被分解；第10頁(yè)第10頁(yè)（4）克隆酶基因表示系統(tǒng)原核生物基因表示系統(tǒng)真核生物基因表示系統(tǒng) 1. 酵母表示系統(tǒng) 2. 植物表示系統(tǒng) 3. 動(dòng)物表示系統(tǒng) 4. 絲狀真菌表示系統(tǒng)第11頁(yè)第11頁(yè) 纖維素酶基因工程菌構(gòu)建（5） 克隆酶實(shí)例第12頁(yè)第12頁(yè) 纖維素酶 纖維素酶在食品、飼料、造紙、紡織等行業(yè)含有廣泛用途。但由于天然纖維素酶產(chǎn)量低、起源有限而造成其大規(guī)模應(yīng)用受到限制。 纖維素酶（cellulase）是能將纖維素水解為

4、葡萄糖等簡(jiǎn)樸糖類(lèi)一組酶總稱(chēng)。第13頁(yè)第13頁(yè) 為此，通過(guò)基因工程技術(shù)，克隆福壽螺體內(nèi)纖維素酶基因，構(gòu)建含有cel基因工程菌，以期通過(guò)液體培養(yǎng)或固體培養(yǎng)方式得到大量克隆纖維素酶。第14頁(yè)第14頁(yè)afp基因轉(zhuǎn)化受體低溫篩選技術(shù)路線1A.bgpdL.egpdV.vgpd+表示載體PEG介導(dǎo)轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化電激轉(zhuǎn)化分子鑒定原生質(zhì)體或菌絲球建立轉(zhuǎn)化體系低溫篩選體系建立第15頁(yè)第15頁(yè)技術(shù)路線2Cel基因工程菌株篩選液體發(fā)酵分離純化第16頁(yè)第16頁(yè) 定義：利用有控制地對(duì)天然酶基因進(jìn)行剪切、修飾或突變，從而改變這些酶催化特性、底物專(zhuān)一性或穩(wěn)定性，使之愈加符合人們需要。 2. 突變酶第17頁(yè)第17頁(yè)遺傳修飾

5、改變酶性能大體有：（1）提升酶活性 （2）提升酶穩(wěn)定性（3）改變底物專(zhuān)一性 （4）改變酶最適pH值（5）改變酶對(duì)輔酶要求（6）改變酶別構(gòu)調(diào)整能力第18頁(yè)第18頁(yè)修飾酶基因辦法主要辦法 （i）定位突變 （ii）體外定向進(jìn)化 第19頁(yè)第19頁(yè) 定位突變（site-directed mutagenesis）是依據(jù)酶結(jié)構(gòu)、功效和作用機(jī)制信息，在基因水平上準(zhǔn)確改變酶分子中氨基酸殘基，對(duì)酶性質(zhì)和其催化特性進(jìn)行改造，產(chǎn)生符合特定需要酶。 （i）定位突變第20頁(yè)第20頁(yè)盒式誘變寡聚苷酸引物誘變PCR誘變辦法：第21頁(yè)第21頁(yè)（1）盒式誘變?cè)恚豪靡欢稳斯ず铣珊型蛔冃蛄泄丫酆烁仕崞危ü押烁仕岷校琌ligo

6、nucleotide Cassette），取代野生型基因中相應(yīng)序列。第22頁(yè)第22頁(yè)HindIIIEcoRIHindIIIEcoRI+第23頁(yè)第23頁(yè)（2）寡聚苷酸引物誘變?cè)恚河没瘜W(xué)合成含有突變堿基寡核甘酸短片段作為引物，啟動(dòng)單鏈DNA分子進(jìn)行復(fù)制，生產(chǎn)出來(lái)新鏈中目的基因特定位點(diǎn)含有已經(jīng)發(fā)生突變堿基序列。第24頁(yè)第24頁(yè)A轉(zhuǎn)化GTAGAATCGCTTCTACTAGGCTAP標(biāo)識(shí)篩選分離突變體第25頁(yè)第25頁(yè)（3）PCR誘變定點(diǎn)誘變法大引物誘變法特點(diǎn)：能夠在DNA區(qū)段任何部位產(chǎn)生定點(diǎn)突變。第26頁(yè)第26頁(yè)原理：在頭兩輪PCR反應(yīng)中，應(yīng)用兩個(gè)互補(bǔ)并在相同部位含有相同堿基突變內(nèi)側(cè)引物，擴(kuò)增形成兩條

7、有一端可彼此重合雙鏈DNA片段，二者在其重合區(qū)段含有一樣突變。故此兩條雙鏈DNA片段經(jīng)變性和退火處理，形成兩種不同形式異源雙鏈分子。然后選取兩個(gè)外測(cè)寡核甘酸引物進(jìn)行第三輪PCR擴(kuò)增，可得到一個(gè)含有突變位點(diǎn)突變體DNA。第27頁(yè)第27頁(yè)第28頁(yè)第28頁(yè)5353靶DNA片段5533混合、變性、退火定點(diǎn)誘變法第29頁(yè)第29頁(yè)5353大引物誘變法5533大引物PCRPCRPCR多次循環(huán)PCR第30頁(yè)第30頁(yè)一理論起源利用基因工程原理能夠在試驗(yàn)室中模擬生物進(jìn)化過(guò)程 化學(xué)進(jìn)化生物進(jìn)化（ii）體外定向進(jìn)化第31頁(yè)第31頁(yè)第32頁(yè)第32頁(yè)第33頁(yè)第33頁(yè) 人為地創(chuàng)造特殊進(jìn)化條件，模擬自然進(jìn)化機(jī)制，在體外對(duì)基因

8、進(jìn)行隨機(jī)突變，從一個(gè)或多個(gè)已經(jīng)存在親本酶（天然或者人為取得）出發(fā)，通過(guò)基因突變和重組，構(gòu)建一個(gè)人工突變酶庫(kù)，通過(guò)一定篩選或選擇辦法最后取得預(yù)先盼望含有一些特性進(jìn)化酶分子進(jìn)化技術(shù)稱(chēng)為體外定向進(jìn)化。體外定向進(jìn)化第34頁(yè)第34頁(yè)定向進(jìn)化示意圖細(xì)菌誘發(fā)突變?cè)?0 0C培養(yǎng)突變體庫(kù)選擇壓力（溫度）溫度耐受型突變體最適生長(zhǎng)溫度為370C最適生長(zhǎng)溫度提升了！隨機(jī)突變+定向選擇目的突變體第35頁(yè)第35頁(yè) Strategies for the development of effective enzymes第36頁(yè)第36頁(yè)定向進(jìn)化屬于蛋白質(zhì)非合理設(shè)計(jì)，它不需要事先理解酶空間結(jié)構(gòu)和催化機(jī)制，人為地創(chuàng)造特殊進(jìn)化條

9、件，模擬自然進(jìn)化機(jī)制（隨機(jī)突變、基因重組和自然選擇），在體外改造酶基因，并定向選擇（或篩選）出所需性質(zhì)突變酶。 第37頁(yè)第37頁(yè)定向進(jìn)化隨機(jī)突變選擇第38頁(yè)第38頁(yè)第39頁(yè)第39頁(yè)第40頁(yè)第40頁(yè)澄清一個(gè)事實(shí)：定向進(jìn)化不是定點(diǎn)突變定向進(jìn)化：突變 篩選 突變位點(diǎn)是隨機(jī)，不擬定； 突變位點(diǎn)數(shù)目也是不擬定； 突變效應(yīng)更是不可預(yù)知； 理論上講，但凡能夠引起突變?cè)颍ㄎ锢?，化學(xué)， 生物）都能夠應(yīng)用于定向進(jìn)化中突變體產(chǎn)生。定點(diǎn)突變： 突變位點(diǎn)是擬定，突變個(gè)數(shù)也是預(yù)知； 突變效應(yīng)也許是已知，也也許是未知； 定點(diǎn)突變辦法普通是以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)。第41頁(yè)第41頁(yè)易錯(cuò)PCR技術(shù)(error-prone PCR)

10、DNA改組(DNA shuflling)：由美國(guó)Stemmer 于1994 年初次提出 一項(xiàng)體外重組技術(shù)隨機(jī)引起重組(RPR) 1998 年,Arnold 提出了一個(gè)有效新辦法交錯(cuò)延伸技術(shù)(StEP)：由Zhao 等 提出, 是一個(gè)簡(jiǎn)化DNA shuffling 技術(shù) 隨機(jī)突變策略第42頁(yè)第42頁(yè)易錯(cuò)PCR易錯(cuò)PCR：是一個(gè)簡(jiǎn)樸、快速、廉價(jià)隨機(jī)突變辦法。原理：利用TaqDNA聚合酶不具備3-5校正功效特點(diǎn)通過(guò)改變PCR條件，通常減少一個(gè)dNTP 量（降至5%-10%）使PCR易于犯錯(cuò)，達(dá)到隨機(jī)突變目的。還能夠加入dITP 來(lái)代替被減少dNTP，又會(huì)使下一輪循環(huán)中出現(xiàn)更多錯(cuò)誤。在PCR 緩沖液中

11、另加入Mn2+，亦有助于提升突變率。第43頁(yè)第43頁(yè)DNA改組DNA改組(DNA shuffling)又稱(chēng)有性PCR (sexual PCR)，原理如圖所表示。第44頁(yè)第44頁(yè)P(yáng)CR擴(kuò)增第45頁(yè)第45頁(yè)體外定向進(jìn)化第46頁(yè)第46頁(yè)成功實(shí)例Lipase genes (lipB52, lipB68) isolated from Pseudomonas fluorescens B52、B68 Genbank Accssion number AY623009、AY694785第47頁(yè)第47頁(yè)成功實(shí)例Zhengbing Jiang, Yitao zheng, Yu Luo, Gang Wang, Hon

12、gping Wang, Yushu Ma and Dongzhi Wei*. Cloning and Expression of a Novel Lipase Gene From Pseudomonas fluorescens B52. Molecular Biotechnology. ( 31), 095-102. SDSanalysis of lipase on expression and purificationfunctional lipase secreted by Recombinants screened with BMMY plates第48頁(yè)第48頁(yè)體外隨機(jī)引起重組 體外隨

13、機(jī)引發(fā)重組(random priming in vitro recombination, RPR)以單鏈DNA為模板，配合一套隨機(jī)序列引物，先產(chǎn)生大量互補(bǔ)于模板不同位點(diǎn)短DNA片段，因?yàn)閴A基錯(cuò)配和錯(cuò)誤引發(fā)，這些短DNA片段中也會(huì)有少許點(diǎn)突變，在隨即PCR反應(yīng)中，它們互為引物進(jìn)行合成，伴隨組合，再組裝成完整基因長(zhǎng)度。第49頁(yè)第49頁(yè)第50頁(yè)第50頁(yè) 交織延伸(stagger extension process, StEP) 在PCR反應(yīng)中把常規(guī)退火和延伸合并為一步, 縮短其反應(yīng)時(shí)間，從而只能合成出非常短新生鏈，經(jīng)變性新生鏈再作為引物與體系內(nèi)同時(shí)存在不同模板退火而繼續(xù)延伸。此過(guò)程重復(fù)進(jìn)行，直到產(chǎn)生

14、完整基因長(zhǎng)度。交錯(cuò)延伸第51頁(yè)第51頁(yè)第52頁(yè)第52頁(yè) 定向進(jìn)化是一個(gè)由構(gòu)建突變體庫(kù)，突變體表示，表示后篩選三個(gè)環(huán)節(jié)構(gòu)成循環(huán)遞進(jìn)過(guò)程，需要： (1) 產(chǎn)生包括大量帶有微量有利突變突變體文庫(kù); (2) 突變體應(yīng)能在適當(dāng)微生物(如大腸桿菌或酵母菌) 體內(nèi)進(jìn)行功效表示; (3) 必須有一個(gè)靈敏篩選辦法,能反應(yīng)出由一個(gè)氨基酸置換而引起預(yù)期性狀較小提升。第53頁(yè)第53頁(yè)環(huán)境庫(kù)和噬菌體展示庫(kù)構(gòu)建 環(huán)境庫(kù)構(gòu)建： （1）采集環(huán)境樣品； （2）提取DNA，連接到適當(dāng)載體上； （3）轉(zhuǎn)入適當(dāng)宿主菌。第54頁(yè)第54頁(yè)噬菌體展示庫(kù)構(gòu)建第55頁(yè)第55頁(yè) 在噬菌體衣殼蛋白基因中插入外源基因，形成融合蛋白表示在噬菌體顆粒蛋

15、白表面，被展示多肽或蛋白質(zhì)可保持相對(duì)獨(dú)立空間結(jié)構(gòu)和生物學(xué)活性。噬菌體展示基本原理：第56頁(yè)第56頁(yè) 利用靶分子，采用適當(dāng)淘洗辦法（親和洗脫擴(kuò)增親和循環(huán)環(huán)節(jié)），洗去非特異結(jié)合噬菌體，最后從噬菌體文庫(kù)中篩選出能結(jié)合靶分子目的噬菌體；外源多肽或蛋白質(zhì)表示在噬菌體表面，而其編碼基因作為病毒基因組中一部分可通過(guò)噬菌體DNA 序列測(cè)序出來(lái)，使得表示蛋白（表現(xiàn)型）和編碼基因（基因型）之間完美地結(jié)合起來(lái)。噬菌體展示庫(kù)構(gòu)建環(huán)節(jié)：第57頁(yè)第57頁(yè)可分為選擇（selection）和篩選（screening）。選擇：經(jīng)過(guò)添加或降低某種成份使目標(biāo)菌株取得生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，而其它菌株生長(zhǎng)受到克制，經(jīng)過(guò)多次篩選分離最終得到目標(biāo)菌株

16、。檢測(cè)：通常是在培養(yǎng)基中加入某種試劑或化學(xué)藥品，使培養(yǎng)后發(fā)生某種能夠區(qū)分改變，如培養(yǎng)基透明度改變或菌落周?chē)伾淖儯纱藚^(qū)分不同類(lèi)型或生理特性不同微生物。（容易實(shí)現(xiàn)高通量篩選）定向進(jìn)化篩選策略第58頁(yè)第58頁(yè)瓊脂板涂布法 在特殊條件下培養(yǎng)突變菌，通過(guò)宿主菌生長(zhǎng)情況、培養(yǎng)基顏色、特定反應(yīng)出現(xiàn)等判斷是否含有目的基因。微孔板懸浮法 在含生色底物平板上培養(yǎng)，挑取含有活性克隆接種到96孔板上檢測(cè)吸光度。使用微流控芯片。微球細(xì)胞固定法 與數(shù)字成像系統(tǒng)結(jié)合，將單個(gè)細(xì)胞附著在單個(gè)固體珠上，突變體進(jìn)行分離和篩選。流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法 細(xì)胞經(jīng)熒光染色后，通過(guò)高速流動(dòng)系統(tǒng)，排成單行，逐一通過(guò)流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀進(jìn)行測(cè)定。突變體

17、分離第59頁(yè)第59頁(yè)通過(guò)酶促反應(yīng)特性加入底物顯色熒光共振能量轉(zhuǎn)移同位素標(biāo)識(shí)底物通過(guò)檢測(cè)底物消耗或產(chǎn)物生成進(jìn)行終點(diǎn)檢測(cè)酶檢測(cè)信號(hào)探測(cè)分光光度計(jì)和熒光酶標(biāo)儀氣相色譜和高效液相色譜質(zhì)譜和核磁第60頁(yè)第60頁(yè)第61頁(yè)第61頁(yè)第62頁(yè)第62頁(yè)第63頁(yè)第63頁(yè)目的酶所需功效辦法結(jié)果實(shí)行菌種卡那霉素核苷基轉(zhuǎn)移酶熱穩(wěn)定性定位誘變+選擇在60-50酶半衰期增長(zhǎng)200倍耐熱脂肪芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶作用于有機(jī)溶劑易錯(cuò)PCR+選擇在60二甲基亞砜主仆女冠活力增強(qiáng)170倍枯草桿菌-內(nèi)酰胺酶作用于新底物DNA改組+選擇對(duì)cefotaxime抗性增長(zhǎng)3倍大腸桿菌對(duì)硝基苯酯酶有機(jī)溶劑中底物特異性和活性易錯(cuò)PCR+重組活力增

18、長(zhǎng)60-150倍大腸桿菌胸苷激酶第五特異性 基因理療交錯(cuò)延伸+選擇活力增長(zhǎng)43倍大腸桿菌-半乳糖苷酶底物特異性DNA改組+選擇活力增長(zhǎng)66倍底物特異性增長(zhǎng)1000倍大腸桿菌砷酸脫毒路徑砷酸抗性DNA改組+選擇抗性增長(zhǎng)12倍大腸桿菌定向進(jìn)化應(yīng)用第64頁(yè)第64頁(yè)3. 雜合酶 雜合酶是把來(lái)自不同酶分子中結(jié)構(gòu)單元或是整個(gè)酶分子進(jìn)行組合和互換，以產(chǎn)生目標(biāo)所需優(yōu)化酶雜合體。 第65頁(yè)第65頁(yè)雜合酶構(gòu)建策略：（1）二級(jí)結(jié)構(gòu)互換；（2）功效域替換；（3）融合蛋白。第66頁(yè)第66頁(yè)雜合酶制備辦法：（1）同源掃描突變；（2）反-內(nèi)蛋白子應(yīng)用；（3）DNA增長(zhǎng)截短法；（4）同源基因改組SCRATCHY庫(kù)。第67頁(yè)第67頁(yè) 同源掃描突變：幾個(gè)同源酶PCR擴(kuò)增，然后用內(nèi)切核酸酶切割，不同切割產(chǎn)物混合組合，Taq聚合酶擴(kuò)增，含有幾個(gè)同源蛋白質(zhì)基因片段組成新基因，即為雜合基因，進(jìn)而克隆與表示，產(chǎn)生雜合酶。 第68頁(yè)第68頁(yè) 反-內(nèi)蛋白子應(yīng)用：反-內(nèi)蛋白子能夠融合任何兩個(gè)多肽，適合產(chǎn)生雜合酶。 第69頁(yè)第69頁(yè) D